Summary
Her præsenterer vi en protokol til at optage telemetric electroencephalograms (Roengten) fra frit flytte smågrise direkte i svinesti uden brug af en beroligende, gør det muligt at optage typiske EEG mønstre under ikke - REM søvn, ligesom spindel brister.
Abstract
Metoden giver mulighed for optagelse af høj kvalitet electroencephalograms (Roengten) fra frit flytte smågrise direkte i en svinesti. Vi bruger en én-kanal telemetric electroencefalografi system i kombination med standard selvklæbende hydrogel elektroder. For smågrise er stilnet ned uden brug af beroligende midler. Efter deres overgang til en svinesti, pattegrisene opfører sig normalt — de drikke og sove i samme cyklus som deres søskende. Deres søvnfaser bruges til EEG optagelser.
Introduction
Smågrise er en spirende modelsystem for neurovidenskab1. For at styrke Translationel forskning, opfandt vi en metode til at registrere ikke-invasiv, klinisk Roengten fra uhæmmet smågrise2 (figur 1 og figur 2). To forudsætninger for en translationel brug af EEG optagelser, om EEG mønstre tilknyttet kortikale modning, er en non-invasiv metode, sammenlignelige til de kliniske omgivelser og afholdenhed af beroligende midler eller anæstesi. One-kanal telemetry system3 i kombination med selvklæbende elektroder kan fastsættes i ca 5 min. bagefter, smågrise vil inddrive hurtigt fra proceduren for håndtering og synkronisere deres fodring og sove adfærd til den andens smågrise og soen.
Selv om der allerede er forsøg på at bruge ikke-invasive EEG optagelser fra bedøvet dyr4, udføres de fleste electroencefalografi undersøgelser fra dyr med invasive metoder. Disse metoder har bivirkninger vedrørende inflammatoriske processer omkring implanterede elektroder5,6 , og i de fleste tilfælde, de kræver en social adskillelse af dyr på grund af de eksterne komponenter af den implanterede EEG system. Derfor er oversættelsen af disse data til den kliniske kontekst vanskeligt. Behovet for Translationel tilgange bliver klart af det faktum, at det ikke er stadig kendt hvor en "normal" hjernens modning under den tidlige kortikale udvikling er repræsenteret ved kliniske, ikke-invasiv electroencefalografi7. Denne videnskløft er forårsaget af tekniske udfordringer forbundet med EEG optagelser fra præmature spædbørn8. I dyremodel systemer er mønstre af tidlige kortikale udvikling bedre tilgængelige, da de fleste dyr er født med en "præmature hjerne" i forhold til menneskelig kortikale udvikling9. Udover bevarede mønstre af kortikale udvikling på tværs af arter2, har det for nylig vist sig at EEG optagelser fra præmature spædbørn også kan forudsige individuelle kliniske resultatet under senere liv10,11. Metoden beskrevet her er navnlig nyttig nemlig de translationel aspekter af udviklingsmæssige neurovidenskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af det lokale etiske udvalg (#23177-07/G10-1-010/G 15-15-011) og fulgte europæiske og de tyske nationale bestemmelser (Europæiske Fællesskabers Rådets direktiv 86/609/EØF; Tierschutzgesetz).
Alle dyr procedurer blev udført i overensstemmelse med Medical Center af Johannes Gutenberg-Universität Mainz dyrs pleje udvalgets forordninger.
1. opsætning
- Før forsøget, kontrollere for enhver støj og finde en passende placering for set-up og af antenne. Støj er synlig som en 60 eller 50 Hz sinusbølge.
Bemærk: Placeringen af antennen og især afstanden mellem senderen og modtageren afhænger transmissionen styrken af systemet. Systemet bruges her er justerbar. Det blev justeret til et relativt lavt strømforbrug, med en ca. 3 m transmission rækkevidde. Derudover kan de metalliske hegn i en svinesti dæmpe signalet og forårsage interferens. I dette tilfælde er det nødvendigt at placere antennen inde i metal buret. - Bruge et kabel tromle til at levere set-up med linje magt. Tilslutte den bærbare computer, modtager enheden og analog til digital konverter (hvis nødvendigt) til specifikke telemetry system, som bliver brugt.
