Summary
Hier presenteren we een protocol aan record telemetrische electroencephalograms (hersenfotos) van de vrij bewegende biggen rechtstreeks in het varkenshok zonder het gebruik van een kalmerend middel, waardoor het mogelijk is graag typische EEG patronen tijdens non - REM-slaap, zoals spindel barst.
Abstract
De methode staat de opname van kwalitatief hoogwaardige electroencephalograms (hersenfotos) vrij bewegen biggen rechtstreeks in het varkenshok. We gebruiken een één-kanaals telemetrische elektro-encefalografie systeem in combinatie met standaard zelfklevende hydrogel elektroden. De biggen zijn kalmeerde omlaag zonder het gebruik van sedativa. Na hun introductie in het varkenshok, gedragen de biggen normaal — ze drinken en slapen in de dezelfde cyclus als hun broers en zussen. Hun slaap-fasen worden gebruikt voor de opnames van de EEG.
Introduction
Biggen zijn een opkomende modelsysteem voor Neurowetenschappen1. We uitgevonden om te versterken translationeel onderzoek, een methode voor het opnemen van niet-invasieve, klinische hersenfotos van ongeremde biggen2 (Figuur 1 en Figuur 2). Twee voorwaarden voor een translationeel gebruik van opnames van de EEG, met betrekking tot de EEG patronen gekoppeld corticale rijping, zijn een niet-invasieve methode, vergelijkbaar met de klinische setting, en de onthouding van sedativa of verdoving. De één-kanaals telemetrie systeem3 in combinatie met de zelfklevende elektroden kan worden opgelost in ongeveer 5 min. daarna, de biggen zal snel herstellen van de behandeling procedure en synchroniseren van hun voeding en gedrag met die van de andere slapen biggen en de zeug.
Hoewel er al pogingen om te gebruiken niet-invasieve EEG opnames van ingetogen dieren4, worden meeste elektro-encefalografie studies van dieren uitgevoerd met invasieve benaderingen. Deze methoden hebben bijwerkingen met betrekking tot de inflammatoire processen rond de geïmplanteerde elektroden5,6 , en in de meeste gevallen vereisen ze een sociale scheiding van de dieren als gevolg van de externe onderdelen van de geïmplanteerde EEG-systeem. Vandaar is de vertaling van deze gegevens aan de klinische context moeilijk. De noodzaak voor translationeel benaderingen wordt duidelijk door het feit dat het is nog niet bekend hoe een rijping van de "normale" brein tijdens de vroege ontwikkeling van de corticale wordt vertegenwoordigd door klinische, niet-invasieve elektro-encefalografie7. Deze kenniskloof wordt veroorzaakt door technische uitdagingen in verband met EEG opnames van vroeggeboorte baby's van8. In diermodel systemen zijn patronen van de vroege ontwikkeling van de corticale beter toegankelijk, aangezien de meeste dieren worden geboren met een "premature hersenen" in vergelijking met de ontwikkeling van menselijk corticale9. Naast geconserveerde patronen van corticale ontwikkelingsniveaus van soorten2, is onlangs gebleken dat EEG opnames van premature baby's ook de individuele klinische uitkomst tijdens latere leven10,11 voorspellen kunnen. De hier beschreven methode is vooral handig voor het translationeel aspecten van ontwikkelingsstoornissen neurowetenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (#23177-07/G10-1-010/G 15-15-011) en volgde de Europese en de Duitse nationale regelgevingen (Europese Gemeenschappen richtlijn 86/609/EEG; Tierschutzgesetz).
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd overeenkomstig het medisch centrum van de Johannes Gutenberg-Universiteit Mainz dierenverzorgers het Reglement.
1. setup
- Voorafgaand aan het experiment, controleren op eventuele ruis op de lijn en zoekt u een passende locatie voor de opzet en de antenne. Ruis op de lijn is zichtbaar als een sinusgolf 60 of 50 Hz.
Opmerking: De plaatsing van de antenne en met name de afstand tussen de zender en de ontvanger is afhankelijk van de sterkte van de transmissie van het systeem. Het systeem gebruikt hier is verstelbaar. Het werd aangepast aan een relatief laag vermogen, met een ongeveer 3 m-zendbereik. Bovendien kunnen de metalen hekken in het varkenshok temperen het signaal en storingen veroorzaken. In dit geval is het nodig om de plaats van de antenne in de metalen kooi. - U gebruikt een kabel trommel om de set-up met lijn kracht. Sluit de laptop, de ontvanger en de analoog-digitaalomzetter (indien nodig) voor de specifieke telemetriesysteem dat wordt gebruikt.
