Summary
Här presenterar vi ett protokoll till rekord telemetriska elektroencefalogram (EEGs) från fritt rörliga smågrisar direkt i pigpen utan användning av lugnande medel, vilket gör det möjligt att spela in typiska EEG-mönster under icke - REM-sömn, som spindeln spricker.
Abstract
Metoden tillåter inspelning av hög kvalitet elektroencefalogram (EEGs) från fritt rörliga smågrisar direkt i pigpen. Vi använder en enkanals telemetriska elektroencefalografi system i kombination med standard självhäftande hydrogel elektroder. Smågrisarna är lugnade ner utan användning av lugnande medel. Efter sin övergång till pigpen, smågrisarna bete sig normalt — de dricker och sover i samma cykel som sina syskon. Sin sömn arrangerar gradvis används för EEG inspelningarna.
Introduction
Smågrisar är en framväxande modellsystem för neurovetenskap1. För att stärka translationell forskning, uppfann vi en metod att spela in icke-invasiv, kliniska EEGs från ohämmad smågrisar2 (figur 1 och figur 2). Två förutsättningar för en translationell användning av EEG inspelningar, angående EEG mönster i samband med kortikala mognad, är en icke-invasiv metod, jämförbar med den kliniska inställningen och avhållsamhet av lugnande eller narkos. En-kanals telemetri system3 i kombination med självhäftande elektroder kan sättas fast i ca 5 min. efteråt, smågrisarna kommer att återhämta sig snabbt från förfarandet för hantering och synkronisera deras utfodring och sover beteende till den andra smågrisar och suggan.
Även om det finns redan försök att använda icke-invasiv EEG inspelningar från sederad djur4, utförs de flesta elektroencefalografi studier från djur med invasiva metoder. Dessa metoder har biverkningar avseende inflammatoriska processer kring den inopererade elektroder5,6 , och i de flesta fall, de kräver en social separation av djuren på grund av de externa komponenterna av implanterade EEG systemet. Översättningen av dessa data till det kliniska sammanhanget är därför svårt. Behovet av translationella angreppssätt blir tydligt av det faktum att det ännu inte är känt hur en ”normal” hjärnans mognad under tidiga kortikala utveckling representeras av kliniska, icke-invasiv elektroencefalografi7. Detta kunskapsglapp orsakas av tekniska utmaningar i samband med EEG inspelningar från prematura spädbarn8. I djurmodell system nås mönster av tidig kortikala utveckling bättre, eftersom de flesta djur föds med en ”prematura hjärna” i jämförelse med mänskliga kortikala utveckling9. Förutom bevarade mönster av kortikala utveckling över arter2, har det nyligen visats att EEG inspelningar från prematura spädbarn också kan förutsäga det individuella kliniska resultatet under senare liv10,11. Den metod som beskrivs här är särskilt användbart för developmental neuroscience translationella aspekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av den lokala etiska kommittén (#23177-07/G10-1-010/G 15-15-011) och följde europeiska och den tyska nationella reglementet (Europeiska gemenskapernas direktiv, 86/609/EEG; Tierschutzgesetz).
Alla djur förfaranden utfördes i enlighet med medicinska Center av Johannes Gutenberg-University Mainz djurvård utskottets förordningar.
1. inställning
- Innan experimentet, kontrollera om någon linjebrus och hitta en lämplig plats för set-up och antennen. Linjebrus syns som en 60 eller 50 Hz sinus våg.
Obs: Placeringen av antennen och särskilt avståndet mellan sändaren och mottagaren beror på överföring styrkan i systemet. Det system som används här är justerbar. Det justerades till en relativt låg effekt, med en ca 3 m överföring räckvidd. Dessutom kan staket i pigpen dämpa signalen och orsaka störningar. I det här fallet är det nödvändigt att placera antennen inuti den metall bur. - Använd en kabel trumma för att leverera set-up med linje makt. Anslut den bärbara datorn, mottagarenheten och analog till digital omvandlare (om nödvändigt) för specifika telemetrisystem som används.