Bemærk: Telemetri systemet bruges her sendt digitale data til modtageren. Dette kan være anderledes for andre systemer. - Placer elektroderne, lim, Q-tips, og klude samt blanding blokke på en separat tabel.
- Forberede elektroder med korte kabler. At gøre det, skære elektroderne og lodde dem igen med en længde så kort som muligt, afhængigt af dyrets størrelse. Kablerne skal være lang nok til at forbinde de ønskede optagelse positioner på hovedet med den telemetric EEG enhed, videregive oplysningerne. Kabler, der er for lange skal veg og dækket med hud klæbende silikoneelastomer. Længere kabler, der skal være veg gøre silikone patch større og tungere.
2. Grisling
- Fange en gris ved at snuppe det på benet eller på brystkassen. Hold det og blive bekendt med afføring eller vandladning.
- Hvis det er nødvendigt, markere Grisling med et nummer.
- Wrap smågrise i et håndklæde. Grisling bliver roligt ned. Vær opmærksom på overophedning af smågrise.
- Holde smågrise med den ene hånd på kroppen eller underarm. Bruge anden hånden til at holde snuden. Være opmærksom på overophedning af smågrise og sørg for, at det er gratis at trække vejret ordentligt.
3. elektroder
- Har en anden person fastgøre elektroderne.
- Ren hud fra snavs med vand eller ethanol. Hvis det er nødvendigt, barbere hovedet.
- Fjern alle døde hudceller med en slibende EEG gel og en Q-tip. Fjerne den slibende gel bagefter. Alternativt kan du bruge sandpapir.
- Fastsætte de selvklæbende elektroder til den ønskede placering. Placer jorden elektrode over lillehjernen (mellem ørerne) og referenceelektrode på næsen. Placere optagelse elektrode på den ønskede placering.
Bemærk: I dette tilfælde en unipolær optagelse blev udført, fordi henvisningen blev placeret på en neutral position (næsen). Der er ingen standardiseret systemet tilgængelige for smågrise indtil nu. Her, blev parietal optagelse stilling brugt (mellem øjet og øret) på den højre hjernehalvdel halvkugle. - Forbind kablerne til telemetri enhed. Tænd enheden. Afhængigt af telemetri systemet anvendes, kan dette være en magnetisk switch eller en radiofrekvens wake-up signal.
- Dække telemetri enhed og alle kabler samt alle elektroder med to-komponent hud klæbende silikonegummi (Se Tabel af materialer). Ved at blande lige store mængder af begge komponenter, den hærdetid vil være i størrelsesordenen 1 min. øjne og øjenvipper bør ikke være dækket med gummi.
- Vent, indtil silikonegummi er helt helbredt.
- Sted Grisling tilbage i en svinesti.
- Observere Grisling at se, om det viser tegn på ubehag over en længere periode (flere minutter).
4. måling
- Vent indtil Grisling er kommet sig og begynder at synkronisere sin adfærd som sine søskende (fodring, lege, sove), normalt efter 30 s (figur 1).
- Vente på søvnfaser, hvis det ønskes. Optagetiden afhænger af den specifikke videnskabelige spørgsmål. Her, blev 10 min indspilningerne brugt.
- Hvis telemetri enhed er dækket af mere end 2 andre smågrise, kan signalet være for lav til modtageren. Skub forsigtigt pattegrisene væk hvis de sover på toppen. Være opmærksom på soen; Det kan reagere aggressivt.
- Starte optagelsen med data erhvervelse software (Se Tabel af materialer).
5. Afslut
- Efter optagelse (som regel flere timer), fange Grisling igen som er blevet beskrevet i trin 2. Være opmærksom på soen; Det kan reagere aggressivt.
- Forsigtigt løfte silikonegummi på kanten. Fjern derefter den hele patch af silikonegummi der indeholder elektroder og telemetri enhed. Vær forsigtig med Grislings øjne.
