Summary
En protokol, der er forelagt for at lokalisere Ag i hvaler lever og nyre væv af autometallografi. Derudover er en ny analyse, opkaldt småhvaler histologiske Ag analysen (CHAA) udviklet til at estimere Ag koncentrationer i disse væv.
Abstract
Sølv nanopartikler (AgNPs) har været flittigt brugt i kommercielle produkter, herunder tekstiler, kosmetik og sundhedspleje elementer, på grund af deres stærke antimikrobielle virkninger. De også kan blive frigivet i miljøet og opkoncentreres i havet. Derfor, AgNPs er den største kilde til Ag kontaminering, og offentlig bevidsthed om de miljømæssige toksicitet af Ag er stigende. Tidligere undersøgelser har påvist bioakkumulering (i producenter) og forstørrelse (i forbrugerne/rovdyr) AG. Hvaler, kan som apex rovdyr i havet, have været negativt påvirket af Ag/Ag-forbindelser. Selv om koncentrationerne af Ag/Ag forbindelser i hvaler væv kan måles ved Induktivt koblet plasma masse spektroskopi (ICP-MS), er brug af ICP-MS begrænset af sin høje kapitalomkostninger og kravet om væv opbevaring/forberedelse. Derfor en autometallografi (AMG) metode med en billede kvantitativ analyse ved hjælp af formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) væv kan være en adjuvans metode hen til lokalisere Ag distributionen i den suborgan og estimere Ag koncentration i hvaler væv. De positive signaler, AMG er hovedsagelig brun til sort granulat i forskellige størrelser i cytoplasma af proksimale renal tubulær epitel, hepatocytter og Kupffer celler. Lejlighedsvis, nogle amorfe gylden gul til brun AMG positive signaler er angivet i lumen og basalmembranen af nogle proksimale renal tubuli. Analysen til estimering Ag koncentration er opkaldt den hvaler histologiske Ag Assay (CHAA), som er en regressionsmodel, etableret af data fra billede kvantitativ analyse af AMG metode og ICP-MS. Brugen af AMG med CHAA at lokalisere og semi-kvantificere tungmetaller giver en bekvem metode for spatio-temporale og cross-arter undersøgelser.
Introduction
Sølv nanopartikler (AgNPs) har været flittigt brugt i kommercielle produkter, herunder tekstiler, kosmetik og sundhedspleje elementer, på grund af deres store antimikrobielle effekter1,2. Derfor, fremstilling af AgNPs og antallet af AgNP-holdige produkter er steget over tid3,4. Men AgNPs kan frigives til miljøet og ophobes i havet5,6. De er blevet den største kilde til Ag forurening, og den offentlige bevidsthed om de miljømæssige toksicitet af Ag er stigende.
AgNPs og Ag status i havmiljøet er kompliceret og under konstant forandring. Tidligere undersøgelser har vist, at AgNPs kan forblive som partikler, samlede, opløses, reagerer med forskellige kemiske arter eller regenereres fra Ag+ ioner7,8. Flere typer af Ag forbindelser, såsom AgCl, er blevet fundet i marine sedimenter, hvor de kan indtages af bentiske organismer og Indtast fødevarekæden9,10. Ifølge en tidligere undersøgelse gennemført i Chi-ku Lagoon området langs den sydvestlige kyst af Taiwan, Ag koncentrationer af marine sedimenter er ekstremt lavt og svarer til den crustal overflod, og dem af fiskelever væv er normalt under påvisning begrænse (< 0.025 μg/g våd/våd)11. Men tidligere undersøgelser i de forskellige lande har vist relativt høje Ag koncentrationer i lever af hvaler12,13. Ag koncentration i lever af hvaler er aldersbetinget, antyder, at kilden til Ag i deres kroppe er sandsynligvis deres bytte12. Disse resultater yderligere foreslå Bioakkumuleringen af Ag i dyr på højere trofiske niveauer. Hvaler, kan som apex rovdyr i havet, have lidt negative sundhedsvirkninger forårsaget af Ag/Ag forbindelser12,13,14. Vigtigst, som hvaler er mennesker pattedyr, og de negative sundhedsmæssige virkninger forårsaget af Ag/Ag forbindelser i hvaler kan også forekomme hos mennesker. Med andre ord kunne hvaler kontroldyr for havmiljø og mennesker sundhed. De sundhedsmæssige virkninger, væv distribution og koncentration af Ag i hvaler er derfor anledning til stor bekymring.
