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Autometallography 在鲸目组织中的定位和半定量银的应用

doi: 10.3791/58232 Published: October 4, 2018

Summary

本文提出了 autometallography 在鲸鱼肝和肾脏组织中定位银的协议。此外, 还开发了一种新的检测方法, 名为鲸类组织学 ag 测定 (CHAA), 用以估计这些组织中的银浓度。

Abstract

银纳米粒子 (AgNPs) 已广泛用于商业产品, 包括纺织品, 化妆品和保健项目, 由于其强大的抗菌作用。它们也可能被释放到环境中并积聚在海洋中。因此, AgNPs 是银污染的主要来源, 公众对银的环境毒性的认识也在增加。以往的研究表明, Ag 的生物积累 (生产者) 和放大 (在消费者/掠食者)。鲸类动物作为海洋的顶点捕食者, 可能受到银/银化合物的负面影响。虽然在鲸类组织中, 银/银化合物的浓度可以用电感耦合等离子体质谱 (icp-ms) 来测量, 但由于其高昂的资本成本和对组织贮存/准备的要求, 采用 icp-ms 的方法受到限制。因此, 用福尔马林固定、石蜡嵌入 (FFPE) 组织进行图像定量分析的 autometallography (AMG) 方法可以作为一种辅助方法, 在 suborgan 水平上定位银的分布, 估计鲸的银浓度。组织。AMG 阳性信号主要为棕色至近端肾小管上皮、肝细胞和枯否细胞细胞质中各种大小的黑色颗粒。有时, 一些非晶金黄色到褐色 AMG 阳性信号在一些近端肾小管的腔内和基底膜中被注意到。测定银浓度的方法被命名为鲸的组织学 Ag 检测 (CHAA), 它是由 AMG 方法和 ICP-MS 的图像定量分析数据建立的回归模型。使用 AMG 与 CHAA 的本地化和半定量重金属为时空和跨物种研究提供了一个方便的方法。

Introduction

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银纳米粒子 (AgNPs) 已广泛用于商业产品, 包括纺织品, 化妆品和保健项目, 由于其巨大的抗菌作用1,2。因此, AgNPs 的生产和 AgNP 产品的数量随着时间的推移增加了3,4。然而, AgNPs 可能被释放入环境并且积累在海洋5,6。它们已成为银污染的主要来源, 公众对银的环境毒性的认识正在增加。

AgNPs 和 Ag 在海洋环境中的地位是复杂和不断变化的。以前的研究表明, AgNPs 可以保持为颗粒, 聚合, 溶解, 反应与不同的化学物种, 或从 Ag+离子再生7,8。在海洋沉积物中发现了几种类型的 Ag 化合物, 如 AgCl, 它们可以被底栖生物摄取, 进入食物链9,10。根据此前在台湾西南海岸的池畔泻湖区进行的一项研究, 海洋沉积物的 Ag 浓度极低, 与地壳丰度相似, 而鱼肝组织的含量通常低于检测限量 (< 0.025 微克/克湿/湿)11。然而, 以往在不同国家进行的研究表明, 鲸类动物1213的肝脏中的银浓度相对较高。鲸类肝脏中的银浓度是年龄依赖性的, 这表明它们体内的 ag 的来源很可能是它们的猎物12。这些发现进一步表明生物放大作用的动物在较高的营养水平。鲸类动物作为海洋中的最顶端掠食者, 可能遭受了银/银化合物121314造成的负面健康影响。最重要的是, 像鲸目动物一样, 人类是哺乳动物, 在鲸类中银/银化合物造成的负面健康影响也可能发生在人类身上。换言之, 鲸类动物可以作为海洋环境和人类健康的哨兵。因此, 鲸类动物的健康效应、组织分布和浓度均备受关注。