- Sted Grisling tilbage i en svinesti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi var i stand til at optage typiske EEG mønstre forbundet med ikke - REM søvn, ligesom spindel brister eller delta pensler, fra frit flytte smågrise (figur 1 og figur 2). Vi var for det meste interesseret i repræsentativt patterns under ikke - REM søvn, men faser af REM-lignende søvn12 med en meget lav amplitude er også blevet indspillet (figur 3). Fysiologi og mængden af REM-søvn er forskellige på tværs af arter13. Kort REM faser i rækken af et par minutter er typiske for svin14. God optagekvaliteten var også tilgængelige under fodring (amning) (figur 4). Hvad angår spiller adfærd, fører stærk muskel aktivitet til muskel artefakter; dog er filtre designet til at udtrække EEG bands. Mulige analytiske redskaber er yderligere beregninger af spektral effekttæthed eller analytiske redskaber med fokus på netværksaktivitet, som eksempelvis fase-amplitude kobling. Disse analytiske redskaber kan også bruges med single-channel EEG optagelser.
Figur 1: en sovende gris med telemetric EEG systemet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: typiske EEG mønstre registreres under søvn fase af en frit bevægende Grisling, hvile ved siden af sine søskende. Fire events er fremhævet af bokse. Fra venstre mod højre viser den første boks typiske mønstre fremkaldes ved muskel aktivitet; for eksempel, korte ryk under søvn, kendetegnet ved høje mængder af hurtig gamma aktivitet (over 80 Hz) og en burst-lignende udseende. Den anden boks viser en delta børste-agtig episode, karakteriseret ved delta aktivitet med overlejrede aktivitet i området theta og alpha. Den tredje og fjerde kasser Vis korte episoder af gamma byger (søvn spindel-lignende begivenheder), kendetegnet ved frekvens komponenter i alpha, beta og gamma båndene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: REM faser under søvn. Først og den anden boks Vis sen-bølge søvnfaser. Den tredje boks angiver en lav-amplitude EEG fase af ca 20 s i varighed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: 10 min EEG optagelse spor af en drikke Grisling (amning). Lavpunktet efter 100 s skyldes en kort tab af radiokommunikation mellem senderen og modtageren af EEG optagelse system. Bagefter, er der nogle muskel eller bevægelse artefakter. Muskel artefakter er karakteriseret ved meget høje delta band amplituder. Derimod er EEG aktivitet kendetegnet ved en gradvis nedgang af amplitude strøm fra langsom til hurtig bølger (se, for eksempel mellem 200 og 250 s). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk trin i protokollen er tilstrækkelig hudkontakt med elektroderne, især jorden elektrode, at opnå stabile optagelser med lav støj. Desuden, da smågrise er meget adræt, det er vigtigt at dække hele systemet med silikonegummi til beskyttelse af elektroderne og telemetri enhed. Desuden, hvis eksperimenterne er udført i en stabil med en spaltegulve gulvet, være forsigtige med små enheder eller stik.
I tilfælde af en utilstrækkelig greb af selvklæbende hydrogel elektroder, forsøge at fjerne den slibende creme så meget som muligt. En alternativ måde at fjerne de yderste døde hudceller lag bruger sandpapir. En forbehandling med alkohol er ikke obligatorisk. Beskidt hud kan også rengøres med vand. Brug ikke gips strimler i stedet for kroppen dobbelt silikone for at fastsætte det telemetric system. Gips strimler kan forårsage hudirritation og massive tegn på ubehag. Smågrise slippe af system meget hurtigt i denne sag.
En begrænsning af metoden er stabiliteten af hydrogel elektroder. De kan tørre efter et par timer, hvilket resulterer i et tab af indspilningskvalitet. Desuden, som med alle EEG-teknikker, stærke bevægelser er normalt forbundet med muskel artefakter på optagelse spor (som det ses i figur 4). Derudover er en god placering af antennen vigtigt at reducere artefakter, der kan følge af en dårlig modtager signal. Metal hegn kan også forårsage høj frekvens interferens, hvilket resulterer i tab af data sekvenser. En løsning på problemet er at placere antennen inde metal hegnet i en optimal position. Den optimale position af antennen kan kun evalueres i feltet ved trial and error. Soen og de andre smågrise fører ikke til artefakter, fordi pattegrisene iført systemet normalt ikke tillader andre smågrise til at manipulere deres hoved. Dette kan være anderledes for andre arter.
