Summary
Se presenta un protocolo para localizar Ag en tejidos de hígado y riñón cetáceos por autometallography. Además, un nuevo ensayo, llamado el análisis histológico cetáceo de Ag (CHAA) es desarrollado para estimar las concentraciones de Ag en los tejidos.
Abstract
Nanopartículas de plata (AgNPs) se han utilizado en productos comerciales, incluyendo textiles, cosméticos y artículos de salud, debido a sus fuertes efectos antimicrobianos. También se pueden liberar en el medio ambiente y se acumulan en el océano. Por lo tanto, AgNPs son la principal fuente de contaminación del Ag, y es cada vez mayor conciencia de la toxicidad ambiental de Ag. Estudios previos han demostrado la bioacumulación (de productores) y ampliación (en consumidores o predadores) de Ag. Cetáceos, como los depredadores ápice del océano, pueden haber sido afectados negativamente por los compuestos de Ag/Ag. Aunque las concentraciones de compuestos de Ag/Ag en tejidos de cetáceos pueden ser medidas por espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), el uso de ICP-MS es limitado por su alto costo de capital y los requisitos para almacenamiento y preparación de tejido. Por lo tanto, un método de autometallography (AMG) con un análisis cuantitativo de imagen mediante el uso de formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) tejido puede ser un método coadyuvante para localizar la distribución de Ag a nivel suborgan y calcular la concentración de Ag en cetáceos tejidos. Las señales positivas de AMG son principalmente marrones a negro gránulos de diferentes tamaños en el citoplasma del epitelio tubular renal proximal, hepatocitos y células de Kupffer. Ocasionalmente, se observan algunos amorfo amarillo oro a marrón señales positivas de AMG en la luz y la membrana del sótano de algunos túbulos renales proximales. El análisis para estimar la concentración de Ag es llamado el cetáceo histológica Ag ensayo (CHAA), que es un modelo de regresión establecido por los datos de análisis de imagen cuantitativo del método AMG y ICP-MS. El uso de AMG con CHAA localizar y semi-cuantificar los metales pesados proporciona una metodología conveniente para estudios espacio-temporales y entre especies.
Introduction
Nanopartículas de plata (AgNPs) se han utilizado en productos comerciales, incluyendo textiles, cosméticos y artículos de salud, debido a sus grandes efectos antimicrobianos1,2. Por lo tanto, se aumentan la producción de AgNPs y el número de productos que contengan AgNP tiempo3,4. Sin embargo, AgNPs se pueden liberar en el medio ambiente y se acumulan en el océano5,6. Se han convertido en la principal fuente de contaminación del Ag, y el conocimiento público de la toxicidad ambiental de Ag está aumentando.
El estado de AgNPs y Ag en el medio marino es complicado y cambiante. Estudios previos han indicado que AgNPs puede permanecer como partículas, agregadas, disolverán, reaccionan con diferentes especies químicas o ser regeneradas a partir de los iones de Ag+ 7,8. Varios tipos de compuestos de Ag, como AgCl, se han encontrado en sedimentos marinos, donde puede ser ingeridos por organismos bentónicos y entrar en la cadena alimentaria9,10. Según un estudio anterior realizado en la zona de la laguna Chi-ku a lo largo de la costa suroeste de Taiwán, las concentraciones de Ag de los sedimentos marinos son extremadamente baja y similar a la abundancia de la corteza, y los de tejido de hígado de pescado son generalmente por debajo de la detección límite (< 0.025 μg/g húmedo/húmedo)11. Sin embargo, estudios anteriores realizados en diferentes países han demostrado relativamente altas concentraciones de Ag en los hígados de cetáceos12,13. La concentración de Ag en los hígados de los cetáceos es dependiente de la edad, sugiriendo que la fuente de Ag en sus cuerpos es más probable es que su presa12. Estos resultados más futuros sugieren la biomagnificación de Ag en los animales en niveles tróficos superiores. Cetáceos, como los depredadores del ápice en el océano, pueden haber sufrido impactos negativos en la salud causados por compuestos de Ag/Ag12,13,14. Lo más importante, como cetáceos, los seres humanos son mamíferos y los impactos causados por compuestos de Ag/Ag en cetáceos pueden también ocurrir en seres humanos negativos para la salud. En otras palabras, cetáceos podrían ser animales Centinela para la salud del medio ambiente marino y los seres humanos. Por lo tanto, los efectos sobre la salud, distribución en los tejidos y la concentración de Ag en cetáceos son motivo de gran preocupación.