虽然在鲸类组织中, 银/银化合物的浓度可以用电感耦合等离子体质谱 (icp-ms) 来测量, 但 icp-ms 的使用受其高昂的资本成本 (仪器和维护) 的限制, 以及对组织贮存的要求/准备12,15。此外, 由于后勤困难、人手不足和缺乏相关资源12, 在所有调查滞留鲸类病例时, 通常难以收集综合组织样本。由于制冷空间有限, 冷冻组织样品不容易储存, 冷冻组织样品可能因制冷设备损坏12而被丢弃。上述这些障碍阻碍了用冷冻组织样品分析 ICP-质谱法研究鲸类组织中的污染水平。相比之下, 福尔马林固定的组织样本相对容易收集在尸检的死滞留鲸目动物。因此, 有必要开发一种简便、廉价的方法, 用福尔马林固定组织样品检测鲸鱼组织中的重金属。

尽管在福尔马林固定、石蜡嵌入 (FFPE) 过程中, 碱和碱性地球金属的 suborgan 分布和浓度可能会发生变化, 但对过渡金属 (如 Ag) 的影响只有较小的16。因此, FFPE 组织已被认为是一个理想的样品资源的金属定位和测量16,17。Autometallography (AMG), 一个组织化学的过程, 可以放大重金属作为变大小的金黄色到黑色 AMG 阳性信号在 FFPE 切片, 这些放大的重金属可以在光显微镜下可视化18,19,20,21. 因此, AMG 方法提供了有关重金属 suborgan 分布的信息。它可以为研究生物系统中重金属的代谢途径提供重要的补充信息, 因为 ICP-MS 只能测量器官18级的重金属浓度。此外, 数字图像分析软件, 如 ImageJ, 已应用于组织学组织切片的定量分析22,23。FFPE 组织切片的变大小金黄色到黑色 AMG 阳性信号可以量化并用于估计重金属的浓度。虽然绝对 Ag 浓度不能直接由 AMG 方法确定的图像定量分析, 它可以估计的一个回归模型的基础上得到的数据从图像定量分析和 ICP-MS, 这是命名为鲸组织学 Ag 化验 (CHAA)。考虑到大多数滞留鲸类中的 icp-ms 分析测定银浓度的困难, CHAA 是评估鲸类组织中银浓度的一种宝贵的佐剂方法, 由于缺乏冷冻而不能由 icp 分析确定。组织样本。本文介绍了一种组织化学技术 (AMG 方法) 在 suborgan 水平上定位银的协议, 以及一个名为 CHAA 的测定鲸类肝脏和肾脏组织中银浓度的实验。

Figure 1
图 1: 描述了鲸的组织学 ag 测定 (CHAA) 的建立和应用的流程图, 用于估计银浓度.CHAA = 鲸目组织学 Ag 化验, FFPE = 福尔马林固定, 石蜡嵌入, ICP-MS = 电感耦合等离子质谱。请单击此处查看此图的较大版本.

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Protocol

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这项研究是按照国际准则进行的, 台湾农业理事会允许使用鲸目组织样本 (研究许可证 104-07.1-62)。

1. ICP-MS 分析的组织样品制备

注: 肝脏和肾脏组织从新鲜死和适度自溶搁浅鲸目动物24, 包括6只搁浅鲸类4不同的种类, 1鲸灰色(Gg), 2 Kogia (高), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella 白太镐(Sa)。每只搁浅的鲸目都有一个字段编号用于个体识别。icp-ms 分析的组织样品制备遵循 M.H. 实验室建立的方法, M.H. 实验室进行了 icp-ms 分析111325

