Summary
Aquí, presentamos un protocolo de registro telemétricos electroencefalogramas (EEGs) de libremente mover lechones directamente en el chiquero sin el uso de un sedante, lo que es posible grabar patrones EEG típicos durante no sueño del REM, como huso estalla.
Abstract
El método permite la grabación de alta calidad los electroencefalogramas (EEGs) de libremente mover lechones directamente en el chiquero. Utilizamos un sistema de electroencefalografía telemétrica de un canal en combinación con electrodos estándar hidrogel auto-adhesivo. Los lechones se calmaron abajo sin el uso de sedantes. Después de su lanzamiento en la pocilga, los lechones se comportan normalmente, beber y dormir en el mismo ciclo como sus hermanos. Sus fases de sueño se utilizan para las grabaciones de EEG.
Introduction
Lechones son un modelo emergente para Neurociencia1. Con el fin de fortalecer la investigación traslacional, hemos inventado un método para registrar el EEG no invasivo, clínica de lechones libre2 (figura 1 y figura 2). Son los dos requisitos para una utilización traslacional de las grabaciones de EEG, con respecto a patrones de EEG asociados con la maduración cortical, una metodología no invasiva, comparable a la clínica y la abstinencia de sedantes o anestesia. El sistema de telemetría de un canal3 en combinación con electrodos autoadhesivos pueden fijarse en unos 5 minutos después, los lechones se recuperan rápidamente del procedimiento manejo y sincronizar su alimentación y para dormir el comportamiento de la otra lechones y la cerda.
Aunque ya hay intentos de utilizar las grabaciones de EEG no invasivo de animales sedados4, estudios de electroencefalograma (EEG) la mayoría de los animales se llevan a cabo con métodos invasivos. Estos métodos tienen efectos secundarios en relación con procesos inflamatorios alrededor de los electrodos implantados5,6 y en la mayoría de los casos, requiere una separación social de los animales debido a los componentes externos del sistema implantado de EEG. Por lo tanto, la traducción de estos datos en el contexto clínico es difícil. La necesidad de enfoques traslacionales se está convirtiendo en claro por el hecho de que todavía no se sabe cómo una maduración cerebral "normal" durante el desarrollo cortical temprano está representada por electroencefalografía clínica, invasiva7. Esta brecha de conocimiento es causada por problemas técnicos asociados con las grabaciones de EEG de recién nacidos prematuros bebés8. En sistemas modelo animales, patrones de desarrollo cortical temprana mejor son accesibles, ya que la mayoría de los animales nacen con un cerebro"prematuro" en comparación con el desarrollo cortical humano9. Además conservados patrones de desarrollo cortical a través de la especie2, recientemente se ha demostrado que las grabaciones de EEG de recién nacidos prematuros también pueden predecir el resultado clínico individual durante más de10,de vida11. El método descrito aquí es especialmente útil para los aspectos traslacionales de la neurociencia del desarrollo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética local (#23177-07/G10-1-010/G 15-15-011) y seguido de la Unión Europea y el Reglamento nacional alemán (europeo comunidades Consejo Directiva 86/609/ECC; Tierschutzgesetz).
Animales todos los procedimientos fueron realizados según el centro médico del Reglamento del Comité de cuidado de los animales de Johannes Gutenberg University Mainz.
1. configuración
- Antes del experimento, verifique cualquier ruido en la línea y encontrar un lugar adecuado para la instalación y la antena. Ruido en la línea es visible como una onda de seno de 60 o 50 Hz.
Nota: La colocación de la antena y sobre todo la distancia entre el transmisor y el receptor depende de la fuerza de transmisión del sistema. El sistema usado aquí es ajustable. Se ajustó a una potencia relativamente baja, con un rango de transmisión aproximadamente 3 m. Además, las vallas metálicas en el chiquero pueden atenuar la señal e interferencias. En este caso, es necesario colocar la antena dentro de la jaula del metal. - Usar un tambor de cable para suministrar la instalación con energía de la línea. Conecte la computadora portátil, la unidad receptora y el convertidor de analógico a digital (si es necesario) para el sistema de telemetría específico que está siendo utilizado.