Aunque las concentraciones de compuestos de Ag/Ag en tejidos de cetáceos pueden ser medidas por espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), el uso de ICP-MS es limitado por su alto costo capital (instrumento y mantenimiento) y los requisitos para el almacenamiento de tejido /Preparation12,15. Además, es generalmente difícil recoger muestras de tejido integral en todas las investigaciones de casos de cetáceos varados debido a dificultades logísticas, falta de mano de obra y la falta de recursos relacionados12. Las muestras congeladas del tejido para análisis de ICP-MS no se almacenan fácilmente debido a espacio limitado de la refrigeración, y las muestras de tejido congelado pueden ser descartadas debido a equipo de refrigeración roto12. Estos obstáculos mencionados obstaculizan las investigaciones de los niveles de contaminación en los tejidos cetáceos por ICP-MS análisis usando muestras de tejido congelado. Por el contrario, formalina fijado muestras de tejido son relativamente fáciles de recoger durante la necropsia de los cetáceos varados muertos. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método fácil de usar y de bajo costo para detectar/medida de los metales pesados en tejidos de cetáceos mediante el uso de formalina fijado muestras de tejido.
Aunque las concentraciones de los metales alcalinos y alcalinotérreos y distribuciones de suborgan se pueden alterar durante la formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) proceso sólo menores efectos sobre los metales de transición como el Ag, han sido conocido16. Por lo tanto, tejido FFPE ha sido considerada como un recurso de muestra ideal para localización de metal y las mediciones16,17. Autometallography (AMG), un proceso histoquímico, puede amplificar los metales pesados como variable tamaño amarillo oro al negro señales positivas de AMG en secciones de tejido FFPE, y estos metales pesados amplificados se puede visualizar bajo microscopia ligera18, 19 , 20 , 21. por lo tanto, el método AMG proporciona información sobre la distribución de suborgan de metales pesados. Puede proporcionar información adicional importante para el estudio de las vías metabólicas de metales pesados en los sistemas biológicos porque ICP-MS sólo puede medir la concentración de metales pesados en el órgano nivel18. Además, el software de análisis de imagen digital, como el ImageJ, se ha aplicado para el análisis cuantitativo de las secciones de tejido histológico22,23. El amarillo dorado al negro señales positivas de AMG de las secciones de tejido FFPE tamaño variable puede ser cuantificado y utilizado para estimar las concentraciones de metales pesados. Aunque la concentración de Ag absoluta no puede determinarse directamente mediante el método AMG con análisis de imagen cuantitativo, puede ser estimado por un modelo de regresión basado en los datos obtenidos en el análisis cuantitativo de imagen e ICP-MS, que es el nombre de cetáceos análisis histológico de Ag (CHAA). Teniendo en cuenta las dificultades en la medición de las concentraciones de Ag por análisis de ICP-MS en cetáceos varados más, CHAA es un método coadyuvante valioso para estimar las concentraciones de Ag en tejidos cetáceos, que no se puede determinar por análisis de ICP-MS debido a la falta de congelados muestras de tejido. Este documento describe el protocolo de una técnica histoquímica (método de AMG) para localización de Ag a nivel suborgan y un ensayo llamado CHAA para estimar las concentraciones de Ag en los tejidos de hígado y riñón de los cetáceos.
Figura 1: Diagrama de flujo que representa la creación y aplicación de cetáceos análisis histológicos de Ag (CHAA) para estimar las concentraciones de Ag. CHAA = cetáceos análisis histológico de la Ag, FFPE = formalina-fijos, parafina-encajado, ICP-MS = plasma acoplado inductivamente espectrometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
El estudio se realizó con arreglo a las normas internacionales, y el uso de muestras de tejido de cetáceos fue autorizado por el Consejo de agricultura de Taiwán (investigación permiten 104-07,1-SB-62).
1. tejido preparación de muestras para análisis de ICP-MS
Nota: Los tejidos de hígado y riñón fueron recogidos del recién muerto y moderadamente autolyzed trenzado cetáceos24, incluyendo 6 cetáceos varados de 4 especies, 1 Grampus griseus (Gg), 2 Kogia spp (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). Cada cetáceo varado tenía un número de campo para identificación individual. La preparación de la muestra de tejido para análisis de ICP-MS siguió el método establecido en el laboratorio de M.H. Chen y laboratorio de M.H. Chen llevó a cabo el análisis de ICP-MS11,13,25.