Selv om koncentrationerne af Ag/Ag forbindelser i hvaler væv kan måles ved Induktivt koblet plasma masse spektroskopi (ICP-MS), er brug af ICP-MS begrænset af sin høje kapitalomkostninger (instrument og vedligeholdelse) og kravene til opbevaring af væv /Preparation12,15. Derudover er det som regel vanskeligt at indsamle omfattende vævsprøver i alle undersøgelser af strandede hvaler tilfælde på grund af logistiske vanskeligheder, en mangel på arbejdskraft og mangel på Relaterede ressourcer12. De frosne vævsprøver for ICP-MS analyse gemmes ikke let på grund af begrænset køle rummet, og frosne vævsprøver kan blive frasorteret på grund af brudte køle udstyr12. Disse ovennævnte hindringer hæmmer undersøgelser af forureningsniveauet i hvaler væv af ICP-MS analyse ved hjælp af frosne vævsprøver. Derimod formalin fast vævsprøver er relativt let at indsamle under obduktion af døde-strandede hvaler. Det er derfor nødvendigt at udvikle en brugervenlig og billig metode til at registrere/foranstaltning tungmetaller i hvaler væv ved hjælp af formalin fast vævsprøver.
Selvom suborgan distributioner og koncentrationerne af metaller, alkali og alkaline jorden kan ændres i løbet af formalin-fast, paraffin-embedded (FFPE) proces, kun mindre effekter på overgangen metaller, som Ag, har været nævnt16. Dermed er FFPE væv blevet betragtet som en ideel prøve ressource for metal lokalisering og målinger16,17. Autometallografi (AMG), en histokemiske proces, kan forstærke tungmetaller som trinløst mellemstore gylden gul sort AMG positive signaler på FFPE væv sektioner, og disse forstærkede tungmetaller kan visualiseres under lysmikroskopi18, 19 , 20 , 21. derfor, metoden AMG indeholder oplysninger om suborgan-distributioner af tungmetaller. Det kan give vigtige supplerende oplysninger for at studere stofskifteveje af tungmetaller i biologiske systemer, fordi ICP-MS kan kun måle koncentrationen af tungmetaller på orgel level18. Derudover er digital billede analyse software, såsom ImageJ, blevet anvendt til kvantitativ analyse af histologiske væv afsnit22,23. Den trinløst mellemstore gylden gul sort AMG positive signaler af FFPE væv sektioner kan kvantificeres og bruges til at estimere koncentrationer af tungmetaller. Selv om den absolutte Ag koncentration ikke bestemmes direkte ved metoden AMG med billede kvantitativ analyse, kan det anslås af en regressionsmodel, baseret på oplysninger indhentet fra billede kvantitativ analyse og ICP-MS, som er opkaldt hvaler histologiske Ag assay (CHAA). I betragtning af vanskelighederne i at måle Ag koncentrationer af ICP-MS analyse i mest strandede hvaler CHAA er en værdifuld adjuverende metode til at anslå Ag koncentrationer i hvaler væv, som ikke kan afgøres af ICP-MS analyse på grund af manglende frosset vævsprøver. Dette papir beskriver protokollen af en histokemiske teknik (AMG metode) for lokalisering Ag på suborgan niveauet og en assay opkaldt CHAA at anslå Ag koncentrationer i lever og nyre væv af hvaler.
Figur 1: Flowchart skildrer fastlæggelse og anvendelse af småhvaler histologiske Ag assay (CHAA) til estimering Ag koncentrationer. CHAA = småhvaler histologiske Ag assay, FFPE = Formalin-fast, paraffin-embedded, ICP-MS = Induktivt koblet plasma masse spektroskopi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med internationale retningslinjer, og brugen af småhvaler vævsprøver blev tilladt af Rådet af landbrug i Taiwan (forskning tillade 104-07.1-SB-62).