Nota: El sistema de telemetría aquí envía datos digitales en el receptor. Esto puede ser diferente para otros sistemas. - Coloque los electrodos, los adhesivos, los Q-tips y las toallitas, así como los bloques de mezcla, en una tabla separada.
- Preparar los electrodos con cables cortos. Para ello, los electrodos de corte y soldarlos de nuevo con una longitud lo más corta posible, dependiendo del tamaño del animal. Los cables deben ser lo suficientemente largos para conectar las posiciones de grabación deseado en la cabeza con la unidad de EEG telemetría, transmisión de los datos. Cables demasiado largos retrocedieron y cubiertos con elastómero de silicona adhesivo de la piel. Cables más largos que deben retrocedió hacen el parche de silicona más grande y más pesado.
2. el cochinillo
- Coger un cerdito agarrando la pierna o en el tórax. Mantenerlo y ser consciente de la defecación o micción.
- Si es necesario, marcar el cochinillo con un número.
- Envuelva el cochinillo en una toalla. El cochinillo se calmará. Ser conscientes de sobrecalentamiento el cochinillo.
- Sujete al lechón con una mano en el cuerpo o el antebrazo. Use la otra mano para sostener el hocico. Ser conscientes de sobrecalentamiento el cochinillo y asegúrese de que esté libre de respirar correctamente.
3. electrodos
- Tienen una segunda persona fije los electrodos.
- Limpiar la piel de la suciedad con agua o etanol. Si es necesario afeitarse la cabeza.
- Retire cualquier células muertas de la piel con un gel abrasivo de EEG y un q-Tip. Retirar el gel abrasivo después. Como alternativa, utilice papel de lija.
- Fije los electrodos autoadhesivos en la ubicación deseada. Coloque el electrodo de tierra por encima del cerebelo (entre las orejas) y el electrodo de referencia en la nariz. Coloque el electrodo de registro en la ubicación deseada.
Nota: en este caso, un registro unipolar fue realizado, porque la referencia se colocó en una posición neutral (nariz). No se dispone de ningún sistema estandarizado para lechones hasta ahora. Aquí, una posición de grabación parietal fue utilizada (entre el ojo y el oído) en el hemisferio derecho del cerebro. - Conecte los cables a la unidad de telemetría. Encienda la unidad. Según el sistema de telemetría, esto puede ser un interruptor magnético o una señal de frecuencia de radio despertador.
- Cubra la unidad de telemetría y todos los cables de electrodos, así como todo con goma de silicona adhesivo de dos componentes de la piel (véase Tabla de materiales). Al mezclar cantidades iguales de ambos componentes, el tiempo de curado será en el rango de 1 minuto de ojos y las pestañas no deben estar cubiertas por el caucho.
- Espere hasta que el caucho de silicón se cura completamente.
- Vuelva a colocar el lechón en la pocilga.
- Observar el cochinillo para ver si está mostrando signos de malestar durante un largo periodo de tiempo (varios minutos).
4. la medida
- Espere hasta que el cochinillo se ha recuperado y empieza a sincronizar su comportamiento con el de sus hermanos (alimentación, jugando, durmiendo), generalmente después de 30 s (figura 1).
- Espere a que las fases de sueño, si lo desea. El tiempo de grabación depende de la pregunta científica específica. Aquí, se utilizaron las sesiones de grabación de 10 minutos.
- Si la unidad de telemetría está cubierta por más de 2 otros lechones, la señal puede ser demasiado baja para el receptor. Empuje suavemente hacia los lechones, si duermen en la parte superior. Ser conscientes de la cerda; puede reaccionar agresivamente.
- Iniciar la grabación con el software de adquisición de datos (véase Tabla de materiales).
5. final
- Después de la grabación (generalmente varias horas), coger el cochinillo otra vez como se ha descrito en el paso 2. Ser conscientes de la cerda; puede reaccionar agresivamente.
- Suavemente, levante el caucho de silicón de un canto. Luego, retire el parche entero del caucho de silicón que contiene los electrodos y la unidad de telemetría. Tenga cuidado con los ojos del lechón.