Obs: Den telemetrisystem används här skickade digitala data till mottagaren. Detta kan vara annorlunda för andra system. - Placera elektroderna, lim, Q-tips, och våtservetter, samt blandning blocken, på en separat tabell.
- Förbereda elektroderna med korta kablar. Till gör så, klippa elektroderna och löda igen med en längd som är så korta som möjligt, beroende på djurets storlek. Kablarna måste vara tillräckligt lång för att ansluta önskat inspelning positionerna på huvudet med telemetriska EEG enhet, överföring av data. Kablar som är för långa måste ryggade och täckta med hud självhäftande silikonelastomer. Längre kablar som måste vara ryggade göra silikon plåstret större och tyngre.
2. Nasse
- Fånga en griskulting genom att greppa den i benet eller på bröstkorgen. Håll den och vara medveten om eventuella defekation eller urinering.
- Om nödvändigt, markera Griseknoen med flera.
- Wrap Griseknoen i en handduk. Griseknoen kommer att lugna ner. Vara medveten om överhettning Griseknoen.
- Håll Nasse med å ena sidan på kroppen eller underarm. Använd den andra handen hålla nosen. Vara medveten om överhettning Griseknoen och kontrollera att det är gratis att andas ordentligt.
3. elektroder
- Har en andra person som fäster elektroderna.
- Ren huden från smuts med vatten eller etanol. Om nödvändigt, raka huvudet.
- Ta bort alla döda hudceller med en slipande EEG-gel och en tops. Gelen slipande efteråt. Alternativt, Använd sandpapper.
- Fixa de självhäftande elektroderna på önskad plats. Placera den mark elektroden ovanför lillhjärnan (mellan öronen) och referenselektroden på näsan. Placera inspelning elektroden på önskad plats.
Obs: I det här fallet en unipolär inspelning utfördes, eftersom hänvisningen placerades på en neutral ställning (näsa). Det finns inget standardiserat system för smågrisar förrän nu. Här användes en parietala inspelning position (mellan ögat och örat) på den högra hjärnhalvan. - Anslut kablarna till telemetri enheten. Slå på enheten. Beroende på telemetrisystem används, kan detta vara en magnetbrytare eller en radiofrekvens väckning signal.
- Täcka telemetri enheten och alla kablar samt alla elektroder med tvåkomponents hud självhäftande silikongummi (se Tabell för material). Genom att blanda lika delar av båda komponenterna, härdningstiden kommer att vara i intervallet 1 min. ögon och ögonfransar bör inte täckas med gummi.
- Vänta tills silikongummi är helt botad.
- Placera Griseknoen tillbaka i pigpen.
- Observera att Nasse att se om det visar tecken på obehag under en längre tid (flera minuter).
4. mätning
- Vänta tills Griseknoen har återhämtat sig och börjar att synkronisera sitt beteende med sina syskon (utfodring, spela, sover), vanligtvis efter 30 s (figur 1).
- Vänta på sömnen arrangerar gradvis, om så önskas. Inspelningstiden beror på den specifika vetenskapliga frågan. Här, användes 10 min inspelning sessioner.
- Om telemetri enheten omfattas av mer än 2 andra smågrisar, vara signalen för låg för mottagaren. Tryck försiktigt smågrisarna bort om de sover på toppen. Vara medveten om suggan; Det kan reagera aggressivt.
- Starta inspelningen med programvaran data förvärv (se Tabell för material).
5. Slutför
- Efter inspelningen (oftast flera timmar), fånga Griseknoen igen som beskrivits i steg 2. Vara medveten om suggan; Det kan reagera aggressivt.
- Lyft försiktigt upp silikongummi på ena kanten. Ta sedan bort hela patchen av silikongummi som innehåller elektroderna och telemetri enheten. Var försiktig med den Nasses ögon.