Opmerking: De telemetriesysteem gebruikt hier digitale gegevens naar de ontvanger gestuurd. Dit kan afwijken voor andere systemen. - Plaats de elektroden, de lijm, de Q-tips, en de doekjes, evenals de mengen blokken, op een afzonderlijke tabel.
- De elektroden met korte kabels voor te bereiden. Om dit te doen, snijd de elektroden en hen opnieuw te solderen met een lengte die zo kort mogelijk te zijn, afhankelijk van de grootte van het dier. De kabels moet lang genoeg om verbinding maken met de gewenste opname posities op het hoofd met de telemetrische EEG-eenheid, die de gegevens toezenden. Kabels die te lang moeten worden terugdeinsden en bedekt met huid klevende silicone-elastomeer. Langere kabels die moeten worden terugdeinsden maken de siliconen patch groter en zwaarder.
2. Knorretje
- Een biggen te vangen door het grijpen op het been of op de thorax. Houden en zich bewust zijn van ontlasting of plassen.
- Indien nodig, markeren de biggen met een nummer.
- De biggen wikkel in een handdoek. De biggen zal kalmeren. Zich bewust zijn van de oververhitting van de biggen.
- Houd de biggen met één hand op het lichaam of de onderarm. Gebruik de andere kant te houden van de snuit. Zich bewust zijn van de oververhitting van de biggen en zorg ervoor dat het is gratis om te ademen goed.
3. elektroden
- Heb een tweede persoon hechten de elektroden.
- Reinig de huid van vuil met water of ethanol. Indien nodig, de hoofd scheren.
- Verwijder eventuele dode huidcellen met een schurende EEG-gel en een Q-tip. Verwijder daarna de schurende gel. Alternatief, gebruik schuurpapier.
- De zelfklevende elektroden op de gewenste locatie vaststellen. Plaats van de elektrode van de grond boven het cerebellum (tussen de oren) en de referentie-elektrode op de neus. Plaats de elektrode van de opname op de gewenste locatie.
Opmerking: In dit geval een unipolaire opname werd uitgevoerd, omdat de verwijzing was geplaatst op een neutrale positie (neus). Er is geen gestandaardiseerde systeem beschikbaar voor biggen tot nu. Hier, werd de positie van een pariëtale opname gebruikt (tussen het oog en het oor) op de rechts-hersenhelft. - Sluit de kabels aan de telemetrie-unit. Schakel in de eenheid. Afhankelijk van de telemetriesysteem gebruikt, zou dit een magneetschakelaar of een signaal van radiofrequentie wakker.
- Dekking van de telemetrie-unit en alle kabels zo goed als alle elektroden met tweecomponenten huid zelfklevende siliconen rubber (Zie Tabel van materialen). Door het mengen van gelijke hoeveelheden van beide componenten, zal de uithardingstijd in het bereik van 1 min. ogen en wimpers moeten niet worden bedekt met een rubber.
- Wacht totdat het siliconen rubber is volledig genezen.
- Plaats de biggen terug in het varkenshok.
- Observeer de biggen om te zien of het vertoont tekenen van ongemak over een langere periode van tijd (enkele minuten).
4. meting
- Wacht totdat de biggen is hersteld en begint te synchroniseren zijn gedrag dat van zijn broers en zussen (eten, spelen, slapen), meestal na 30 s (Figuur 1).
- Wachten voor slaap fasen, indien gewenst. De opnametijd is afhankelijk van de specifieke wetenschappelijke vraag. Hier, werden 10 min opnamesessies gebruikt.
- Als de telemetrie-unit is bedekt door meer dan 2 andere biggen, misschien het signaal wel te laag is voor de ontvanger. Duw voorzichtig de biggen weg als ze op de top slapen. Zich bewust zijn van de zeug; het kan agressief reageren.
- De opname te starten met de data acquisitie software (Zie Tabel van materialen).
5. de afwerking
- Nadat de opname (meestal enkele uren), vangen de biggen weer als is beschreven in stap 2. Zich bewust zijn van de zeug; het kan agressief reageren.
- Til voorzichtig het siliconen rubber aan één rand. Verwijder vervolgens de hele patch van silicone rubber met de elektroden en de telemetrie-unit. Wees voorzichtig met de Knorretje's ogen.