- Vuelva a colocar el lechón en la pocilga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pudimos grabar típicos patrones de EEG asociados con no sueño del REM, como ráfagas de huso o cepillos delta, mueva libremente lechones (figura 1 y figura 2). Principalmente estábamos interesados en patrones representativos durante no sueño del REM, pero las fases de sueño REM como12 con una amplitud muy baja también han sido registrados (figura 3). La fisiología y la cantidad de sueño REM difieren entre especies13. Corta fases REM en el rango de unos pocos minutos son típicas para cerdos14. Calidad de grabación buena estaba también disponible durante la alimentación (lactancia) (figura 4). En cuanto a reproducción de comportamiento, actividad muscular fuerte conduce a artefactos musculares; sin embargo, los filtros han sido diseñados para extraer bandas de EEG. Otras posibles herramientas analíticas son cálculos de densidad espectral de potencia o herramientas analíticas, centrándose en la actividad de red, como, por ejemplo, acoplamiento de fase amplitud. Estas herramientas analíticas pueden utilizarse también con grabaciones de EEG de un canal.
Figura 1: un cerdito para dormir con el sistema EEG telemétrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: patrones EEG típico registran durante la fase del sueño de un lechón libremente móvil, descansando al lado de sus hermanos. Cuatro eventos se destacan por las cajas. De izquierda a derecha, el primer cuadro muestra patrones típicos provocados por la actividad del músculo; por ejemplo, cortos espasmos durante el sueño, caracterizado por altas cantidades de actividad gamma rápida (por encima de 80 Hz) y un ráfaga-como aspecto. El segundo cuadro muestra un episodio de cepillo delta, caracterizado por la actividad de la delta con superpuestas en el rango theta y alfa. Los cuadros de tercera y cuarta muestran episodios cortos de explosiones gamma (sueño del huso-como eventos), caracterizados por los componentes de frecuencia en las bandas alfa, beta y gamma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: fases de REM durante el sueño. El primero y el segundo cuadro muestran las fases de sueño lento. El tercer cuadro indica una fase de EEG de baja amplitud de aproximadamente 20 s de duración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: un rastro de grabación de 10 minutos EEG de un cerdito bebe (lactancia). El canal 100, después de s es debido a una pérdida breve de la comunicación de radio entre el transmisor y el receptor del sistema de grabación de EEG. Después, hay algunos artefactos musculares o movimiento. Artefactos musculares se caracterizan por la amplitud de banda muy alto delta. En cambio, la actividad EEG se caracteriza por una disminución gradual de la energía de la amplitud de lento a rápido ondas (véase, por ejemplo, entre 200 y 250 s). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Un paso crítico en el protocolo es el adecuado contacto con los electrodos, especialmente el electrodo de tierra, para lograr grabaciones estables con de poco ruido. Además, ya que los lechones son muy ágiles, es importante cubrir todo el sistema con caucho de silicona para proteger los electrodos y la unidad de telemetría. Además, si los experimentos se llevan a cabo en un establo con suelo de rejilla, ser cauteloso con los pequeños dispositivos o conectores.
En el caso de un agarre deficiente de los electrodos autoadhesivos hidrogel, intente quitar la crema abrasiva tanto como sea posible. Una manera alternativa para eliminar la capa externa de piel muerta está utilizando papel de lija. Un tratamiento previo con el alcohol no es obligatorio. Piel sucia también se puede limpiar con agua. No use las tiras de yeso en vez de silicona doble cuerpo para arreglar el sistema telemétrico. Tiras de yeso pueden causar irritación de la piel y grandes signos de malestar. Cochinillos de deshacerse del sistema muy rápido en ese caso.
Una limitación del método es la estabilidad de los electrodos de hidrogel. Se puede secar después de unas horas, resultando en una pérdida de calidad de grabación. Además, como con todas las técnicas de EEG, movimientos fuertes generalmente están asociados con artefactos musculares en el rastro de la grabación (como se ve en la figura 4). Además, una buena colocación de la antena es importante para reducir artefactos que puedan resultar de una señal del receptor pobre. Vallas metálicas también pueden causar interferencias de alta frecuencia, resultando en una pérdida de secuencias de datos. Una solución para este problema es colocar la antena dentro de la cerca metálica en una posición óptima. La posición óptima de la antena puede ser evaluada sólo en el campo por ensayo y error. La cerda y los lechones otros no conducen a los artefactos, debido a los lechones con el sistema generalmente no permiten otros lechones manipular la cabeza. Esto puede ser diferente para otras especies.