- Recoger los tejidos de hígado y riñón para análisis de ICP-MS de cetáceos varados y almacenarlos a −20 ° C hasta su uso.
- Recoger par emparejado de hígado y tejidos de riñón del mismo trenzado de cetáceos para el análisis AMG (véase paso 2).
- Recortar la capa externa de las muestras de tejido para análisis de ICP-MS con un bisturí de acero inoxidable. Cortar la parte interna de las muestras de tejido en cubos pequeños (aproximadamente 1 cm3) y colocarlos en bolsas de plástico de la cerradura de zip. Normalmente, cada bolsa contiene 10 g de los tejidos.
- Almacenar las bolsas de plástico que contienen tejido las muestras a −20 ° C para posteriores procedimientos.
- Poner los cubos de 1 cm3 muestras en congelación en seco sistema (-50 ° C, la bomba de vacío con un desplazamiento de por lo menos 98 L/min, 0,002 mBar) durante al menos 72 h hasta totalmente seco por peso a la constante.
- Homogeneizar los cubitos secos en polvo con un homogeneizador para la digestión posterior del tejido.
- Pesan 0,3 g de liófilos homogeneizadas en botellas de politetrafluoroetileno (PTFE) de 30 mL y mezclar con 10 mL de ácido nítrico del 65% w/w.
- Poner tapas a las botellas PTFE, pero dejar los cierres aflojar.
Nota: Esto permite que el humo marrón para formar en las botellas PTFE y reflujo dentro de la botella para la digestión hasta que el humo marrón desaparece y se vuelve claro. - Calentar las muestras digeridas con una placa caliente de 30 ° C a 110/120 ° C (según el humo marrón formando condición) en la botella PTFE de 2 a 3 semanas hasta que el gas Pardo en la botella PTFE se convierte descolorido y el líquido en la botella PTFE se convierte en traslúcido gree acabado claro amarillo o totalmente claro.
Nota: Realizar el proceso de calentamiento en la campana de humos químicos. - Calentar las muestras digeridas a 120 ° C para evaporar el ácido nítrico en la botella PTFE hasta sólo 0.5-1 mL restos.
Nota: Realizar el proceso de calentamiento en una campana de humos químicos y controlar siempre el aumento de la temperatura para asegurarse de que ningún gas marrón sale de tapas de las botellas PTFE. - Apriete los cierres y enfriar a temperatura ambiente durante 1 h aproximadamente.
- Lugar los embudos con filtro papeles en matraces aforados de 25 mL y lavar el líquido restante con 1 M HNO3 hasta un volumen final de 25 mL.
Nota: Lave la botella por al menos tres veces y el cierre dos veces. - Validar la calidad analítica de los análisis de ICP-MS mediante el uso de los materiales de referencia estándar, incluyendo Callas-2 (dogfish del hígado) y dormitorio-2 (músculo dogfish).
- Usar duplicados de cada muestra analítica y triplicado de materiales de referencia estándar para análisis de ICP-MS.
- Promedio de las concentraciones de Ag de cada muestras analíticas y los datos se presentan como concentración de la base de peso seco (μg/g de peso seco).
2. tejido preparación de muestras para análisis AMG
- Recogen tejidos par emparejado de hígado y riñón para análisis AMG de un cetáceo varado y fijarlos en 10% formalina tamponada neutra hasta su uso.
Nota: Almacenar las muestras de tejido en botellas de plástico en 10% formalina tamponada neutra (NBF, pH 7.0) de 24 a 48 horas. El volumen de NBF debe ser al menos 10 veces mayor que el volumen de tejido. - El formol fijada el hígado y los tejidos del riñón con cuchillas desechables para Microtomo de acero inoxidable de recortar y poner las secciones de tejido recortado en cassettes con etiquetas.
