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ह्वेल ऊतकों में information and अर्द्ध-मात्रा चांदी के Autometallography का प्रयोग

doi: 10.3791/58232 Published: October 4, 2018

Summary

एक प्रोटोकॉल autometallography द्वारा ह्वेल जिगर और गुर्दे के ऊतकों में एजी स्थानीयकृत करने के लिए प्रस्तुत किया है । इसके अलावा, एक नई परख, ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख (CHAA) नाम के लिए उन ऊतकों में एजी सांद्रता अनुमान विकसित की है ।

Abstract

सिल्वर नैनोकणों (AgNPs) अपने मजबूत रोगाणुरोधी प्रभाव के कारण, वस्त्र, सौंदर्य प्रसाधन, और स्वास्थ्य देखभाल मदों सहित वाणिज्यिक उत्पादों में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है । वे भी वातावरण में जारी किया जा सकता है और समुद्र में संचित । इसलिए, AgNPs एजी संदूषण के प्रमुख स्रोत हैं, और एजी के पर्यावरण विषाक्तता के सार्वजनिक जागरूकता बढ़ रही है । पिछले अध्ययनों से (उत्पादकों में) और इज़ाफ़ा (उपभोक्ताओं में) () एजी के (शिकारियों) में वृद्धि का प्रदर्शन किया है । केटासियन, महासागर के शीर्ष शिकारियों के रूप में, नकारात्मक एजी द्वारा प्रभावित हो सकता है/ हालांकि ह्वेल ऊतकों में ag/ag यौगिकों की सांद्रता inductively युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीपी-ms) द्वारा मापा जा सकता है, आईसीपी-ms का उपयोग अपनी उच्च पूंजीगत लागत और ऊतक भंडारण के लिए आवश्यकता के द्वारा सीमित है/ इसलिए, formalin-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक का उपयोग करके एक छवि मात्रात्मक विश्लेषण के साथ एक autometallography (AMG) विधि एक सहायक विधि को उपअंग स्तर पर एजी वितरण स्थानीयकरण और ह्वेल में एजी एकाग्रता का अनुमान हो सकता है ऊतकों. AMG सकारात्मक संकेत मुख्य रूप से समीपस्थ गुर्दे ट्यूबलर उपकला, हेपैटोसाइट्स, और Kupffer कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में विभिन्न आकारों के काले granules के लिए भूरे रंग के हैं । कभी-कभार, कुछ अमली सुनहरा पीला करने के लिए ब्राउन AMG सकारात्मक संकेतों में कुछ समीपस्थ गुर्दे नलिकाओं के लुमेन और तहखाने झिल्ली में उल्लेख कर रहे हैं । एजी एकाग्रता का आकलन करने के लिए परख ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख (CHAA) है, जो एक प्रतिगमन मॉडल AMG विधि और आईसीपी की छवि मात्रात्मक विश्लेषण से डेटा द्वारा स्थापित-MS है नाम है । CHAA के साथ AMG का उपयोग करने के लिए स्थानीयकरण और अर्द्ध मात्रा भारी धातुओं spatio-लौकिक और पार प्रजातियों के अध्ययन के लिए एक सुविधाजनक पद्धति प्रदान करता है ।

Introduction

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सिल्वर नैनोकणों (AgNPs) व्यापक रूप से वस्त्र, सौंदर्य प्रसाधन, और स्वास्थ्य देखभाल आइटम, उनके महान रोगाणुरोधी प्रभाव1,2के कारण सहित वाणिज्यिक उत्पादों में इस्तेमाल किया गया है । इसलिए, AgNPs के उत्पादन और AgNP-युक्त उत्पादों की संख्या में वृद्धि हुई है समय3,4। हालांकि, AgNPs वातावरण में जारी किया जा सकता है और समुद्र में जमा5,6। वे एजी संदूषण के प्रमुख स्रोत बन गए हैं, और एजी के पर्यावरण विषाक्तता के सार्वजनिक जागरूकता बढ़ रही है ।