  1. 收集肝和肾脏组织的 ICP-MS 分析从搁浅鲸类和储存在−20°c, 直到使用。
  2. 从相同的滞留鲸目中收集配对的肝脏和肾脏组织, 用于 AMG 分析 (请参见步骤 2)。
  3. 用不锈钢手术刀修剪为 ICP-MS 分析收集的组织样品外层。将组织样品的内部部分切成小立方体 (约1厘米3), 放在拉链锁塑料袋中。通常, 每个袋子含有10克的组织。
  4. 将含有组织样品的塑料袋存放在−20°c, 供后续手术用。
  5. 将 1 cm3立方体样品放在冷冻干燥系统中 (-50 °c, 真空泵的位移至少为98升/分, 0.002 毫巴), 至少有72小时, 直到完全干燥通过称量到常数。
  6. 将干燥的立方体融汇成粉末, 然后进行组织消化。
  7. 在30毫升聚四氟乙烯 (PTFE) 瓶中称量0.3 克均匀化冷冻干燥样品, 并将其与10毫升的65% 瓦特/w 硝酸混合。
  8. 把瓶盖放在聚四氟乙烯瓶上, 但不要关闭 untightened。
    注: 这使得棕烟形成在聚四氟乙烯瓶和回流瓶内, 以消化, 直到棕色的烟雾消失, 并打开清晰。
  9. 加热被消化的样品与一个热的板材, 从30°c 到110/120 °c (根据褐色烟形成情况) 在 ptfe 瓶2到3星期直到褐色气体在聚四氟乙烯瓶变得无色, 并且液体在聚四氟乙烯瓶变得半透明格力nish 淡黄色或完全清晰。
    注: 在化学油烟机中进行加热过程。
  10. 将所消化的样品加热120摄氏度, 将 PTFE 瓶中的硝酸蒸发, 直到 0.5-1 毫升保持。
    注: 在化学油烟机中执行加热过程, 并始终监测温度的增加, 以确保没有褐色气体泄漏聚四氟乙烯瓶的关闭。
  11. 收紧关闭和冷却他们在室温约1小时。
  12. 放置漏斗与过滤器纸在25毫升容量烧瓶和洗涤剩余的液体与 1 M HNO3到最后容量25毫升。
    注: 清洗瓶至少三次, 并关闭两次。
  13. 采用标准参考材料, 包括 DOLT-2 (dogfish 肝) 和 DORM-2 (dogfish 肌), 验证 ICP-MS 分析的分析质量。
  14. 使用每种分析样品的重复性和标准参考材料的 triplicates, 用于 ICP-MS 分析。
  15. 平均每个分析样品的 Ag 浓度并且当前数据作为干重量依据浓度 (微克/克干重)。