1. Vævscentre prøveforberedelse til ICP-MS analyse
Bemærk: De lever og nyre væv blev indsamlet fra frisk døde og moderat autolyzed strandede hvaler24, herunder 6 strandede hvaler af 4 forskellige arter, 1 Grampus griseus (Gg), 2 Kogia spp. (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). Hver strandede hvaler havde et feltnummer til individuel identifikation. Væv prøveforberedelse til ICP-MS analyse fulgt metoden etableret i M.H. Chen lab, og M.H. Chen lab gennemført ICP-MS analyse11,13,25.
- Indsamle lever og nyre væv for ICP-MS analyse fra strandede hvaler og gemme dem på −20 ° C indtil brug.
- Indsamle par-matchede lever og nyre væv fra samme strandede hvaler til AMG analyse (Se trin 2).
- Trimme det yderste lag af de indsamlede for ICP-MS analyse med en rustfrit stål skalpel vævsprøver. Skær den inderste del af vævsprøver i små tern (ca. 1 cm3) og placere dem i zip låse plastikposer. Normalt, indeholder hver pose 10 g væv.
- Gemme plastposer indeholdende vævsprøver −20 ° C til efterfølgende procedurer.
- Lægge 1 cm3 terninger prøver i en fryse tørre system (-50 ° C, vakuumpumpe med et deplacement på mindst 98 L/min, 0.002 mBar) i mindst 72 timer indtil helt tørret ved vejning konstante.
- Homogeniseres tørrede kuberne til pulver med en homogeniseringsapparat for efterfølgende væv fordøjelsen.
- 0,3 g af homogeniseret frysetørret prøver i 30 mL polytetrafluorethylen (PTFE) flasker og bland dem med 10 mL af 65% w/w salpetersyre.
- Sætte lukninger på PTFE flasker, men forlader de lukninger, untightened.
Bemærk: Dette giver den brune fume form i PTFE flasker og opstød inde i flasken for fordøjelsen indtil de brune fume forsvinder og bliver klar. - Opvarmes de udtog prøver med en varmeplade fra 30 ° C til 110/120 ° C (ifølge den brune fume danner betingelse) i PTFE flasker i 2 til 3 uger indtil den brunlige gas i PTFE flasker bliver farveløs og væske i PTFE flasker bliver gennemsigtig gree nish bleg gul eller helt klart.
Bemærk: Udfør den varme proces i kemiske stinkskab. - Opvarm de udtog prøver ved 120 ° C til at fordampe salpetersyre i PTFE flasker indtil kun 0,5-1 mL resterne.
Bemærk: Udfører den varme proces i en kemisk stinkskab, og altid overvåge temperaturstigning for at sikre, at ingen brunlig gas lækager fra PTFE flasker lukninger. - Spænd lukningerne og køle dem ved stuetemperatur i ca 1 time.
- Sted tragte med filter papirer på 25 mL målekolber og vask de resterende væske med 1 M HNO3 til en endelige volumen på 25 mL.
Bemærk: Vaske flasken for mindst tre gange og lukning to gange. - Validere analysekvalitet af ICP-MS analyse ved hjælp af standard referencematerialer, herunder TUMPE-2 (dogfish leveren) og DORM-2 (dogfish muskel).
- Bruge dubletter af hver analyseprøve og tre af standard referencematerialer til ICP-MS analyse.
- Gennemsnitlig Ag koncentrationerne af hver analytiske prøver og præsentere data som tørvægt grundlag koncentration (μg/g tør vægt).
2. Vævscentre prøveforberedelse til AMG analyse
- Indsamle par-matchede lever og nyre væv til AMG analyse fra en strandede hvaler og ordne dem i 10% neutrale bufferet formalin indtil brug.
Bemærk: Opbevar vævsprøver i plastflasker i 10% neutrale bufferet formalin (NBF, pH 7,0) for 24 til 48 timer. Mængden af NBF bør være mindst 10 gange større end det væv. - Trim formalin fast lever og nyre væv med knive i rustfrit stål engangs mikrotomen og sætte de klippede væv sektioner i kassetter med etiketter.
Bemærk: Størrelsen på hvert væv sektioner skal være ca 2 cm x 1 cm og tykkelse af sektionerne væv bør ikke overstige 3 mm. sætte lever og nyre væv fra samme person i samme kassetten. - Dehydrere den klippede væv sektioner med en væv processor gennem en serie af sorterede ethanol (70% for 1 h, 80% for 1 h, 95% for 1 h, 95% for 2 h, 100% for 1 h x 2 farvning retter og 100% for 2 h), ikke-xylen (for 1 og 2 h i forskellige farvning retter) , og fordybe dehydreret vævsprøver i paraffin (for 1 og 2 h i forskellige farvning retter).