El método es especialmente importante para enfoques traslacionales en Neurociencia. Con esta técnica, es posible utilizar grabaciones no invasiva sin sedación. Las grabaciones de EEG resultantes son muy similares en el ajuste clínico. La técnica podría abrir nuevas posibilidades para caracterizar la maduración prematura de EEG mediante sistemas de modelo animal. Más allá de eso, muchas cuestiones neurocientíficas, especialmente con respecto a los potenciales de campo cortical, también pueden ser examinadas por esta técnica no invasiva. Por lo tanto, el método tiene el potencial para reducir el número y la gravedad de los experimentos con animales en el campo de la neurociencia.
Para el futuro, se planean grabaciones con más de un electrodo. Un prerrequisito es la miniaturización de los electrodos. Además, la estabilidad a largo plazo de los electrodos es un tema para futuras innovaciones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Helmut Scheu por la oportunidad de llevar a cabo nuestra investigación en el chiquero en el Hofgut Neumühle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable adhesive surface silver/silver chloride electrodes |
Spes Medica S.r.l., Genova, Italy |
Self adhesive hydrogel electrode | |
| Abralyt HiCl | Easycap GmbH | Abrasive cream | |
| Body Double fast | Smooth On Inc. | Skin adhesive silicone | |
| Telemetry system | Internal development | ||
| Picolog 1216 | Pico Technology | AD converter | |
| Laptop | Panasonic | Rugged laptop | |
| Receiver | Internal development |
References
- Conrad, M. S., Sutton, B. P., Dilger, R. N., Johnson, R. W. An in vivo three-dimensional magnetic resonance imaging-based averaged brain collection of the neonatal piglet (Sus scrofa). PLoS ONE. 9 (9), e107650 (2014).
- de Camp, N. V., Hense, F., Lecher, B., Scheu, H., Bergeler, J. Models for preterm cortical development using non invasive clinical EEG. Translational Neuroscience. 8, 211-224 (2017).
- Lapray, D., Bergeler, J., Dupont, E., Thews, O., Luhmann, H. J. A novel telemetric system for recording brain activity in small animals. Telemetry: Research, Technology and Applications. Barculo, D., Daniels, J. , Nova Science Publishers. 195-203 (2009).
- Kim, D., Yeon, C., Kim, K. Development and experimental validation of a dry non- invasive multi-channel mouse scalp EEG sensor through visual evoked potential recordings. Sensors. 17, 326 (2017).
- Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
- Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10, 066014 (2013).
- Hellström-Westas, L., Rosén, I. Electroencephalography and brain damage in preterm infants. Early Human Development. 81, 255-261 (2005).
- Lloyd, R. O., Goulding, R. M., Filan, P. M., Boylan, G. B. Overcoming the practical challenges of electroencephalography for very preterm infants in the neonatal intensive care unit. Acta Paediatrica. , 152-157 (2015).
- Clancy, B., Finlay, B. L., Darlington, R. B., Anand, K. J. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28, 931-937 (2007).
- Iyer, K. K., et al. Cortical burst dynamics predict clinical outcome early in extremely preterm infants. Brain. 138, 2206-2218 (2015).
- Luhmann, H., de Camp, N., Bergeler, J. Monitoring brain activity in preterms: mathematics helps to predict clinical outcome. Brain. 138, 2114-2125 (2015).
- Dragomir, A., Akay, Y., Curran, A. K., Akay, M. Complexity measures of the central respiratory networks during wakefulness and sleep. Journal of Neural Engineering. 5, 254-261 (2008).
- Peever, J., Fuller, P. M. The biology of REM sleep. Current Biology. 27, R1237-R1248 (2017).
- Robert, S., Dallaire, A. Polygraphic Analysis of the sleep-wake states and the REM Sleep periodicity in domesticated pigs (Sus scrofa). Physiology & Behavior. 37 (2), 289-293 (1986).