2. AMG 分析用组织样品准备

  1. 收集一对匹配的肝和肾脏组织的 AMG 分析从搁浅鲸, 并修复他们在10% 中性缓冲福尔马林, 直到使用。
    注: 在10% 中性缓冲福尔马林 (NBF, pH 值 7.0) 的塑料瓶中贮存组织样本24至48小时。NBF 的体积应至少比组织体积大10倍。
  2. 用不锈钢一次性切片刀片修剪福尔马林固定的肝脏和肾脏组织, 并将修剪过的组织切片放入带标签的盒中。
    注: 每个组织切片的大小应约为2厘米 x 1 厘米, 每个组织切片的厚度不应超过3毫米. 将同一个人的肝脏和肾脏组织放在同一盒中。
  3. 通过一系列分级乙醇 (70% 为1小时), 用组织处理器脱水修剪过的组织切片, 80% 为 1 h, 95% 为 1 h, 95% 为 2 h, 100% 为 1 h x 2 染色盘和100% 为 2 h), 非二甲苯 (为 1 h 和 2 h 在不同的染色盘), 将脱水组织样品浸泡在 paraffin 中 (在不同的染色皿中为1小时和2小时)。
  4. 将脱水组织样品放在钢组织学模型的底部, 用石蜡将脱水组织标本嵌入。
  5. 将福尔马林固定的石蜡嵌入 (FFPE) 组织块放在冷板上, 直到石蜡凝固。用切片修剪 FFPE 块, 直到暴露出组织表面。
  6. 冷却的 FFPE 块在−20°c 10 分钟的 FFPE 块在5µm 切片。
  7. 用双蒸馏水在45摄氏度的水浴中填充。抬起组织切片的丝带, 用镊子和刷子使它们漂浮在温水的表面上。
  8. 用镊子将组织切片的丝带隔开。将一节放到显微镜幻灯片上。
  9. 将显微镜幻灯片放在一张较暖和的滑梯上, 允许切片在37摄氏度的一夜之间晾干。
  10. 将显微镜幻灯片放在幻灯片架中, 并将它们浸泡在3种不同的纯非二甲苯 (大约200至250毫升) 的染色盘中, 用于8、5和3分钟。
  11. 将切片中的组织切片浸泡在不同的分级乙醇溶液 (100% 乙醇两次、90% 乙醇一次和80% 乙醇一次 [1 分钟]) 的染色盘中, 并用双蒸馏水冲洗。
    注意: 这些溶液在不同的染色皿中大约有200到250毫升。每洗一次, 30 秒就够了。
  12. 用0.5% 海卫 X-100 冲洗磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中的组织切片, 用 PBS 冲洗几次, 然后用双蒸馏水冲洗。
    注意: 这些溶液在不同的染色皿中大约有200到250毫升。每30秒就够了
  13. 准备等量的三组分 (发起人, 调解人, 和活化剂) 提供的银增强套件在黑暗和彻底混合。
    注意: 版主和活化剂的解决方案是粘性的, 所以请使用宽尖端开口的吸管 (或削减提示, 以创建更广泛的开口)。对于每张幻灯片, 300 ul 的混合溶液 (取决于组织切片的大小) 通常是足够的。因此, 如果使用10张幻灯片, 则每个组件 (发起方、版主和激活器) 的数量为 1000 ul (混合解决方案为10张幻灯片 3000 ul)。
  14. 在室温下在黑暗中孵育15分钟的混合溶液中的组织切片。用混合溶液完全覆盖幻灯片上的组织部分。更长的潜伏期可能导致假阳性的 AMG 信号。
  15. 用双蒸馏水冲洗这些滑梯, 并在十年代作为 counterstain 的苏木精染色。
  16. 用自来水冲洗幻灯片, 晾干, 然后装上安装介质。
  17. 在光显微镜下检查幻灯片。
  18. 通过使用连接的数码相机和计算机成像软件, 随机捕获十个组织切片中的40X 物镜的组织学图像。

3. 组织学图像 AMG 阳性值的半定量分析方法

注意: amg 正值表示区域中具有 AMG 正则信号的百分比。

  1. 利用图像分析软件 (ImageJ) 对组织学图像进行分析。
  2. 按文件打开组织学图像|打开
  3. 按下图像将所选图片拆分为三色通道 (红色、蓝色和绿色) |类型 |RGB 堆栈.
  4. 使用蓝色通道量化 AMG 正则信号。当应用苏木素染色用于核 counterstain 时, 在蓝通道下, 核假阳性信号通常会减少 (图 2)。
  5. 用阈值工具测量每个组织学图像中的 AMG 阳性信号区域的百分比 (图像 |调整 |阈值)。
  6. 根据细胞核和/或红细胞中假阳性区的存在, 手动调整每个组织学图像的阈值 (从90到 110)。
    注意: 在默认设置中, AMG 正则信号应以红色突出显示。
  7. 新闻分析 |设置测量, 并检查区域分数的框, 以指定区域分数被记录。
  8. 新闻分析 |措施。每个组织学图像的正百分比区域显示在结果窗口的%Area列中。
  9. 平均每个组织切片的10个组织学图像的正百分比区域, 并将结果定义为每个组织切片的 AMG 阳性值。

Figure 2
图 2: 在不同颜色通道下存在核假阳性信号 (counterstain: 苏木精染色).有代表性的核假阳性信号用黄色箭头表示。在区域中的正百分比。请单击此处查看此图的较大版本.