Nota: El tamaño de las secciones de cada tejido debe ser aproximadamente 2 cm x 1 cm y el grosor de cada sección de tejido no debe exceder 3 mm. poner los tejidos de hígado y riñón del mismo individuo en el mismo cartucho. - Deshidratar el recortado secciones de tejido con un procesador de tejido a través de una serie de etanol graduado (70% durante 1 h, 80% en 1 h, 95% durante 1 h, 95% durante 2 h, 100% para 1 h x 2 platos de tinción y 100% durante 2 h), no-xileno (para 1 h y 2 h en diferentes platos tinción) y sumergir las muestras de tejido deshidratado en paraffin (para 1 h y 2 h en diferentes platos de tinción).
- Colocar las muestras de tejido deshidratado en los fondos de moldes de acero histología e incrustar las muestras de tejido deshidratado con parafina.
- Enfriar el formol fijada bloques de tejido parafina-encajado (FFPE) en placa fría hasta que la parafina se solidifica. Corte los bloques FFPE con el microtomo hasta que la superficie del tejido se expone.
- Enfriar los bloques FFPE a −20 ° C por 10 minutos sección de los bloques FFPE en 5 μm por micrótomo.
- Un baño de agua se llenan de agua doble destilada a 45 ° C. Levante las cintas de las secciones de tejido y hacerlos flotar en la superficie del agua caliente mediante pinzas y pinceles.
- Separe las cintas de las secciones de tejido con pinzas. Coloque una parte sobre un portaobjetos de microscopio.
- Coloque el microscopio en una diapositiva de calentador y permitir que las secciones secas durante la noche a 37 ° C.
- Poner los portaobjetos en estantes portaobjetos y Desparafinizar por remojo en 3 diferentes platos tinción de puro no-xileno (aproximadamente 200 a 250 mL) de 8, 5 y 3 min.
- Hidratar las secciones de tejido en bastidores de corredera por remojo en diferentes platos tinción de soluciones gradual de etanol (etanol al 100% dos veces, 90% etanol una vez y etanol al 80% una vez [1 min]) y enjuagarlos en agua doble destilada.
Nota: Estas soluciones son aproximadamente 200 a 250 mL en platos de tinción diferentes. Para cada colada, 30 segundos es suficiente. - Enjuague el tejido secciones en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0.5% Tritón X-100, lavado con PBS para varias veces y luego enjuagar en agua destilada doble.
Nota: Estas soluciones son aproximadamente 200 a 250 mL en platos de tinción diferentes. Para cada uno, 30 segundos es suficiente. - Preparar cantidades iguales de los tres componentes (iniciador, asesor y activador) proporcionados por el kit de plata mejora en oscuridad y mezclar bien.
Nota: Las soluciones de moderador y el activador son pegajosas, así que uso pipeta con aberturas de Punta ancha (o corte las puntas para crear aberturas más amplias). Para cada diapositiva, 300 μL de la solución mezclada (dependiendo del tamaño de la sección del tejido) suele ser suficiente. Por lo tanto, si se utilizan 10 muestras, la cantidad de cada componente (iniciador, asesor y activador) es 1000 μL (la solución mezclada es 3000 μL para 10 diapositivas). - Incubar las secciones de tejido en la solución mezclada durante 15 min en oscuridad a temperatura ambiente. Cubrir por completo las secciones de tejido sobre el portaobjetos con la solución mezclada. Un tiempo de incubación se puede llevar a falsos positivos AMG señales.
- Lavar los portaobjetos con agua destilada doble y teñir en hematoxilina por 10 s como un contraste.
- Lavar los portaobjetos con agua corriente, secar y montar con medio de montaje.
- Examinar los portaobjetos en un microscopio de luz.
- Captura al azar diez imágenes histológicas con un objetivo de X 40 de cada sección de tejido mediante el uso de una cámara digital conectada con software de computadora.
3. semi-cuantitativo análisis para valores positivos de AMG de imágenes histológicas
Nota: El valor positivo de AMG significa el porcentaje del área con señales positivas de AMG.
- Utilizar software de análisis de imagen (ImageJ) para analizar las imágenes histológicas.
- Abra la imagen histológica pulsando archivo | Abierto.
- Dividir la imagen solicitada en tres canales de color (rojo, azul y verde) pulsando imagen | Tipo | Pila RGB.
- Cuantificar las señales positivas de AMG utilizando el canal azul. Señales positivas falsas nucleares generalmente están disminuidas en el canal azul cuando se aplica la tinción de hematoxilina para la contratinción nuclear (figura 2).
- Medir el porcentaje del área con señales positivas de AMG en cada imagen histológica con la herramienta umbral (imagen de| Ajustar | Umbral).