समुद्री वातावरण में AgNPs और एजी की स्थिति जटिल और लगातार बदलती जा रही है. पिछले अध्ययनों से संकेत दिया है कि AgNPs कणों के रूप में रह सकते हैं, कुल, भंग, विभिन्न रासायनिक प्रजातियों के साथ प्रतिक्रिया, या एजी से पुनर्जीवित किया जा+ आयनों7,8. AgCl के रूप में एजी यौगिकों के कई प्रकार, समुद्री तलछट में पाया गया है, जहां वे benthic जीवों द्वारा घूस लिया जा सकता है और खाद्य श्रृंखला9,10दर्ज करें । एक पिछले ताइवान के पश्चिमी तट के साथ ची-कू लैगून क्षेत्र में किए गए अध्ययन के अनुसार, समुद्री तलछट के एजी सांद्रता बहुत कम है और पपड़ी बहुतायत के समान हैं, और मछली जिगर ऊतक के उन आम तौर पर पता लगाने के नीचे है सीमा (< ०.०२५ μg/g गीले/11. हालांकि, पिछले विभिंन देशों में किए गए अध्ययन केटासियन12,13के जिगर में अपेक्षाकृत उच्च एजी सांद्रता का प्रदर्शन किया है । केटासियन के जिगर में एजी एकाग्रता उंर पर निर्भर है, सुझाव है कि उनके शरीर में एजी के स्रोत सबसे अधिक संभावना है उनके शिकार12। इन निष्कर्षों को आगे उच्च पौष्टिकता स्तर पर पशुओं में एजी की वृद्धि का सुझाव देते हैं । केटासियन, महासागर में शीर्ष शिकारियों के रूप में, नकारात्मक स्वास्थ्य एजी/एजी यौगिकों12,13,14के कारण प्रभावों का सामना करना पड़ सकता है । सबसे महत्वपूर्ण बात, केटासियन की तरह, मानव स्तनधारी हैं, और नकारात्मक स्वास्थ्य केटासियन में एजी/एजी यौगिकों के कारण प्रभावों को भी मनुष्य में हो सकता है । दूसरे शब्दों में, केटासियन समुद्री पर्यावरण और मनुष्यों के स्वास्थ्य के लिए प्रहरी पशु हो सकता है । इसलिए, स्वास्थ्य प्रभाव, ऊतक वितरण, और केटासियन में एजी की एकाग्रता बड़ी चिंता का विषय हैं ।

हालांकि ह्वेल ऊतकों में ag/ag यौगिकों की सांद्रता inductively युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीपी-ms) द्वारा मापा जा सकता है, आईसीपी-ms का उपयोग अपनी उच्च पूंजीगत लागत (साधन और रखरखाव) और ऊतक भंडारण के लिए आवश्यकताओं द्वारा सीमित है /preparation१२,१५. इसके अलावा, यह आमतौर पर सैंय कठिनाइयों, जनशक्ति की कमी के कारण असहाय ह्वेल मामलों की सभी जांच में व्यापक ऊतक नमूने इकट्ठा करने के लिए मुश्किल है, और संबंधित संसाधनों की कमी12। आईसीपी-एमएस विश्लेषण के लिए जमे हुए ऊतक के नमूने आसानी से सीमित प्रशीतन अंतरिक्ष के कारण संग्रहीत नहीं कर रहे हैं, और जमे हुए ऊतक के नमूनों टूटे प्रशीतन उपकरण12के कारण छोड़ दिया जा सकता है । इन aforementioned बाधाओं आईसीपी द्वारा ह्वेल ऊतकों में संक्रमण के स्तर की जांच में बाधा-एमएस जमे हुए ऊतक नमूनों का उपयोग कर विश्लेषण । इसके विपरीत, formalin निश्चित ऊतक नमूने मृत-असहाय केटासियन के necropsy के दौरान इकट्ठा करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं । इसलिए, यह एक आसान उपयोग करने के लिए और सस्ती विधि का पता लगाने के लिए विकसित करने के लिए आवश्यक है ह्वेल ऊतकों में भारी धातुओं formalin निश्चित ऊतक के नमूनों का उपयोग करके/