4. 用回归模型建立鲸的组织学 Ag 测定 (CHAA)

注: 下面的分析以棱镜6.01 为窗口进行。

  1. 评价 ICP-MS 和 AMG 阳性值的结果之间的相关性。
  2. 打开软件, 创建一个新的项目文件, 然后选择XY相关性.
  3. 输入数据, 包括 ICP-MS 和 AMG 正值的结果。
  4. XY 分析的范畴下, 按分析和选择相关关系, 通过皮尔逊相关分析分析了 ICP-MS 和 AMG 阳性值之间的关联强度。
    注: ICP-MS 和 AMG 阳性值的结果必须相互正相关;否则, 不应开发后续的回归模型。
  5. 通过统计软件122627, 对回归模型进行统计比较, 包括线性回归、二次回归、立方回归和线性回归。
    注: 如果回归模型产生不真实的 Ag 浓度, 回归模型应该被摒弃12
  6. 返回数据表 (左面板), 然后按分析|非线性回归 (曲线拟合)XY 分析范畴下 |的。
  7. 在窗口参数: 非线性回归, 选择不同的回归模型在页面拟合, 然后比较不同的回归模型在页面比较
  8. 在 "页面比较" 中, 选择比较方法, 包括额外的二乘法 F 测试和 Akaike 的信息标准 (AIC)。根据比较方法的结果, 在 CHAA 中使用相对合适的回归模型。
  9. 用 CHAA 估计银浓度未知的鲸肝和肾脏组织的 ag 浓度。
  10. 评价肝肾组织 CHAA 的准确性和精密度。精度和精度的区别如图 3所示。
  11. 精度: 从已知和估计的 Ag 浓度之间的差异计算平均标准差 (SD)。
  12. 精度: 重复测量 (至少三个) 的 AMG 阳性值的连续部分从相同的 FFPE 组织。从已知和估计的 Ag 浓度的差异计算肝脏或肾脏组织测量的平均 SD
    注: 计算精度和精度的方法如图 4所示。

Figure 3
图 3: 精度和精度的区别.准确度是指测量的接近度与真实值 (ICP-MS 确定的 Ag 浓度) 的关系;精确度是指测量的重复性 (从三个组织部分的 AMG 阳性值的重复测量中的一致性)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 描述评估精度和精度的方法的方案.CHAA = 鲸目组织学 Ag 测定;FFPE = 福尔马林固定, 石蜡嵌入;电感耦合等离子体质谱;Ai = 每对配对组织样品的 ICP-MS 测定的银浓度;CHAA 每对配对组织样本估计的每一个银浓度;Ci、Di 和 Ei = 每对配对组织样本 CHAA 的三份样品所估计的银浓度;我 = 1 到 n。请参阅原始数据的准确性和精确度测试在部分的代表性结果。请单击此处查看此图的较大版本.

5. CHAA 对银浓度的估计。

  1. 从滞留的鲸目动物中收集肝脏和肾脏组织, 并将其固定在10% 中性缓冲福尔马林中。
  2. 例行处理福尔马林固定组织 (请参阅步骤 2)。
  3. 用 CHAA 估计银浓度未知的鲸肝和肾脏组织的银浓度 (请参阅步骤3和 4)。

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Representative Results

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图 5显示了鲸鱼肝和肾脏组织中 AMG 阳性信号的代表性图像。AMG 阳性信号包括在肾小管上皮、肝细胞和枯否细胞的细胞质中, 大小不一的褐色到不同尺寸的黑色颗粒。有时, 一些近端肾小管的腔内和基底膜上都有非晶金黄色到褐色 AMG 阳性信号。肝肾组织中的 ICP 阳性值与其结果呈正相关, 而线性回归则根据额外的平方 F 试验和 AIC1226 27。在准确度测试中, 肝肾 CHAA 平均 SDs 分别为3.24 和0.16。在精密试验中, 肝肾 CHAA 平均 SDs 分别为2.8 和0.35。表 1概述了精度和精度测试的原始数据。表 2总结了 AMG 阳性值、CHAA 估计的 ag 浓度、以及由这六只滞留鲸类的肝脏和肾脏组织中的电感耦合等离子体质谱测定的 ag 浓度。