- Plaats de biggen terug in het varkenshok.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We konden opnemen typisch EEG patronen in verband gebracht met non - REM-slaap, zoals spindel uitbarstingen of delta borstels, vrij bewegen biggen (Figuur 1 en Figuur 2). We waren vooral geïnteresseerd in representatieve patronen tijdens non - REM-slaap, maar fasen van REM-achtige slaap12 met een zeer lage amplitude ook hebben geregistreerd (Figuur 3). De Fysiologie en het bedrag van de REM-slaap verschillen soorten13. Korte REM-fasen in de range van een paar minuten zijn typisch voor varkens14. Goede opnamekwaliteit was ook beschikbaar tijdens het voeden (borstvoeding) (Figuur 4). Wat spelen gedrag, leidt sterke spieractiviteit tot spier artefacten; filters zijn echter ontworpen uitpakken EEG bands. Verdere mogelijke analytische instrumenten zijn berekeningen van spectrale vermogensdichtheid of analytische instrumenten gericht op netwerkactiviteiten, zoals, bijvoorbeeld, fase-amplitude koppeling. Deze analytische instrumenten kunnen ook worden gebruikt met één-kanaals EEG opnames.
Figuur 1: een slapende biggen met het systeem voor telemetrische EEG. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: typisch EEG patronen opgenomen tijdens de fase van de slaap van een vrij bewegende Knorretje, naast haar broers en zussen rusten. Beoefend zijn door dozen gemarkeerd. Van links naar rechts geeft het eerste vak typische patronen ontlokte door spieractiviteit; bijvoorbeeld, korte schokbewegingen tijdens de slaap, gekenmerkt door hoge hoeveelheden snel gamma activiteit (boven 80 Hz) en een burst-achtige uitstraling. Het tweede vak geeft een delta-borstel-achtige aflevering, gekenmerkt door delta activiteit met bovenliggende activiteit in het bereik theta en alpha. De derde en vierde vakken geven korte afleveringen van gamma uitbarstingen (slaap spindel-achtige gebeurtenissen), gekenmerkt door frequentie componenten in de bands van Alfa, bèta en gamma. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: REM fasen tijdens de slaap. Het eerste en het tweede vak Toon zacht-ondulatie slaap fasen. Het derde vak duidt op een low-amplitude EEG fase van ongeveer 20 s in duur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: een trace 10 min EEG opname van een drinken biggen (borstvoeding). De trog na 100 s is te wijten aan een kort verlies van radiocommunicatie tussen de zender en de ontvanger van de EEG-opname-systeem. Daarna zijn er enkele spier of beweging artefacten. Spier artefacten worden gekenmerkt door zeer hoge delta band amplitudes. In tegenstelling, wordt EEG activiteit gekenmerkt door een geleidelijke daling van de amplitude macht van trage tot snelle golven (zie, bijvoorbeeld, tussen de 200 en 250 s). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een cruciale stap in het protocol is het voldoende huidcontact met de elektroden, met name de grond elektrode, om stabiele opnamen met weinig ruis. Bovendien, aangezien de biggen zijn zeer behendig, het is belangrijk ter dekking van het hele systeem met silicone rubber ter bescherming van de elektroden en de telemetrie-unit. Bovendien, als de experimenten zijn uitgevoerd in een stal met een lattenbodem vloer, wees voorzichtig met kleine apparaten of verbindingslijnen.
In het geval van een onvoldoende greep van de zelfklevende hydrogel elektroden, probeert te verwijderen van de schurende crème zoveel mogelijk. Een alternatieve manier om te verwijderen van de dode buitenste huidlaag is het gebruik van schuurpapier. Een voorbehandeling met alcohol is niet verplicht. Vuile huid kan ook met water worden gereinigd. Gebruik geen gips strips in plaats van de dubbele silicone lichaam de telemetrische systeem vast te stellen. Gips strips kunnen irritatie van de huid en massale tekenen van ongemak veroorzaken. Biggen te ontdoen van het systeem zeer snel in dat geval.