- Placer dehydreret vævsprøver i bunde af stål histologi forme og integrere dehydreret vævsprøver med paraffin.
- Chill formalin fast paraffin-embedded (FFPE) væv blokke på køleplade, indtil paraffin størkner. Trim FFPE blokke med mikrotomen indtil væv overflade er eksponeret.
- Chill FFPE blokke på −20 ° C i 10 min. afsnit FFPE blokke på 5 µm af mikrotomen.
- Udfylde vandbad med dobbeltdestilleret vand ved 45 ° C. Løft bånd af væv sektioner og gøre dem flyder på overfladen af det varme vand ved hjælp af pincet og pensler.
- Adskille bånd af væv sektioner med pincet. Placere et afsnit på et objektglas.
- Placer objektglas på et dias varmere og lad sektioner til tørre natten over ved 37 ° C.
- Sætte objektglas i objektglasholdere og deparaffinize dem af iblødsætning dem i 3 forskellige farvning retter ren ikke-xylen (ca. 200 til 250 mL) til 8, 5 og 3 min.
- Hydrat afsnittene væv i objektglasholdere af iblødsætning dem i forskellige farvning retter af sorterede ethanol løsninger (100% ethanol to gange, 90% ethanol engang og 80% ethanol engang [1 min]), og skyl dem i dobbeltdestilleret vand.
Bemærk: Disse løsninger er ca. 200 til 250 mL i forskellige farvning retter. For hver vask er 30 sek nok. - Skyl vævet sektioner i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 0,5% Triton X-100, vask dem med PBS for flere gange, og derefter skylle dem i dobbeltdestilleret vand.
Bemærk: Disse løsninger er ca. 200 til 250 mL i forskellige farvning retter. For hver var, er 30 sek nok. - Forberede lige store mængder af de tre komponenter (initiativtager, moderator og aktivator) leveres af sølv enhancement kit i mørke og bland dem grundigt.
Bemærk: Løsningerne af moderator og aktivator er klistret, så brug afpipetteres med lang spids åbninger (eller skære tips til at skabe bredere åbninger). For hvert dias er 300 μL af den blandede opløsning (afhængig af størrelsen af afsnittet væv) normalt nok. Derfor benyttes 10 dias, er mængden af hver komponent (initiativtager, moderator og aktivator) 1000 μL (blandet løsningen er 3000 μL for 10 dias). - Inkuber afsnittene væv i den blandede opløsning i 15 min. i mørke ved stuetemperatur. Fuldt ud dække væv sektioner på dias med blandet løsning. En længere inkubationstiden kan føre til falsk-positive AMG signaler.
- Vaske dias med dobbeltdestilleret vand og bejdse dem i hæmatoxylin for 10 s som en kontrastfarve.
- Vaske dias med rindende vand, tør dem og montere dem med montering medium.
- Undersøge dias under et lysmikroskop.
- Tilfældigt fange ti histologiske billeder med en 40 X mål linse fra sektionerne væv ved hjælp af en tilsluttet digitalt kamera med computer billedbehandling software.
3. semi-kvantitative analyse for AMG Positive værdier af histologiske billeder
Bemærk: AMG positiv værdi betyder procentdelen af området med AMG positive signaler.
- Brug billede analyse software (ImageJ) til at analysere de histologiske billeder.
- Åbn det histologiske billede ved at trykke på fil | Åben.
- Opdele det valgte billede i tre farvekanaler (rød, blå og grøn) ved at trykke på billede | Type | RGB stak.
- Kvantificere AMG positive signaler ved hjælp af den blå kanal. Nukleare falsk positive signaler er normalt faldet under den blå kanal når hæmatoxylin pletten anvendes til nukleare kontrastfarve (figur 2).
- Måler procentdelen af området med AMG positive signaler i hver histologiske billede med værktøjet tærskel (billede | Justere | Tærskel).
- Manuelt justere cut-off værdi af tærsklen for hver histologiske billede (fra 90 til 110) baseret på tilstedeværelse af falsk positive områder i kerner og/eller røde blodlegemer.