Figure 5
图 5: 鲸目动物肝脏和肾脏组织中 AMG 阳性信号的代表性组织学图像 (counterstain: 苏木精染色)。(A)鲸目肝组织的 AMG 阳性信号均匀分布 (鲸灰色(Gg); field 代码: TP20111116;Ag 浓度测量 byinductively 耦合等离子体质谱 (ICP-MS): 21.82 微克/克干重)。(B) AMG 阳性信号为棕色至各种 sizesin 的黑色颗粒, 肝细胞胞浆 (红色箭头) 和枯否细胞 (红色箭头头) (Gg; field 代码: TP20111116)。(C)在肝细胞 (红箭) 胞浆中显示出少量的褐色至黑色颗粒的 AMG 阳性信号 (Kogia ); field 代码: TC20110722;用电感耦合等离子体质谱测定的银浓度: 3.86 微克/克干重)。(D)鲸目肾组织中的 AMG 阳性信号主要位于肾皮质 (Gg; field 代码: TP20111116;用电感耦合等离子体质谱测定的银浓度: 0.42 微克/克干重)。黑色虚线放置在肾皮质和髓质之间的交界处。(E) 图 5D (红色虚线矩形) 的较高 magnification。在肾皮质的 AMG 阳性信号是棕色到不同大小的黑色颗粒的肾小管上皮 (红色箭头) 细胞质。非晶金黄色到褐色 AMG 阳性信号显示在流明 (红色箭头头) 和基底膜 (黄色箭头头) 的一些近端肾小管。不到最小的 AMG 阳性信号显示在肾小球 (绿箭) 和远端肾小管 (绿箭头) (Gg; field 代码: TP20111116)。(F)在 thecytoplasm 的肾小管上皮 (红色箭头) 中显示各种大小的分散的褐色颗粒 (高; field 代码: TC20110722;用电感耦合等离子体质谱测定的银浓度: 0.05 微克/克干重)。请单击此处查看此图的较大版本.

精度测试
字段编号
CHAA * ICP 备-MS Sd CHAA * ICP 备-MS Sd
TP20111116 16.82 21.82 4.99 0.64 0.42 0.22
TC20110611 10.12 2.77 0.96 0.11 0.05 0.35
TC20110722 2.70 3.86 1.15 0.01 0.05 0.04
TD20110608 0.76 0.06 7.35 0.02 0.05 0.06
TP20110830 13.97 14.93 4.28 0.69 1.04 0.24
IL20110101 6.00 1.73 0.72 0.38 0.14 0.03
平均 SD 3.24 平均 SD 0.16
精度测试
字段编号
CHAA * ICP 备-MS Sd CHAA * ICP 备-MS Sd
TP20111116 20.90 21.82 4.08 0.21 0.42 0.44
16.11 0.22
17.75 0.14
TD20110608 1.52 0.06 1.71 0.00 0.05 0.02
2.40 0.00
1.12 0.00
TP20110830 13.12 14.93 2.70 0.45 1.04 0.59
12.50 0.26
11.35 0.33
平均 SD 2.83 平均 SD 0.35
* 肝脏和肾脏 CHAA 的回归方程分别为 y = 2.249 x (调整后的 R2 = 0.74) 和 Y = 0.07288 x x (调整后的 R2 = 0.69)。

表 1: 鲸目组织学 Ag 测定 (CHAA) 的准确性和精密度试验的代表性结果.CHAA = 鲸目组织学 Ag 测定, ICP-MS = 电感耦合等离子质谱, SD = 标准偏差。