हालांकि उपअंग वितरण और क्षार और क्षारीय पृथ्वी धातुओं की सांद्रता formalin के दौरान बदला जा सकता है-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) प्रक्रिया, केवल इस तरह के एजी के रूप में संक्रमण धातुओं पर कम प्रभाव,16उल्लेख किया गया है । इसलिए, FFPE ऊतक धातु स्थानीयकरण और माप के लिए एक आदर्श नमूना संसाधन के रूप में माना गया है16,17. Autometallography (AMG), एक histochemical प्रक्रिया, भारी धातुओं को बढ़ाना कर सकते है के रूप में कम से कम सुनहरा पीला काले FFPE ऊतक वर्गों पर सकारात्मक संकेतों AMG आकार, और इन परिवर्धित भारी धातुओं प्रकाश माइक्रोस्कोपी18के तहत visualized किया जा सकता है, 19 , 20 , 21. इसलिए, AMG विधि भारी धातुओं के उपअंग वितरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है । यह जैविक प्रणालियों में भारी धातुओं के चयापचय रास्ते का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं क्योंकि आईसीपी-MS केवल अंग स्तर18पर भारी धातुओं की एकाग्रता उपाय कर सकते हैं । इसके अलावा, डिजिटल छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, ImageJ के रूप में, ऊतकवैज्ञानिक ऊतक वर्गों के मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है22,23. FFPE ऊतक वर्गों के सकारात्मक संकेतों को quantified और भारी धातुओं की सांद्रता का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि निरपेक्ष एजी एकाग्रता छवि मात्रात्मक विश्लेषण के साथ AMG विधि द्वारा सीधे निर्धारित नहीं किया जा सकता है, यह छवि मात्रात्मक विश्लेषण और आईसीपी-MS, जो नाम है ह्वेल से प्राप्त आंकड़ों के आधार पर एक प्रतिगमन मॉडल द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है ऊतकवैज्ञानिक एजी (CHAA) परख । सबसे असहाय केटासियन में आईसीपी-एमएस विश्लेषण द्वारा एजी सांद्रता मापने में कठिनाइयों को ध्यान में रखते हुए, CHAA एक मूल्यवान सहायक विधि ह्वेल ऊतकों में एजी सांद्रता का अनुमान है, जो आईसीपी द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है-ms जमे हुए की कमी के कारण विश्लेषण ऊतक के नमूने । इस पत्र में एक histochemical तकनीक के प्रोटोकॉल का वर्णन (AMG विधि) उपअंग स्तर पर एजी स्थानीयकरण के लिए और एक CHAA का नाम परख जिगर और केटासियन की गुर्दे के ऊतकों में एजी सांद्रता का अनुमान है ।

Figure 1
चित्रा 1: ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख (CHAA) की स्थापना और आवेदन का चित्रण फ़्लोचार्ट एजी सांद्रता का आकलन करने के लिए । CHAA = ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख, FFPE = Formalin-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड, आईसीपी-MS = inductively प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी युग्मित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Protocol

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अध्ययन अंतरराष्ट्रीय दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था, और ह्वेल ऊतक नमूनों के उपयोग की अनुमति ताइवान के कृषि परिषद (अनुसंधान परमिट 104-07.1-SB-६२) द्वारा किया गया था ।

1. आईसीपी-एमएस विश्लेषण के लिए ऊतक नमूना तैयारी

नोट: जिगर और गुर्दे के ऊतकों को नए सिरे से मृत और मामूली autolyzed फंसे केटासियन24, 4 अलग प्रजातियों में से 6 असहाय केटासियन सहित, 1 Grampus griseus (जीजी), 2 Kogia एसपीपी से एकत्र किए गए । (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), १ Stenella attenuata (सा) । प्रत्येक असहाय ह्वेल व्यक्तिगत पहचान के लिए एक क्षेत्र संख्या थी । आईसीपी के लिए ऊतक नमूना तैयारी-एमएस विश्लेषण M.H. चेन लैब में स्थापित विधि पीछा किया, और M.H. चेन लैब आईसीपी-एमएस विश्लेषण11,13,25का आयोजन किया ।