- Ajustar manualmente el valor límite del umbral para cada imagen histológica (de 90 a 110) basado en la presencia de falsos positivas áreas núcleos o células de sangre rojas.
Nota: ajustar en su defecto, las señales positivas de AMG deben ser marcadas en rojo. - Prensa analizar | Establecer las mediciones dey marque la casilla de la Fracción de área para especificar que se registra la fracción de área.
- Prensa analizar | Medida. El área porcentual positivo de cada imagen histológica se muestra en la columna de % área de la ventana de resultados .
- Promedio de las áreas porcentajes positivo de 10 imágenes histológicas de cada sección de tejido y definir el resultado como el valor positivo de AMG para cada sección de tejido.
Figura 2: la presencia de señales positivas falsas nucleares bajo canales de diferente color (contraste: tinción hematoxilina). Representante nucleares falsas señales positivas se indican con flechas amarillas. PPA = positivo porcentaje de áreas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. establecimiento de la prueba de Ag histológica cetáceos (CHAA) por el modelo de regresión
Nota: El siguiente análisis se realiza en prisma 6.01 para Windows.
- Evaluar la correlación entre los resultados del ICP-MS y valores positivos de AMG.
- Abra el software, crear un nuevo archivo de proyecto y elija XY y correlación.
- Datos de entrada los resultados de la ICP-MS y AMG valores positivos.
- Análisis de prensa y escoge la correlación dentro de la categoría Análisis de XY para analizar la fuerza de asociación entre los resultados de la ICP-MS y valores positivos de AMG por análisis de correlación de Pearson.
Nota: Los resultados de la ICP-MS y valores positivos de AMG han positivamente correlacionados entre sí; de lo contrario, el modelo de regresión posterior no debe ser desarrollado. - Comparar estadísticamente los modelos de regresión, incluyendo la regresión lineal, regresión cuadrática, regresión cúbica y regresión lineal a través del origen, a través de estadísticas software12,26,27.
Nota: Si el modelo de regresión genera una concentración de Ag poco realista, el modelo de regresión debe ser abandonada12. - Volver a la tabla de datos (panel izquierdo) y análisis de prensa | Regresión no lineal (curva de ajuste) en la categoría Análisis XY | OK.
- En la ventana de parámetros: regresión no lineal, elegir el modelo de regresión diferentes en la página de ajuste y luego comparar modelos de regresión diferentes en la página comparar.
- En la página de comparar, elegir los métodos de comparación, incluyendo la prueba de F extra suma de cuadrados y criterio de información de Akaike (AIC). Según los resultados de los métodos de comparación, utilice un modelo de regresión relativamente apropiado en el CHAA.
- Estimar las concentraciones de Ag de los tejidos de hígado y riñón cetáceos con las concentraciones de Ag desconocidas usando la CHAA.
- Evaluar la exactitud y precisión de la CHAA para hígado y los tejidos del riñón. La diferencia entre precisión y exactitud se ilustra en la figura 3.
- Exactitud: Calcular la media desviación estándar (SD) de las diferencias entre las concentraciones de Ag conocidas y estimadas.
- Precisión: Realizar medición repetida (al menos por triplicado) de valores positivos de AMG de secciones seriadas de los mismo tejidos FFPE. Calcular la media SD de las mediciones de los tejidos de hígado o riñón de las diferencias entre las concentraciones de Ag conocidas y estimadas
Nota: Los métodos de evaluación de la exactitud y precisión se muestran en la figura 4.
Figura 3: la diferencia entre exactitud y precisión. Precisión significa lo cerca la medición el valor verdadero (es decir, concentración de Ag determinado por ICP-MS); precisión significa la repetibilidad de la medida (es decir, la consistencia entre medidas repetidas de valores positivos de AMG de las secciones de tejido por triplicado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: esquema que representa los métodos de evaluación de la exactitud y precisión. CHAA = cetáceos histológico análisis de Ag; FFPE = formalina-fijos, parafina-encajado; ICP-MS = plasma acoplado inductivamente espectrometría de masas; AI = cada una de las concentraciones de Ag determinadas por ICP-MS cada par emparejado de muestra de tejido; BI = cada una de las concentraciones de Ag estimadas por CHAA cada par emparejado de muestra de tejido; CI, Di y Ei = cada una de las concentraciones de Ag el estimado por CHAA de muestras por triplicado de cada muestra de tejido par emparejado; i = 1 a n. Ver datos de las pruebas de exactitud y precisión en la sección de resultados representativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. estimación de las concentraciones de Ag por CHAA.