字段编号 物种
Amg CHAA * ICP 备-MS Amg CHAA * ICP 备-MS
TP20111116 Gg 7.48 16.82 21.82 8.82 0.64 0.42
TC20110611 4.50 10.12 2.77 1.52 0.11 0.05
TC20110722 1.20 2.70 3.86 0.11 0.01 0.05
TD20110608 Lh 0.34 0.76 0.06 0.21 0.02 0.05
TP20110830 Lh 6.21 13.97 14.93 9.43 0.69 1.04
IL20110101 Sa 2.67 6.00 1.73 5.26 0.38 0.14
* 肝脏和肾脏 CHAA 的回归方程分别为 y = 2.249 x (调整后的 R2 = 0.74) 和 Y = 0.07288 x x (调整后的 R2 = 0.69)。

表 2: 由六只滞留鲸类动物肝脏和肾脏组织的电感耦合等离子体质谱仪测定的 AMG 阳性值、银浓度 (微克/克、干重) 估计的鲸的组织学 ag 测定 (CHAA) 和银浓度 (微克/克, 干重).Gg =鲸灰色, 高 = Kogia , Lh = Lagenodelphis hosei, Sa = Stenella 白太镐

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Discussion

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本文的研究目的是建立一种辅助方法, 以评估 suborgan 水平的银分布, 并估算鲸体内的银浓度。目前的协议包括 1) ICP-MS, 2) 测定鲸目组织中银的含量. 用已知 ag 浓度对配对组织样品的 AMG 分析, 3) 建立回归模型 (CHAA) 估算银浓度通过 AMG 正值, 4) 评价 CHAA 的准确度和精确度, 以及 5) CHAA 对银浓度的估计。

在本研究中, ICP 的数据与 amg 阳性值呈显著正相关, 提示在鲸类组织中的银浓度可由 amg 阳性值估计。因此, 以 AMG 阳性值和回归模型为基础, 建立了 CHAA 对鲸类肝脏和肾脏组织中银浓度的估计。通常, 具有更多参数的回归模型 (更复杂的回归模型) 适合于数据, 但不确定更复杂的一个实际上比简单的多。因此, 最好的回归模型必须选择的统计分析26,27.统计分析结果表明, 线性回归模型足以估计基于 AMG 正值12的 Ag 浓度。

在肾组织 CHAA 中, 精密试验的平均 SD (0.35) 大于准确度试验 (0.16)。反之, 在肝组织 CHAA 中, 精密试验的平均 SD (2.8) 小于准确度试验 (3.24)。在此基础上, 提出了在鲸脑组织中, AMG 阳性信号分布不均匀, 银浓度相对较低, 对肾脏组织 CHAA 的精度有负向影响。因此, 肾脏组织的 CHAA 可能是准确的, 但不精确。然而, 在鲸鱼肝组织中, AMG 阳性信号的均匀分布和相对较高的 ag 浓度表明, 肝组织的 CHAA 是估计鲸肝组织中银浓度的可靠方法。此外, 如果有更多的组织与已知的 ag 浓度由 ICP-MS 确定, 一个更准确和精确的回归模型可以发展, 以估计银浓度。

虽然目前的协议提供了一种辅助方法来调查动物组织中的银, 但对 AMG 方法的一些限制应该注意。首先, 假阳性的 AMG 信号可能是由于其他重金属的干扰, 如汞, 铋和锌28。因此, AMG 方法的结果必须与其他具体方法 (如 ICP-MS) 进行解释, 以监测重金属的实际成分28。第二, 很难检测到 homogenously 分布的重金属, 因为它可能产生更明亮的非晶 AMG 阳性信号, 这可能不是通过显微检查可视化识别。此外, 由于 amg 正则信号的颜色可能与背景相似 (如 g., 非晶的 amg 阳性信号, 因此在图像分析软件中很难分析出非晶和更亮的 amg 阳性信号。近端肾小管的流明)。因此, 在图像分析软件的阈值调整后, AMG 正则信号不能突出显示。第三, 由于 amg 正值是基于 amg 阳性信号面积的百分比, 因此可能低估高浓度重金属的价值。