Een beperking van de methode is de stabiliteit van hydrogel elektroden. Ze kunnen drogen na enkele uren, wat resulteert in een verlies voor de opnamekwaliteit. Bovendien, zoals met alle technieken van de EEG, sterke bewegingen zijn meestal geassocieerd met spier artefacten op het spoor van de opname (zoals te zien in Figuur 4). Een goede plaatsing van de antenne is bovendien belangrijk om te verminderen van artefacten die uit een arme ontvanger signaal voortvloeien kunnen. Metalen hekken kunnen ook leiden tot hoge-frequentie storingen, wat resulteert in een verlies van gegevens sequenties. Een oplossing voor dit probleem is om de antenne binnen de metalen hek in een optimale positie. De optimale positie van de antenne kan alleen worden geëvalueerd in het veld door trial and error. De zeug en de andere biggen leiden niet tot artefacten, omdat de biggen dragen het systeem meestal andere biggen te manipuleren hun hoofd niet toestaan. Dit kan afwijken voor andere soorten.
De methode is met name belangrijk voor translationeel benaderingen in de neurowetenschappen. Met deze techniek is het mogelijk gebruik van niet-invasieve opnamen zonder sedatie. De resulterende EEG opnames zijn zeer vergelijkbaar met de klinische setting. De techniek kan openen nieuwe perspectieven te karakteriseren premature EEG rijping door middel van diermodel systemen. Buiten dat, misschien ook door deze noninvasive techniek veel neurowetenschappelijke vragen, met name wat betreft de corticale veld potentiëlen, worden onderzocht. Vandaar, de methode heeft het potentieel om het aantal en de ernst van dierproeven op het gebied van de neurowetenschappen.
Voor de toekomst, zijn opnames met meer dan één elektrode gepland. Een voorwaarde is de miniaturisering van de elektroden. Bovendien is de stabiliteit van de elektroden op de lange termijn een kwestie voor toekomstige innovaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Helmut Scheu voor de gelegenheid om onze onderzoek in het varkenshok op Hofgut Neumühle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable adhesive surface silver/silver chloride electrodes |
Spes Medica S.r.l., Genova, Italy |
Self adhesive hydrogel electrode | |
| Abralyt HiCl | Easycap GmbH | Abrasive cream | |
| Body Double fast | Smooth On Inc. | Skin adhesive silicone | |
| Telemetry system | Internal development | ||
| Picolog 1216 | Pico Technology | AD converter | |
| Laptop | Panasonic | Rugged laptop | |
| Receiver | Internal development |
References
- Conrad, M. S., Sutton, B. P., Dilger, R. N., Johnson, R. W. An in vivo three-dimensional magnetic resonance imaging-based averaged brain collection of the neonatal piglet (Sus scrofa). PLoS ONE. 9 (9), e107650 (2014).
- de Camp, N. V., Hense, F., Lecher, B., Scheu, H., Bergeler, J. Models for preterm cortical development using non invasive clinical EEG. Translational Neuroscience. 8, 211-224 (2017).
- Lapray, D., Bergeler, J., Dupont, E., Thews, O., Luhmann, H. J. A novel telemetric system for recording brain activity in small animals. Telemetry: Research, Technology and Applications. Barculo, D., Daniels, J. , Nova Science Publishers. 195-203 (2009).
- Kim, D., Yeon, C., Kim, K. Development and experimental validation of a dry non- invasive multi-channel mouse scalp EEG sensor through visual evoked potential recordings. Sensors. 17, 326 (2017).
- Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
- Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10, 066014 (2013).
- Hellström-Westas, L., Rosén, I. Electroencephalography and brain damage in preterm infants. Early Human Development. 81, 255-261 (2005).
- Lloyd, R. O., Goulding, R. M., Filan, P. M., Boylan, G. B. Overcoming the practical challenges of electroencephalography for very preterm infants in the neonatal intensive care unit. Acta Paediatrica. , 152-157 (2015).
- Clancy, B., Finlay, B. L., Darlington, R. B., Anand, K. J. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28, 931-937 (2007).
- Iyer, K. K., et al. Cortical burst dynamics predict clinical outcome early in extremely preterm infants. Brain. 138, 2206-2218 (2015).
- Luhmann, H., de Camp, N., Bergeler, J. Monitoring brain activity in preterms: mathematics helps to predict clinical outcome. Brain. 138, 2114-2125 (2015).
- Dragomir, A., Akay, Y., Curran, A. K., Akay, M. Complexity measures of the central respiratory networks during wakefulness and sleep. Journal of Neural Engineering. 5, 254-261 (2008).
- Peever, J., Fuller, P. M. The biology of REM sleep. Current Biology. 27, R1237-R1248 (2017).
- Robert, S., Dallaire, A. Polygraphic Analysis of the sleep-wake states and the REM Sleep periodicity in domesticated pigs (Sus scrofa). Physiology & Behavior. 37 (2), 289-293 (1986).