- Recoger los tejidos de hígado y riñón de cetáceos varados y fijar en 10% formalina tamponada neutra.
- Procesar periódicamente los tejidos fijados con formol (véase paso 2).
- Estimar las concentraciones de Ag de los tejidos de hígado y riñón cetáceos con las concentraciones de Ag desconocidas por CHAA (ver pasos 3 y 4).
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Representative Results
Imágenes representativas de las señales positivas de AMG en los tejidos del hígado y del riñón del cetáceos se muestran en la figura 5. Las señales positivas de AMG incluyen marrón de tamaño variable a los gránulos negros de varios tamaños en el citoplasma del epitelio tubular renal proximal, hepatocitos y células de Kupffer. En ocasiones, amorfo amarillo oro a marrón señales positivas de AMG se observan en la luz y la membrana del sótano de algunos túbulos renales proximales. Hay una correlación positiva entre los resultados del ICP-MS y valores de positividad AMG en hígado y en tejidos de riñón y regresión lineal a través de origen es recomendado: según la prueba de F extra suma de cuadrados y AIC12,26, 27. En la prueba de la exactitud, la media SDs de CHAA de hígado y riñón son 3.24 y 0.16, respectivamente. En la prueba de precisión, la media SDs de CHAA de hígado y riñón son 2.8 y 0,35, respectivamente. Los datos brutos de las pruebas de exactitud y precisión se resumen en la tabla 1. Los valores positivos de AMG, las concentraciones de Ag estimadas por CHAA y concentración de Ag medida por ICP-MS de los tejidos de hígado y riñón de estos cetáceos varados seis se resume en la tabla 2.
Figura 5: imágenes histológicas representativas de las señales positivas de AMG en los tejidos de hígado y riñón de los cetáceos (contratinción: tinción hematoxilina). (A) las señales positivas de AMG en el tejido hepático cetáceo están distribuidas uniformemente (Grampus griseus (Gg); campo Código: TP20111116; AG concentración medida byinductively juntada plasma espectroscopia de masas (ICP-MS): 21.82 μg/g peso seco). (B) señales positivas de la AMG son de color marrón a negro granulado de diferentes sizesin el citoplasma de hepatocitos (flechas rojas) y células de Kupffer (cabezas de flecha roja) (Gg; campo Código: TP20111116). (C) algunas señales positivas AMG de color marrón a negro gránulos aparecen en el citoplasma de hepatocitos (flechas rojas) (Kogia spp (Ko); campo Código: TC20110722; Concentración de AG medida por ICP-MS: 3,86 μg/g peso seco). (D) señales positivas de la AMG en tejido renal de cetáceos se encuentran principalmente en la corteza renal (Gg; campo Código: TP20111116; Concentración de AG medida por ICP-MS: 0.42 μg/g peso seco). La línea punteada negra se coloca en el cruce de la corteza renal y médula. (E) magnification superior de la figura 5 (rectángulo discontinuo rojo). Las señales positivas de AMG en la corteza renal son de color marrón a negro gránulos de diferentes tamaños en el citoplasma del epitelio tubular renal proximal (flechas rojas). Amorfo amarillo oro a marrón señales positivas de AMG se muestran en los lúmenes (cabeza de flecha roja) y membrana del sótano (cabeza de flecha) de algunos túbulos renales proximales. No a AMG mínimo se muestran señales positivas en los glomérulos (flecha verde) y los túbulos renales distales (verde punta de flecha) (Gg; campo Código: TP20111116). (F) en thecytoplasm del epitelio tubular renal proximal (flechas rojas) se muestran dispersos gránulos marrones de diferentes tamaños (Ko; campo Código: TC20110722; Concentración de AG medida por ICP-MS: 0.05 μg/g peso seco). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Test de precisión | ||||||