- Placera Griseknoen tillbaka i pigpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi kunde spela in typiska EEG mönster i samband med icke - REM-sömn, som spindeln skurar eller delta borstar, från fritt rörliga smågrisar (figur 1 och figur 2). Vi var mest intresserade av representativa mönster under icke - REM-sömn, men faser av REM-liknande sömn12 med en mycket låg amplitud har också spelats in (figur 3). Fysiologi och mängden REM-sömn varierar mellan arter13. Kort REM faser i spänna av några minuter är typiska för svin14. Bra inspelningskvalitet var också tillgängliga under utfodring (amning) (figur 4). När det gäller spelar beteende, leder stark muskelaktivitet till muskel artefakter; dock har filter utformats för att extrahera EEG band. Ytterligare möjliga analysverktyg är beräkningar av spektral effekttäthet eller analytiska verktyg med fokus på nätverksaktivitet, som till exempel, fas-amplitud koppling. Dessa analytiska verktyg kan också användas med enkanalig EEG inspelningar.
Figur 1: en sovande Nasse med telemetriska EEG systemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: typiska EEG mönster registreras under sömn fasen av ett fritt rörliga Nasse, vilar bredvid dess siblings. Fyra händelser markeras av lådor. Från vänster till höger visar den första rutan typiska mönster som framkallas av muskelaktivitet; till exempel korta ryckningar under sömnen, kännetecknas av stora mängder snabba gamma aktivitet (över 80 Hz) och en burst-liknande utseende. Den andra rutan visar en delta borsta-gillar episod, kännetecknas av delta aktivitet med överlagrade aktivitet i intervallet theta och alpha. Tredje och fjärde rutorna Visa korta episoder av gamma skurar (sömn spindel-liknande händelser), kännetecknas av frekvens komponenter i banden alpha, beta och gamma. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: REM faser under sömnen. Först och den andra rutan visar långsam-våg sömn arrangerar gradvis. Den tredje rutan indikerar en låg amplitud EEG fas av ungefärligt 20 s varaktighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: 10 min EEG inspelning spår av en dricka Nasse (amning). Dalvärdet efter 100 s beror på en kort förlust för radiokommunikation mellan sändaren och mottagaren av det EEG inspelningssystemet. Efteråt, finns det vissa muskel- eller rörelse artefakter. Muskel artefakter kännetecknas av mycket hög delta bandet amplituder. Däremot kännetecknas EEG verksamhet av en gradvis minskning av amplituden makten från långsam till snabb vågor (se, till exempel mellan 200 och 250 s). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett avgörande steg i protokollet är den adekvat hudkontakt med elektroderna, särskilt marken elektroden, att uppnå stabila inspelningar med låg ljudnivå. Dessutom eftersom smågrisar är mycket smidig, är det viktigt att täcka hela systemet med silikongummi att skydda elektroderna och telemetri enheten. Dessutom om experimenten utförs i ett stall med ett spaltgolv, vara försiktig med små enheter eller kopplingar.
Vid en otillräcklig grepp av självhäftande hydrogel elektroderna, försöka ta bort den slipande grädden så mycket som möjligt. Ett alternativt sätt att ta bort yttre döda hudlagret använder sandpapper. En förbehandling med alkohol är inte obligatoriskt. Smutsig hud kan också rengöras med vatten. Använd inte gips remsor istället för body double silikon fixar telemetriska systemet. Gips remsorna kan orsaka hudirritation och massiva tecken på obehag. Smågrisar bli av systemet mycket snabbt i det fallet.
En begränsning för metoden är stabiliteten av hydrogel elektroder. De kan torka efter några timmar, vilket resulterar i en förlust för inspelningskvalitet. Dessutom som med alla EEG-tekniker, är starka rörelser vanligtvis förknippas med muskel artefakter på inspelning tracen (som kan ses i figur 4). En bra placering av antennen är dessutom viktigt att minska artefakter som kan resultera från en dålig mottagare signal. Metall staket kan också orsaka högfrekventa störningar, vilket resulterar i en förlust av data sekvenser. En lösning på problemet är att placera antennen inuti det metall staketet i en optimal position. Den optimala positionen för antennen kan endast utvärderas i fältet genom trial and error. Suggan och andra smågrisarna leder inte till artefakter, eftersom smågrisarna bär systemet vanligtvis inte tillåter andra smågrisar att manipulera sitt huvud. Detta kan vara annorlunda för andra arter.