  1. असहाय केटासियन से आईसीपी-एमएस विश्लेषण के लिए जिगर और गुर्दे के ऊतकों को इकट्ठा करने और उपयोग करने तक − 20 ° c पर उन्हें स्टोर करें ।
  2. जोड़ी-मिलान जिगर और गुर्दे के ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए एक ही असहाय केटासियन के विश्लेषण AMG (कृपया चरण 2 देखें) ।
  3. एक स्टेनलेस स्टील स्केलपेल के साथ आईसीपी-एमएस विश्लेषण के लिए एकत्र ऊतक नमूनों की बाहरी परत ट्रिम कर दीजिए । छोटे क्यूब्स (के बारे में 1 सेमी3) में ऊतक के नमूनों के भीतरी भाग में कटौती और ज़िप ताला प्लास्टिक बैग में उन्हें जगह है । आम तौर पर, प्रत्येक बैग ऊतकों के 10 ग्राम होता है ।
  4. बाद की प्रक्रियाओं के लिए − 20 डिग्री सेल्सियस पर टिशू के नमूनों से युक्त प्लास्टिक बैग की दुकान ।
  5. एक फ्रीज शुष्क प्रणाली में 1 सेमी3 cubes के नमूने रखो (-५० ° c, वैक्यूम पंप के एक विस्थापन के साथ कम से कम ९८ L/मिनट, ०.००२ mBar) के लिए कम से कम ७२ एच तक पूरी तरह से लगातार वजन से सूख गया ।
  6. सूखे cubes पाउडर में Homogenize बाद ऊतक पाचन के लिए एक homogenizer के साथ ।
  7. 30 मिलीलीटर polytetrafluoroethylene (PTFE) की बोतलों में homogenized फ्रीज-सूखे नमूनों की ०.३ ग्राम वजन और उंहें ६५% डब्ल्यू के 10 मिलीलीटर के साथ मिश्रण/
  8. PTFE बोतलों पर बंद रखो, लेकिन बंद करने के लिए कस छोड़ दें ।
    नोट: यह भूरे रंग के धुएं के लिए PTFE की बोतलें और पाचन के लिए बोतल के अंदर भाटा में फार्म जब तक भूरे रंग के धुएं गायब हो जाता है और स्पष्ट हो जाता है की अनुमति देता है ।
  9. एक गर्म थाली के साथ पचा नमूनों गर्मी, 30 डिग्री सेल्सियस से 110/120 डिग्री सेल्सियस (भूरे रंग के धुएं के गठन की स्थिति के अनुसार) के लिए PTFE की बोतलों में 2 से 3 सप्ताह तक PTFE बोतलों में भूरा गैस बेरंग हो जाता है और PTFE बोतलों में तरल पारदर्शी हो जाता है gree nish पीला या पूरी तरह से स्पष्ट ।
    नोट: रासायनिक धुएं हुड में हीटिंग प्रक्रिया करते हैं ।
  10. PTFE बोतलों में नाइट्रिक एसिड को वाष्पित करने के लिए १२० डिग्री सेल्सियस पर पचता नमूनों को केवल 0.5-1 मिलीलीटर तक गर्म करें ।
    नोट: एक रासायनिक धुएं डाकू में हीटिंग प्रक्रिया प्रदर्शन, और हमेशा तापमान वृद्धि की निगरानी करने के लिए सुनिश्चित करें कि PTFE ' बोतलें बंद होने से कोई भूरा गैस लीक ।
  11. बंद को कसने और लगभग 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें शांत ।
  12. 25 मिलीलीटर volumetric कुप्पी पर फ़िल्टर कागज के साथ फ़नल रखें और शेष लिक्विड को 1 मीटर िनॉ3 से 25 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में धो लें ।
    नोट: बोतल को कम से तीन बार और बंद करने के लिए दो बार धोएं ।
  13. मानक संदर्भ सामग्री, DOLT-2 (dogfish जिगर) और छात्रावास-2 (dogfish मांसपेशी) सहित का उपयोग करके आईसीपी-MS विश्लेषण की विश्लेषणात्मक गुणवत्ता को मान्य करें ।
  14. प्रत्येक विश्लेषणात्मक नमूना और आईसीपी-एमएस विश्लेषण के लिए मानक संदर्भ सामग्री के triplicates के डुप्लिकेट का उपयोग करें ।
  15. औसत प्रत्येक विश्लेषणात्मक नमूनों की एजी सांद्रता और शुष्क वजन के आधार एकाग्रता के रूप में डेटा वर्तमान (μg/