Bemærk: I standard indstilling, bør AMG positive signaler blive fremhævet med rødt. - Tryk analysere | Sæt målinger, og Marker afkrydsningsfeltet i Området brøkdel til at angive, at området brøkdel er registreret.
- Tryk analysere | Foranstaltning. Positive procent inden for hver histologiske billede vises i kolonnen % område af vinduet resultat .
- Gennemsnitlig positive procent inden for 10 histologiske billeder fra sektionerne væv og definere resultatet som AMG positiv værdi for hver sektion, væv.
Figur 2: tilstedeværelsen af nukleare falsk positive signaler under forskellige farvekanaler (kontrastfarve: hæmatoxylin pletten). Repræsentative nukleare falsk positive signaler er angivet med gule pile. PPA = positive procentdel af områder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
4. etablering af småhvaler histologiske Ag analysen (CHAA) af regressionsmodel
Bemærk: Den følgende analyse er udført i prisme 6,01 til Windows.
- Vurdere sammenhængen mellem resultaterne af ICP-MS og AMG positive værdier.
- Åbn softwaren, oprette en ny projektfil, og vælg XY og korrelation.
- Inputdata herunder resultater af ICP-MS og AMG positive værdier.
- Tryk på analyse og vælge korrelation under kategorien XY-analyse til at analysere styrken af sammenhængen mellem resultaterne af ICP-MS og AMG positive værdier af Pearson korrelation analyse.
Bemærk: Resultater af ICP-MS og AMG positive værdier skal være positivt korreleret med hinanden; ellers, bør den efterfølgende regressionsmodel ikke udvikles. - Statistisk sammenligne regression modeller, herunder lineær regression, kvadratiske regression, kubisk regression og lineær regression gennem oprindelse, gennem statistik software12,26,27.
Bemærk: Hvis regressionsmodellen genererer en urealistisk Ag koncentration, regressionsmodellen skal være forladt12. - Gå tilbage til datatabel (venstre panel) og tryk på analyse | Ikke-lineær regression (curve fit) under kategorien XY analyse | OK.
- I vinduet parametre: ikke-lineær regression, vælge forskellige regressionsmodel på siden Tilpas og derefter sammenligne forskellige regression modeller på siden Sammenlign.
- På siden Sammenlign, vælge sammenligning metoder, herunder ekstra summen af kvadrater F test og Akaikes oplysninger kriterium (AIC). Ifølge resultaterne af metoderne for sammenligning, skal du bruge et relativt fald regressionsmodel i CHAA.
- Anslå Ag koncentrationer af hvaler lever og nyre væv med ukendt Ag koncentrationer ved hjælp af CHAA.
- Evaluering af nøjagtighed og præcision af CHAA for leveren og nyrerne væv. Forskellen mellem præcision og nøjagtighed er illustreret i figur 3.
- Nøjagtighed: Beregne den gennemsnitlige standardafvigelse (SD) fra forskelle mellem kendte og skønnede Ag koncentrationer.
- Præcision: Udføre gentagne måling (mindst tredobbelt) af AMG positive værdier af seriel afsnit fra samme FFPE væv. Beregne middelværdien SD målinger fra lever eller nyre væv fra forskelle mellem kendte og skønnede Ag koncentrationer
Bemærk: Metoder til evaluering af nøjagtighed og præcision er afbildet i figur 4.
Figur 3: forskellen mellem nøjagtighed og præcision. Nøjagtighed betyder hvor tæt måling er at den sande værdi (dvs. Ag koncentration bestemmes af ICP-MS); præcision betyder repeterbarhed af måling (dvs. overensstemmelse mellem de gentagne målinger af AMG positive værdier fra afsnittene tredobbelt væv). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ordningen skildrer metoderne til evaluering af nøjagtighed og præcision. CHAA = småhvaler histologiske Ag assay; FFPE = Formalin-fast, paraffin-embedded; ICP-MS = Induktivt koblet plasma masse spektroskopi; AI = hver af Ag koncentrationerne bestemmes af ICP-MS af hvert par-matchede vævsprøve; Bi = hver af Ag koncentrationer anslået af CHAA for hvert par-matchede vævsprøve; CI, Di og Ei = hvert af The Ag koncentrationer anslået af CHAA tredobbelt prøver fra hvert par-matchede vævsprøve; Jeg = 1 til n. Se venligst rå data af nøjagtighed og præcision testene i afsnittet i repræsentative resultater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
5. bedømmelse af Ag koncentrationer af CHAA.