| Número de campo | Hígado | Riñón | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 16.82 | 21.82 | 4.99 | 0,64 | 0.42 | 0.22 |
| TC20110611 | 10.12 | 2.77 | 0.96 | 0.11 | 0.05 | 0.35 |
| TC20110722 | 2.70 | 3,86 | 1.15 | 0.01 | 0.05 | 0.04 |
| TD20110608 | 0,76 | 0.06 | 7.35 | 0.02 | 0.05 | 0.06 |
| TP20110830 | 13.97 | 14.93 | 4.28 | 0.69 | 1.04 | 0.24 |
| IL20110101 | 6.00 | 1.73 | 0,72 | 0.38 | 0.14 | 0.03 |
| Media SD | 3.24 | Media SD | 0.16 | |||
| Prueba de Precision | ||||||
| Número de campo | Hígado | Riñón | ||||
| CHAA * | ICP-MS | SD | CHAA * | ICP-MS | SD | |
| TP20111116 | 20.90 | 21.82 | 4.08 | 0.21 | 0.42 | 0.44 |
| 16.11 | 0.22 | |||||
| 17,75 | 0.14 | |||||
| TD20110608 | 1.52 | 0.06 | 1.71 | 0.00 | 0.05 | 0.02 |
| 2.40 | 0.00 | |||||
| 1.12 | 0.00 | |||||
| TP20110830 | 13.12 | 14.93 | 2.70 | 0.45 | 1.04 | 0,59 |
| 12.50 | 0.26 | |||||
| 11,35 | 0.33 | |||||
| Media SD | 2.83 | Media SD | 0.35 | |||
| * Las ecuaciones de regresión de CHAA de hígados y riñones fueron respectivamente Y = 2.249 × X (ajustado R2 = 0.74) y Y = 0.07288 x X (ajustado R2 = 0,69). | ||||||
Tabla 1: resultados representativos de las pruebas de exactitud y precisión para análisis histológico cetáceos del Ag (CHAA). CHAA = cetáceos histológico análisis de Ag, ICP-MS = plasma acoplado inductivamente espectrometría de masas, SD = desviación estándar.
| Número de campo | Especies | Hígado | Riñón | ||||
| AMG | CHAA * | ICP-MS | AMG | CHAA * | ICP-MS | ||
| TP20111116 | GG | 7.48 | 16.82 | 21.82 | 8.82 | 0,64 | 0.42 |
| TC20110611 | Ko | 4.50 | 10.12 | 2.77 | 1.52 | 0.11 | 0.05 |
| TC20110722 | Ko | 1.20 | 2.70 | 3,86 | 0.11 | 0.01 | 0.05 |
| TD20110608 | LH | 0.34 | 0,76 | 0.06 | 0.21 | 0.02 | 0.05 |
| TP20110830 | LH | 6.21 | 13.97 | 14.93 | 9.43 | 0.69 | 1.04 |
| IL20110101 | SA | 2.67 | 6.00 | 1.73 | 5,26 | 0.38 | 0.14 |
| * Las ecuaciones de regresión de CHAA de hígados y riñones fueron respectivamente Y = 2.249 × X (ajustado R2 = 0.74) y Y = 0.07288 x X (ajustado R2 = 0,69). | |||||||
Tabla 2: valores positivos de la AMG, las concentraciones de Ag (μg/g, peso seco) estimaron por análisis histológico cetáceos del Ag (CHAA) y las concentraciones de Ag (μg/g, peso seco) medición por ICP-MS del hígado y el riñón tejidos seis cetáceos varados. GG = Grampus griseus, Ko = Kogia spp., Lh = Lagenodelphis hosei, Sa = Stenella attenuata.
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Discussion
El propósito del artículo estudio es establecer un método coadyuvante para evaluar la distribución de Ag a nivel suborgan y para estimar las concentraciones de Ag en tejidos cetáceos. Los protocolos actuales incluyen 1) determinación de las concentraciones de Ag en tejidos cetáceos por ICP-MS, análisis 2) AMG de muestras de tejido par emparejado con concentraciones conocidas de Ag, 3) el establecimiento del modelo de regresión (CHAA) para estimar las concentraciones de Ag por valores positivos de AMG, 4) evaluación de la exactitud y precisión de CHAA y 5) las concentraciones de la estimación de Ag por CHAA.