2. ऊतक नमूना AMG विश्लेषण के लिए तैयारी

  1. जोड़ी-मिलान जिगर और गुर्दे के ऊतकों को एक फंसे ह्वेल से AMG विश्लेषण के लिए ले लीजिए और उन्हें 10% तटस्थ बफ़र्ड formalin में उपयोग तक ठीक करें ।
    नोट: प्लास्टिक की बोतलों में ऊतक के नमूनों को 10% तटस्थ बफ़र्ड formalin (NBF, पीएच ७.०) में 24 से ४८ घंटे के लिए स्टोर करें । NBF की मात्रा ऊतक की मात्रा से अधिक से अधिक 10 गुना अधिक होना चाहिए ।
  2. formalin फिक्स्ड जिगर और स्टेनलेस स्टील डिस्पोजेबल microtome ब्लेड के साथ गुर्दे के ऊतकों ट्रिम कर दीजिए और लेबल के साथ कैसेट में छंटनी ऊतक वर्गों डाल दिया ।
    नोट: प्रत्येक ऊतक वर्गों के आकार लगभग होना चाहिए 2 सेमी x 1 सेमी और प्रत्येक ऊतक अनुभाग की मोटाई 3 मिमी से अधिक नहीं होना चाहिए. उसी व्यक्ति से यकृत और गुर्दे के ऊतकों को एक ही कैसेट में रखें.
  3. 1 एच के लिए वर्गीकृत इथेनॉल की एक श्रृंखला (७०% के माध्यम से एक ऊतक प्रोसेसर के साथ छंटनी ऊतक वर्गों निर्जलीकरण, 1 एच के लिए ८०%, ९५% के लिए 1 ज, ९५% के लिए 2 एच, १००% के लिए 1 ज x 2 धुंधला व्यंजन, और 2 ज के लिए १००%), गैर xylene (1 के लिए एच और अलग धुंधला व्यंजन में 2 एच) , और paraffin में निर्जलित ऊतक नमूने विसर्जित (के लिए 1 एच और 2 अलग धुंधला व्यंजन में एच) ।
  4. स्टील प्रोटोकॉल मोल्ड के तल में निर्जलित ऊतक के नमूनों प्लेस और तेल के साथ निर्जलित ऊतक नमूने एंबेड ।
  5. ठंडा formalin फिक्स्ड तेल एंबेडेड (FFPE) कोल्ड प्लेट पर ऊतक ब्लॉक जब तक तेल जम । FFPE ब्लॉक microtome के साथ जब तक ऊतक सतह उजागर है ट्रिम कर दीजिए ।
  6. 10 मिनट के लिए − 20 डिग्री सेल्सियस पर FFPE ब्लाकों को ठंडा करे । खंड FFPE 5 µm पर microtome द्वारा ब्लॉक ।
  7. ४५ डिग्री सेल्सियस पर डबल आसुत जल के साथ एक पानी स्नान भरें । ऊतक वर्गों के रिबन उठा और उन्हें चिमटी और ब्रश का उपयोग करके गर्म पानी की सतह पर नाव बनाते हैं ।
  8. चिमटी के साथ ऊतक वर्गों के रिबन अलग । एक खुर्दबीन स्लाइड पर एक अनुभाग प्लेस ।
  9. एक स्लाइड गर्म पर माइक्रोस्कोप स्लाइड प्लेस और वर्गों ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सूखी अनुमति देते हैं ।
  10. स्लाइड रैक में माइक्रोस्कोप स्लाइड रखो और उंहें शुद्ध गैर के 3 अलग धुंधला व्यंजन में भिगोने से deparaffinize-xylene (लगभग २०० के लिए २५० मिलीलीटर) 8, 5, और 3 मिनट के लिए ।