Metoden är särskilt viktigt för translationell metoder i neurovetenskap. Med denna teknik är det möjligt att använda icke-invasiv inspelningar utan sedering. De resulterande EEG inspelningarna är mycket lik den kliniska inställningen. Tekniken kan öppna upp nya möjligheter att karakterisera prematura EEG mognad genom djurmodell system. Utöver detta kan många neuroscientific frågor, särskilt när det gäller kortikala fältet potentialer, också granskas av denna icke-invasiv teknik. Metoden har därför potential att minska antalet och svårighetsgraden av djurförsök inom neurovetenskap.
För framtiden planeras inspelningar med mer än en elektrod. En förutsättning är miniatyriseringen av elektroderna. Dessutom är elektroderna långsiktiga stabilitet en fråga för framtida innovationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Helmut Scheu för möjligheten att bedriva vår forskning i pigpen på Hofgut Neumühle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable adhesive surface silver/silver chloride electrodes |
Spes Medica S.r.l., Genova, Italy |
Self adhesive hydrogel electrode | |
| Abralyt HiCl | Easycap GmbH | Abrasive cream | |
| Body Double fast | Smooth On Inc. | Skin adhesive silicone | |
| Telemetry system | Internal development | ||
| Picolog 1216 | Pico Technology | AD converter | |
| Laptop | Panasonic | Rugged laptop | |
| Receiver | Internal development |
References
- Conrad, M. S., Sutton, B. P., Dilger, R. N., Johnson, R. W. An in vivo three-dimensional magnetic resonance imaging-based averaged brain collection of the neonatal piglet (Sus scrofa). PLoS ONE. 9 (9), e107650 (2014).
- de Camp, N. V., Hense, F., Lecher, B., Scheu, H., Bergeler, J. Models for preterm cortical development using non invasive clinical EEG. Translational Neuroscience. 8, 211-224 (2017).
- Lapray, D., Bergeler, J., Dupont, E., Thews, O., Luhmann, H. J. A novel telemetric system for recording brain activity in small animals. Telemetry: Research, Technology and Applications. Barculo, D., Daniels, J. , Nova Science Publishers. 195-203 (2009).
- Kim, D., Yeon, C., Kim, K. Development and experimental validation of a dry non- invasive multi-channel mouse scalp EEG sensor through visual evoked potential recordings. Sensors. 17, 326 (2017).
- Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
- Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10, 066014 (2013).
- Hellström-Westas, L., Rosén, I. Electroencephalography and brain damage in preterm infants. Early Human Development. 81, 255-261 (2005).
- Lloyd, R. O., Goulding, R. M., Filan, P. M., Boylan, G. B. Overcoming the practical challenges of electroencephalography for very preterm infants in the neonatal intensive care unit. Acta Paediatrica. , 152-157 (2015).
- Clancy, B., Finlay, B. L., Darlington, R. B., Anand, K. J. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28, 931-937 (2007).
- Iyer, K. K., et al. Cortical burst dynamics predict clinical outcome early in extremely preterm infants. Brain. 138, 2206-2218 (2015).
- Luhmann, H., de Camp, N., Bergeler, J. Monitoring brain activity in preterms: mathematics helps to predict clinical outcome. Brain. 138, 2114-2125 (2015).
- Dragomir, A., Akay, Y., Curran, A. K., Akay, M. Complexity measures of the central respiratory networks during wakefulness and sleep. Journal of Neural Engineering. 5, 254-261 (2008).
- Peever, J., Fuller, P. M. The biology of REM sleep. Current Biology. 27, R1237-R1248 (2017).
- Robert, S., Dallaire, A. Polygraphic Analysis of the sleep-wake states and the REM Sleep periodicity in domesticated pigs (Sus scrofa). Physiology & Behavior. 37 (2), 289-293 (1986).