FFPE 样本比较容易收集和存储, 我们以前的研究表明, 目前的 AMG 方法可以成功地放大 FFPE 样品储存超过15年12。AMG 的机制不受不同的动物种类的影响, 因为它已被广泛地用于各种动物物种20,29,30,31。虽然目前的文章侧重于鲸目动物, 这里描述的协议也可以用于不同的动物物种。此外, 与电感耦合等离子体质谱的 AMG 方法的成本相对较低 (与激光消融-ICP-ms) 相比, 因此目前的协议对于缺乏足够研究资金的研究者或国家来说是很有价值的, 可以调查分布和重金属在动物组织中的浓度。最后, 利用 AMG 进行定量分析, 对重金属进行定位和半量化, 为时空和跨物种研究提供了一种方便的方法。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢台湾鲸鱼鲸搁浅网络标本采集和储存, 包括台湾鲸目协会, 台北;国立台湾大学生态学与进化生物学研究所, 鲸目研究实验室 (周莲香教授);国家自然科学博物馆 (黄重球博士), 台中;与国立成武大学海洋生物学 & 鲸目研究中心。我们也感谢农业部林业局, 行政院的许可。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HQ Silver enhancement kit Nanoprobes #2012
Surgipath Paraplast Leica Biosystems 39601006 Paraffin
100% Ethanol Muto Pure Chemical Co., Ltd 4026
Non-Xylene Muto Pure Chemical Co., Ltd 4328
Silane coated slide Muto Pure Chemical Co., Ltd 511614
Cover glass (25 x 50 mm) Muto Pure Chemical Co., Ltd 24501
Malinol Muto Pure Chemical Co., Ltd 20092
GM Haematoxylin Staining Muto Pure Chemical Co., Ltd 3008-1
10% neutral buffered formalin solution Chin I Pao Co., Ltd ---
Tip (1000 μL) MDBio, Inc. 1000
PIPETMAN Classic P1000 Gilson, Inc. F123602
15 ml Centrifuge Tube GeneDireX, Inc. PC115-0500
Dogfish liver National Research Council of Canada DOLT-2
Dogfish muscle National Research Council of Canada DORM-2
Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) PerkinElmer Inc. PE-SCIEX ELAN 6100 DRC
FreeZone 6 liter freeze dry system Labconco 7752030 For freeze drying
BRAND® SILBERBRAND volumetric flask Merck Z326283
30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure Savillex Corporation 200-030-12 For diagestion
Nitric acid, superpur®, 65.0% Merck 1.00441 For diagestion
Hot Plate/Stirrers Corning® PC-220 For diagestion
High Shear lab mixer Silverson SL2T For homogenization
Sterile polypropylene sample jar (250mL) Thermo Scientific™ 6186L05 For homogenization
Digital camera Nikon Corporation DS-Fi2
Light microscope Nikon Corporation ECLIPSE Ni-U
Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome Thermo Scientific™ A78100001H
Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome Sakura 1429
Microtome blade S35 FEATHER® 207500000
Slide staining dish and cover Brain Research Laboratories #3215
Steel staining rack Brain Research Laboratories #3003
Shandon embedding center Thermo Scientific™ S-EC
Shandon Citadel® tissue processor Thermo Scientific™ 69800003
Slide warmer Lab-Line Instruments 26005
Water bath Shandon Capshaw 3964
Filter paper Merck 1541-070
Prism 6.01 for windows GraphPad Software Statistic software
ImageJ National Institutes of Health
Stainless steel tissue embedding mould Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd RD-TBM003 For paraffin emedding

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References

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Autometallography 在鲸目组织中的定位和半定量银的应用
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Li, W. T., Liou, B. Y., Yang, W. C., Chen, M. H., Chang, H. W., Chiou, H. Y., Pang, V. F., Jeng, C. R. Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues. J. Vis. Exp. (140), e58232, doi:10.3791/58232 (2018).More

Li, W. T., Liou, B. Y., Yang, W. C., Chen, M. H., Chang, H. W., Chiou, H. Y., Pang, V. F., Jeng, C. R. Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues. J. Vis. Exp. (140), e58232, doi:10.3791/58232 (2018).

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