  11. उंहें वर्गीकृत इथेनॉल समाधान के विभिंन धुंधला व्यंजन में भिगोने के द्वारा स्लाइड रैक में ऊतक वर्गों हाइड्रेट (१००% इथेनॉल दो बार, ९०% इथेनॉल एक बार और ८०% इथेनॉल एक बार [1 मिनट प्रत्येक]), और उंहें दोहरे आसुत जल में कुल्ला ।
    नोट: ये समाधान लगभग २०० से २५० मिलीलीटर अलग धुंधला व्यंजन में हैं । प्रत्येक धोने के लिए, 30 सेकंड के लिए पर्याप्त है ।
  12. ०.५% ट्राइटन X-१०० के साथ फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) में ऊतक वर्गों कुल्ला, उंहें कई बार के लिए पंजाबियों के साथ धोने, और फिर उंहें दोहरे आसुत जल में कुल्ला ।
    नोट: ये समाधान लगभग २०० से २५० मिलीलीटर अलग धुंधला व्यंजन में हैं । प्रत्येक के लिए था, 30 सेकंड के लिए पर्याप्त है ।
  13. अंधेरे में चांदी वृद्धि किट द्वारा प्रदान की तीन घटकों (सर्जक, मध्यस्थ, और उत्प्रेरक) के बराबर मात्रा में तैयार है और उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण ।
    नोट: मध्यस्थ और उत्प्रेरक के समाधान चिपचिपा रहे हैं, तो विस्तृत टिप के उद्घाटन के साथ पिपेट का उपयोग करें (या युक्तियां कटौती करने के लिए व्यापक उद्घाटन बनाएं) । प्रत्येक स्लाइड के लिए, मिश्रित समाधान के ३०० μL (ऊतक खंड के आकार पर निर्भर करता है) आमतौर पर पर्याप्त है । 10 स्लाइड्स का उपयोग किया जाता है, तो इसलिए, प्रत्येक घटक (प्रारंभकर्ता, मॉडरेटर, और उत्प्रेरक) की मात्रा १००० μL (मिश्रित समाधान 10 स्लाइड के लिए ३००० μL है) है ।
  14. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए मिश्रित समाधान में ऊतक वर्गों की मशीन । पूरी तरह से मिश्रित समाधान के साथ स्लाइड पर ऊतक वर्गों को कवर । एक लंबी मशीन समय झूठी-सकारात्मक AMG संकेतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
  15. डबल आसुत जल के साथ स्लाइड धो लें और उंहें hematoxylin में एक counterstain के रूप में 10 एस के लिए दाग ।
  16. नल का पानी चलाने के साथ स्लाइड धोने, उन्हें सूखा, और बढ़ते माध्यम के साथ उन्हें माउंट ।
  17. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड की जांच करें ।
  18. बेतरतीब ढंग से एक कंप्यूटर इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ एक जुड़ा डिजिटल कैमरा का उपयोग करके प्रत्येक ऊतक अनुभाग से एक 40X उद्देश्य लेंस के साथ दस ऊतकवैज्ञानिक छवियों पर कब्जा ।