- Indsamle de lever og nyre væv fra strandede hvaler og ordne dem i 10% neutrale bufferet formalin.
- Behandle formalin-fast væv rutinemæssigt (Se trin 2).
- Anslå Ag koncentrationer af hvaler lever og nyre væv med ukendt Ag koncentrationer af CHAA (Se trin 3 og 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative billeder af AMG positive signaler i hvaler lever og nyre væv er vist i figur 5. AMG positive signaler omfatter trinløst mellemstore brun til sort granulat i forskellige størrelser i cytoplasma af proksimale renal tubulær epitel, hepatocytter og Kupffer celler. Lejlighedsvis, amorfe gylden gul til brun AMG positive signaler er angivet i lumen og basalmembranen af nogle proksimale renal tubuli. Der er en positiv sammenhæng mellem resultaterne af ICP-MS og AMG positivitet værdier i lever og nyre væv og lineær regression gennem oprindelse er foretrukne ekstra summen af kvadrater F test og AIC12,26, 27. I præcisionstest, betyder SDs af CHAA for lever og nyre er 3,24 og 0,16, henholdsvis. I testen præcision betyder SDs af CHAA for lever og nyre er 2,8 og 0,35, henholdsvis. De rå data af nøjagtighed og præcision testene er sammenfattet i tabel 1. AMG positive værdier, Ag koncentrationer af CHAA anslået og Ag koncentrationer målt af ICP-MS fra lever og nyre væv af disse seks strandede hvaler er opsummeret i tabel 2.
Figur 5: repræsentative histologiske billeder af AMG positive signaler i lever og nyre væv af hvaler (kontrastfarve: hæmatoxylin plet). (A) AMG positive signaler i hvaler levervæv er jævnt fordelt (Grampus griseus (Gg); buer kode: TP20111116; AG-koncentration, målt byinductively koblet plasma masse spektroskopi (ICP-MS): 21.82 μg/g tørvægt). (B) den AMG positive signaler er brun til sort granulat af forskellige sizesin cytoplasmaet af hepatocytter (røde pile) og Kupffer celler (rød pil med to hoveder) (Gg; buer kode: TP20111116). (C) et par AMG positive signaler af brun til sort granulat er vist i cytoplasmaet af hepatocytter (røde pile) (Kogia spp. (Ko); buer kode: TC20110722; AG koncentration målt af ICP-MS: 3,86 μg/g tørvægt). (D) The AMG positive signaler i hvaler nyrevæv er primært placeret i den renale cortex (Gg; buer kode: TP20111116; AG koncentration målt af ICP-MS: 0,42 μg/g tørvægt). Den sorte stiplede linie er placeret på krydset mellem de renale cortex og medulla. (E) højere magnification af figur 5 d (rød stiplet rektangel). AMG positive signaler i den renale cortex er brun til sort granulat i forskellige størrelser i cytoplasma af den proksimale renal tubulær epitel (røde pile). Amorfe gylden gul til brun AMG positive signaler er vist i lumen (rød pil hoved) og basalmembranen (gul pil hovedet) af nogle proksimale renal tubuli. Nej til minimal AMG positive signaler, som er vist i glomeruli (grøn pil) og distale renal tubuli (grøn pil hovedet) (Gg; buer kode: TP20111116). (F) spredte brune granulat i forskellige størrelser er vist i thecytoplasm af den proksimale renal tubulær epitel (røde pile) (Ko; buer kode: TC20110722; AG koncentration målt af ICP-MS: 0,05 μg/g tørvægt). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Nøjagtighed test | ||||||
| Feltnummer | Leveren | Nyre | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 16.82 | 21.82 | 4,99 | 0,64 | 0,42 | 0,22 |
| TC20110611 | 10.12 | 2,77 | 0,96 | 0,11 | 0,05 | 0,35 |
| TC20110722 | 2,70 | 3,86 | 1.15 | 0,01 | 0,05 | 0,04 |