En este estudio, los datos de ICP-MS fueron significativamente y positivamente correlacionados con los valores positivos de AMG, lo que sugiere que la concentración de Ag en tejidos cetáceos puede estimarse el valor positivo de AMG. Por lo tanto, se ha desarrollado la CHAA, que se basa en el valor positivo de AMG y el modelo de regresión, para estimar las concentraciones de Ag en los tejidos de hígado y riñón de los cetáceos. Por lo general, un modelo de regresión con más parámetros (es decir, un modelo de regresión más complejo) se adapta bien en los datos, pero es indeterminado que el más complejo es realmente mejor que el más simple. Por lo tanto, se debe elegir el mejor modelo de regresión en análisis estadístico26,27. Los resultados de los análisis estadísticos indican que el modelo de regresión lineal es suficiente para estimar la concentración de Ag basada en el valor positivo de AMG12.
En CHAA de tejido renal, el SD Media (0,35) de la prueba de precisión fue mayor que la de la prueba de exactitud (0.16). Por el contrario, en CHAA de tejido del hígado, la SD Media (2.8) de la prueba de precisión era más pequeño que el de la prueba de exactitud (3.24). Basado en este resultado, se sugiere que la desigual distribución de las señales positivas de AMG y las relativamente bajas concentraciones de Ag en el tejido renal cetáceos interferir negativamente en la precisión de CHAA de tejido renal. Por lo tanto, la CHAA de tejido del riñón puede ser exactos pero imprecisos. Sin embargo, la distribución uniforme de las señales positivas de AMG y las relativamente altas concentraciones de Ag en tejidos del hígado cetáceos sugieren que la CHAA de tejido hepático es un método confiable para estimar las concentraciones de Ag en tejidos del hígado cetáceos. Además, si hay más los tejidos con concentraciones conocidas de Ag determinados por ICP-MS, se puede desarrollar un modelo de regresión más preciso y exacto para estimar la concentración de Ag.
Aunque los protocolos actuales proporcionan un método coadyuvante para investigar Ag en tejidos animales, cabe señalar algunas limitaciones en el método AMG. Señales AMG en primer lugar, falsos positivos pueden presentar debido a la interferencia de otros metales pesados, como mercurio, bismuto y zinc28. Por lo tanto, los resultados del método AMG tienen que interpretarse con otros métodos específicos, como ICP-MS, para monitorear la composición real de los metales pesados28. En segundo lugar, es difícil de detectar un metal pesado homogéneamente distribuido porque pueden generar más brillantes amorfo AMG señales positivas, que no pueden ser identificadas por visualización bajo examinación microscópica. Además, las señales positivas de la AMG amorfas y brillantes son difíciles de analizar con el software de análisis de imagen porque el color de las señales positivas de AMG puede ser similar a la del fondo (por ej., las señales positivas de AMG amorfas se encuentran en la Lumen de los túbulos renales proximales). Por lo tanto, no pueden destacarse las señales positivas de AMG después del ajuste del valor límite del umbral en el software de análisis de imagen. En tercer lugar, porque los valores positivos de AMG se basan en el porcentaje del área de señales positivas de AMG, es posible que los valores de metales pesados altamente concentrados pueden ser subestimados.
Son relativamente fáciles de recolectar y almacenar muestras FFPE, y nuestro estudio anterior ha demostrado que el método actual de AMG con éxito puede amplificar muestras FFPE almacenadas por más de 15 años12. El mecanismo de AMG no es afectado por diferentes especies de animales, porque se ha utilizado violentamente en varias especies animales20,29,30,31. Aunque el artículo actual se centra en los cetáceos, los protocolos descritos aquí pueden usarse en diferentes especies animales. Además, el costo del método AMG con ICP-MS es relativamente bajo (en comparación con el láser ablación-ICP-MS) y así los protocolos actuales son valiosos para los investigadores o países que carecen de suficiente investigación financiación para investigar la distribución y concentración de metales pesados en los tejidos animales. En conclusión, el uso de AMG con análisis cuantitativo para localizar y semi-cuantificar los metales pesados proporciona una metodología conveniente para estudios espacio-temporales y entre especies.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la red de varamientos Taiwán cetáceos para recogida de muestras y almacenamiento, incluyendo la sociedad de cetáceos de Taiwán, Taipei; el laboratorio de investigación de cetáceos (Prof. Lien-Siang Chou), el Instituto de Ecología y biología evolutiva, Universidad Nacional de Taiwán, Taipei; el Museo Nacional de Ciencias naturales (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; Biología Marina y centro de investigación de cetáceos, Universidad Nacional Cheng-Kung. También agradecemos a la oficina forestal, Consejería de agricultura, Yuan Ejecutivo su permiso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | --- | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
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