3. अर्द्ध ऊतकवैज्ञानिक छवियों के सकारात्मक मूल्यों AMG के लिए मात्रात्मक विश्लेषण

नोट: सकारात्मक मूल्य amg सकारात्मक संकेतों amg के साथ क्षेत्र का प्रतिशत का मतलब है ।

  1. ऊतकवैज्ञानिक छवियों का विश्लेषण करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (ImageJ) का उपयोग करें ।
  2. फ़ाइल दबाकर ऊतकवैज्ञानिक छवि खोलें । खुला
  3. छवि दबाकर तीन रंग चैनल (लाल, नीला, और हरा) में चुना चित्र भाजित । प्रकार | RGB स्टैक ।
  4. नीले चैनल का उपयोग करके AMG सकारात्मक संकेतों को बढ़ाता है । परमाणु counterstain (चित्रा 2) के लिए hematoxylin दाग लागू होने पर नीले चैनल के तहत नाभिकीय झूठे सकारात्मक संकेत आमतौर पर कम होते हैं ।
  5. सीमा उपकरण के साथ प्रत्येक ऊतकवैज्ञानिक छवि में AMG सकारात्मक संकेतों के साथ क्षेत्र के प्रतिशत को मापने (छवि । समायोजित करें । थ्रेशोल्ड) ।
  6. नाभिक और/या लाल रक्त कोशिकाओं में झूठी सकारात्मक क्षेत्रों की उपस्थिति के आधार पर प्रत्येक ऊतकवैज्ञानिक छवि (९० से ११०) के लिए सीमा का कट-ऑफ मान मैंयुअल रूप से समायोजित करें ।
    नोट: डिफ़ॉल्ट सेटिंग में, AMG धनात्मक संकेतों लाल रंग में हाइलाइट किया जाना चाहिए ।
  7. प्रेस विश्लेषण । माप सेटकरें, और क्षेत्र अंश के बॉक्स को निर्दिष्ट करने के लिए जांचें कि क्षेत्र भिंन रिकॉर्ड किया गया है ।
  8. प्रेस विश्लेषण । उपाय. प्रत्येक ऊतकवैज्ञानिक छवि का धनात्मक प्रतिशत क्षेत्र परिणाम विंडो के % क्षेत्र के स्तंभ में प्रदर्शित होता है.
  9. प्रत्येक ऊतक अनुभाग से 10 ऊतकवैज्ञानिक छवियों के सकारात्मक प्रतिशत क्षेत्रों औसत और प्रत्येक ऊतक खंड के लिए AMG सकारात्मक मूल्य के रूप में परिणाम को परिभाषित ।

Figure 2
चित्रा 2: अलग रंग चैनलों के तहत परमाणु झूठी सकारात्मक संकेतों की उपस्थिति (counterstain: hematoxylin दाग) । प्रतिनिधि परमाणु झूठी सकारात्मक संकेत पीले तीरों द्वारा संकेत कर रहे हैं । PPA = क्षेत्रों का सकारात्मक प्रतिशत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

4. प्रतिगमन मॉडल द्वारा ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख (CHAA) की स्थापना