| TD20110608 | 0,76 | 0,06 | 7,35 | 0.02 | 0,05 | 0,06 |
| TP20110830 | 13.97 | 14,93 | 4.28 | 0,69 | 1,04 | 0,24 |
| IL20110101 | 6,00 | 1.73 | 0.72 | 0,38 | 0,14 | 0,03 |
| Betyde SD | 3.24 | Betyde SD | 0,16 | |||
| Precison test | ||||||
| Feltnummer | Leveren | Nyre | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 20.90 | 21.82 | 4,08 | 0,21 | 0,42 | 0,44 |
| 16.11 | 0,22 | |||||
| 17.75 | 0,14 | |||||
| TD20110608 | 1,52 | 0,06 | 1,71 | 0,00 | 0,05 | 0.02 |
| 2,40 | 0,00 | |||||
| 1.12 | 0,00 | |||||
| TP20110830 | 13.12 | 14,93 | 2,70 | 0,45 | 1,04 | 0,59 |
| 12.50 | 0,26 | |||||
| 11,35 | 0,33 | |||||
| Betyde SD | 2,83 | Betyde SD | 0,35 | |||
| Regression ligninger af CHAA for lever og nyrer var henholdsvis Y = 2.249 × X (justeret R2 = 0,74) og Y = 0.07288 × X (justeret R2 = 0,69). | ||||||
Tabel 1: de repræsentative resultater af nøjagtighed og præcision testene for småhvaler histologiske Ag assay (CHAA). CHAA = småhvaler histologiske Ag assay, ICP-MS = Induktivt koblet plasma masse spektroskopi, SD = standardafvigelse.
| Feltnummer | Arter | Leveren | Nyre | ||||
| AMG | CHAA * | ICP-MS | AMG | CHAA * | ICP-MS | ||
| TP20111116 | Gg | 7.48 | 16.82 | 21.82 | 8.82 | 0,64 | 0,42 |
| TC20110611 | Ko | 4,50 | 10.12 | 2,77 | 1,52 | 0,11 | 0,05 |
| TC20110722 | Ko | 1,20 | 2,70 | 3,86 | 0,11 | 0,01 | 0,05 |
| TD20110608 | LH | 0,34 | 0,76 | 0,06 | 0,21 | 0.02 | 0,05 |
| TP20110830 | LH | 6.21 | 13.97 | 14,93 | 9.43 | 0,69 | 1,04 |
| IL20110101 | SA | 2,67 | 6,00 | 1.73 | 5,26 | 0,38 | 0,14 |
| Regression ligninger af CHAA for lever og nyrer var henholdsvis Y = 2.249 × X (justeret R2 = 0,74) og Y = 0.07288 × X (justeret R2 = 0,69). | |||||||
Tabel 2: The AMG positive værdier, Ag koncentrationer (μg/g, tørvægt) anslået af småhvaler histologiske Ag assay (CHAA), og Ag koncentrationer (μg/g, tørvægt) målt af ICP-MS fra lever og nyre væv af seks strandede hvaler. Gg = Grampus griseus, Ko = Kogia spp., Lh = Lagenodelphis hosei, Sa = Stenella attenuata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med artikel undersøgelse er at etablere en adjuvans metode til at evaluere Ag fordelingen på suborgan niveauer og vurdere Ag koncentrationer i hvaler væv. De nuværende protokoller omfatter 1) fastsættelsen af Ag koncentrationer i hvaler væv af ICP-MS, 2) AMG analyse af par-matchede vævsprøver med kendte Ag koncentrationer, 3) etablering af regressionsmodel (CHAA) til estimering Ag koncentrationer af AMG positive værdier, 4) vurdering af nøjagtighed og præcision af CHAA og 5) vurdering af Ag koncentrationer af CHAA.
I denne undersøgelse, blev data af ICP-MS væsentligt og positivt korreleret med de af AMG positive værdier, hvilket tyder på, at koncentrationen af Ag i hvaler væv kan estimeres ved AMG positiv værdi. CHAA, som er baseret på AMG positiv værdi og regressionsmodel, har derfor været udviklet til estimering Ag koncentrationer i lever og nyre væv af hvaler. Generelt en regressionsmodel med flere parametre (dvs. en mere kompleks regressionsmodel) passer godt ind i data, men det er uafklaret, at den mere kompleks, er faktisk bedre end den enklere. Derfor, den bedste regressionsmodel skal vælges af statistisk analyse26,27. Resultaterne af den statistiske analyse viser, at den lineære regressionsmodel er tilstrækkelige til at vurdere Ag koncentrationen baserede på AMG positiv værdi12.