Metoden er især væsentlig for Translationel tilgange i neurovidenskab. Med denne teknik er det muligt at bruge ikke-invasive optagelser uden sedation. De resulterende EEG optagelser er meget lig de kliniske omgivelser. Teknikken kan åbne op for nye muligheder til at karakterisere præmature EEG modning ved dyremodel systemer. Ud over at, kan mange neurovidenskabelige spørgsmål, især vedrørende kortikale felt potentialer, også blive undersøgt af denne noninvasiv teknik. Derfor, metoden har potentiale til at reducere antallet og alvorligheden af dyreforsøg inden for neuroscience.
For fremtiden, er optagelser med mere end én elektrode planlagt. En forudsætning er miniaturisering af elektroderne. Desuden er den langsigtede stabilitet af elektroderne et problem for fremtidige fornyelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Helmut Scheu for mulighed for at gennemføre vores forskning i svinesti på Hofgut Neumühle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable adhesive surface silver/silver chloride electrodes |
Spes Medica S.r.l., Genova, Italy |
Self adhesive hydrogel electrode | |
| Abralyt HiCl | Easycap GmbH | Abrasive cream | |
| Body Double fast | Smooth On Inc. | Skin adhesive silicone | |
| Telemetry system | Internal development | ||
| Picolog 1216 | Pico Technology | AD converter | |
| Laptop | Panasonic | Rugged laptop | |
| Receiver | Internal development |
References
- Conrad, M. S., Sutton, B. P., Dilger, R. N., Johnson, R. W. An in vivo three-dimensional magnetic resonance imaging-based averaged brain collection of the neonatal piglet (Sus scrofa). PLoS ONE. 9 (9), e107650 (2014).
- de Camp, N. V., Hense, F., Lecher, B., Scheu, H., Bergeler, J. Models for preterm cortical development using non invasive clinical EEG. Translational Neuroscience. 8, 211-224 (2017).
- Lapray, D., Bergeler, J., Dupont, E., Thews, O., Luhmann, H. J. A novel telemetric system for recording brain activity in small animals. Telemetry: Research, Technology and Applications. Barculo, D., Daniels, J. , Nova Science Publishers. 195-203 (2009).
- Kim, D., Yeon, C., Kim, K. Development and experimental validation of a dry non- invasive multi-channel mouse scalp EEG sensor through visual evoked potential recordings. Sensors. 17, 326 (2017).
- Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
- Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10, 066014 (2013).
- Hellström-Westas, L., Rosén, I. Electroencephalography and brain damage in preterm infants. Early Human Development. 81, 255-261 (2005).
- Lloyd, R. O., Goulding, R. M., Filan, P. M., Boylan, G. B. Overcoming the practical challenges of electroencephalography for very preterm infants in the neonatal intensive care unit. Acta Paediatrica. , 152-157 (2015).
- Clancy, B., Finlay, B. L., Darlington, R. B., Anand, K. J. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28, 931-937 (2007).
- Iyer, K. K., et al. Cortical burst dynamics predict clinical outcome early in extremely preterm infants. Brain. 138, 2206-2218 (2015).
- Luhmann, H., de Camp, N., Bergeler, J. Monitoring brain activity in preterms: mathematics helps to predict clinical outcome. Brain. 138, 2114-2125 (2015).
- Dragomir, A., Akay, Y., Curran, A. K., Akay, M. Complexity measures of the central respiratory networks during wakefulness and sleep. Journal of Neural Engineering. 5, 254-261 (2008).
- Peever, J., Fuller, P. M. The biology of REM sleep. Current Biology. 27, R1237-R1248 (2017).
- Robert, S., Dallaire, A. Polygraphic Analysis of the sleep-wake states and the REM Sleep periodicity in domesticated pigs (Sus scrofa). Physiology & Behavior. 37 (2), 289-293 (1986).