I CHAA for nyrevæv var den gennemsnitlige SD (0,35) af præcision test større end for nøjagtighed test (0,16). Omvendt, i CHAA for levervævet, mean SD (2.8) af præcision test var mindre end for nøjagtighed test (3.24). Baseret på dette resultat, er det foreslået, at den ulige fordeling af AMG positive signaler og de relativt lave Ag koncentrationer i hvaler nyrevæv negativt forstyrre præcision af CHAA for nyrevæv. Derfor kan CHAA for nyrevæv være nøjagtige, men upræcise. Men den jævn fordeling af AMG positive signaler og de relativt høje Ag koncentrationer i hvaler leveren væv foreslå at CHAA for levervævet er en pålidelig metode til at anslå Ag koncentrationer i hvaler leveren væv. Desuden, hvis flere væv med kendte Ag koncentrationerne bestemmes af ICP-MS er tilgængelige, en mere nøjagtige og præcise regressionsmodel kan udvikles for at anslå Ag koncentration.
Selv om de nuværende protokoller giver en adjuvans metode til at undersøge Ag i dyrevæv, bemærkes nogle begrænsninger på metoden AMG. Første, falsk-positive AMG signaler kan præsentere på grund af interferens fra andre tungmetaller såsom kviksølv, bismuth og zink28. Resultaterne af metoden AMG skal derfor fortolkes med andre specifikke metoder, såsom ICP-MS, til at overvåge den faktiske sammensætning af tungmetaller28. Det andet er det vanskeligt at påvise en homogen måde distribueret heavy metal, fordi det kan generere lysere amorfe AMG positive signaler, som ikke kan identificeres ved visualisering under mikroskopisk undersøgelse. Desuden de amorfe og lysere AMG positive signaler er vanskelige at analysere med billede analyse software, fordi farven på AMG positive signaler kan være lig i baggrunden (f.eks., de amorfe AMG positive signaler fundet i den lumen af proksimale renal tubuli). Derfor, AMG positive signaler kan ikke blive fremhævet efter justering af cut-off værdi af tærsklen i afbildning analyse software. For det tredje fordi AMG positive værdier er baseret på procentdelen af arealet af AMG positive signaler, er det muligt, at værdierne af stærkt koncentreret tungmetaller kan være undervurderet.
FFPE prøver er relativt let at indsamle og lagre, og vores tidligere undersøgelse har vist, at den nuværende AMG metode med held kan forstærke FFPE prøver opbevares i over 15 år12. Mekanismen af AMG er ikke påvirket af forskellige dyrearter, for det har været vildt bruges i forskellige dyrearter20,29,30,31. Selv om den nuværende artikel er fokuseret på hvalerne, kan de protokoller er beskrevet her også anvendes i forskellige dyrearter. Desuden omkostningerne ved metoden AMG med ICP-MS er relativt lav (i forhold til laser ablation-ICP-MS), og dermed de nuværende protokoller er værdifulde for forskere eller lande mangler tilstrækkelig forskning, midler til at undersøge fordelingen og koncentrationen af tungmetaller i animalsk væv. Afslutningsvis, giver brugen af AMG med kvantitativ analyse til at lokalisere og semi-kvantificere tungmetaller en bekvem metode for spatio-temporale og cross-arter undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Taiwan hvaler Stranding netværk for prøvetagning og opbevaring, herunder Taiwan hvaler samfund, Taipei; Hvaler Research Laboratory (Prof. Lien-Siang Chou), Institut for økologi og evolutionær biologi, National Taiwan University, Taipei; National Museum of Natural Science (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; og Marine biologi & hvaler Research Center, National Cheng Kung University. Vi takker også skovbrug Bureau, Rådet for landbrug, Executive Yuan for deres tilladelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | --- | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers? Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , In Press (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , National Aquarium. Baltimore. 167-230 (2005).
- Shih, C. -C., Liu, L. -L., Chen, M. -H., Wang, W. -H. Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , National Sun Yat-sen University. Kaohsiung. (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