नोट: निंनलिखित विश्लेषण Windows के लिए चश्मे ६.०१ में किया जाता है ।

  1. आईसीपी-MS के परिणामों के बीच सहसंबंध का मूल्यांकन करें और धनात्मक मान AMG ।
  2. सॉफ़्टवेयर खोलें, कोई नई प्रोजेक्ट फ़ाइल बनाएं, और XY और सहसंबंध चुनें
  3. आईसीपी-एमएस और AMG सकारात्मक मूल्यों के परिणामों सहित इनपुट डेटा ।
  4. प्रेस विश्लेषण और आईसीपी-MS के परिणामों के बीच जुड़ाव की ताकत का विश्लेषण करने के लिए श्रेणी XY विश्लेषण के तहत सहसंबंध चुनें और पियरसन सहसंबंध विश्लेषण द्वारा सकारात्मक मूल्यों AMG ।
    नोट: आईसीपी-MS और AMG धनात्मक मानों के परिणाम सकारात्मक रूप से एक-दूसरे से संबंधित होने चाहिए; अंयथा, क्रमिक प्रतीपगमन मॉडल विकसित नहीं किया जाना चाहिए ।
  5. सांख्यिकीय प्रतीपगमन मॉडल, रेखीय प्रतीपगमन, द्विघात प्रतीपगमन, घन प्रतीपगमन, और रेखीय प्रतीपगमन मूल के माध्यम से, आँकड़े सॉफ़्टवेयर के माध्यम से12,26,27सहित, की तुलना करें ।
    नोट: प्रतीपगमन मॉडल एक अवास्तविक एजी एकाग्रता उत्पन्न करता है, तो प्रतीपगमन मॉडल12छोड़ दिया जाना चाहिए ।
  6. डेटा तालिका (बाएं पैनल) और प्रेस विश्लेषण के लिए वापस जाओ । रेखीय प्रतिगमन (वक्र फ़िट) श्रेणी XY विश्लेषण के अंतर्गत । ठीकहै ।
  7. विंडो पैरामीटर्स में : रेखीय प्रतीपगमन, पृष्ठ फ़िट में अलग प्रतीपगमन मॉडल का चयन करें, और तब पृष्ठ की तुलनामें अलग प्रतीपगमन मॉडल की तुलना करें ।
  8. पृष्ठ तुलनामें, अतिरिक्त योग-वर्गों F परीक्षण और Akaike की जानकारी मापदंड (AIC) सहित तुलना विधियों का चयन करें । तुलना विधियों के परिणाम के अनुसार, CHAA में एक अपेक्षाकृत उपयुक्त प्रतीपगमन मॉडल का उपयोग करें ।
  9. CHAA का उपयोग करके अज्ञात एजी सांद्रता के साथ ह्वेल जिगर और गुर्दे के ऊतकों की एजी सांद्रता का अनुमान लगाएं ।
  10. सटीकता और जिगर और गुर्दे के ऊतकों के लिए CHAA की परिशुद्धता का मूल्यांकन करें । परिशुद्धता और सटीकता के बीच का अंतर चित्रा 3में सचित्र है ।
  11. सटीकता: ज्ञात और अनुमानित एजी सांद्रता के बीच मतभेदों से मतलब मानक विचलन (एसडी) की गणना ।
  12. प्रेसिजन: एक ही FFPE ऊतकों से धारावाहिक वर्गों के सकारात्मक मूल्यों AMG के दोहराया माप (कम से तपसिल) प्रदर्शन । ज्ञात और अनुमानित एजी सांद्रता के बीच मतभेद से जिगर या गुर्दे के ऊतकों से माप का मतलब एसडी गणना
    नोट: सटीकता और परिशुद्धता के मूल्यांकन के तरीके चित्रा 4में चित्रित कर रहे हैं.

Figure 3
चित्रा 3: सटीकता और परिशुद्धता के बीच का अंतर. सटीकता का मतलब है कि कैसे बंद माप सही मूल्य (यानी, एजी एकाग्रता आईसीपी-MS द्वारा निर्धारित) के लिए है; परिशुद्धता माप की पुनरावृत्ति का मतलब है (यानी, तपसिल ऊतक वर्गों से AMG सकारात्मक मूल्यों की दोहराया माप के बीच संगति) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सटीकता और परिशुद्धता के मूल्यांकन के तरीकों को दर्शाती योजना. CHAA = ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख; FFPE = Formalin-स्थिर, आयल-एंबेडेड; आईसीपी-MS = inductively युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी; ऐ = प्रत्येक जोड़ी-मिलान ऊतक नमूने के आईसीपी-MS द्वारा निर्धारित एजी सांद्रता के प्रत्येक; द्वि = प्रत्येक एजी के प्रत्येक जोड़ी-मिलान ऊतक नमूने के CHAA द्वारा अनुमानित सांद्रता; Ci, Di, और ेि = प्रत्येक एक जोड़ी-मिलान ऊतक नमूने से तपसिल नमूनों की CHAA द्वारा अनुमानित एजी सांद्रता के प्रत्येक; मैं = 1 n करने के लिए । कृपया प्रतिनिधि परिणामों के अनुभाग में सटीकता और परिशुद्धता परीक्षणों के कच्चे डेटा देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

5. CHAA द्वारा एजी सांद्रता का अनुमान ।

  1. असहाय केटासियन से जिगर और गुर्दे के ऊतकों को इकट्ठा करने और उन्हें 10% तटस्थ बफर formalin में ठीक ।
  2. formalin-फिक्स्ड ऊतकों को नियमित रूप से संसाधित करें (कृपया चरण 2 देखें).
  3. CHAA द्वारा अज्ञात एजी सांद्रता के साथ ह्वेल जिगर और गुर्दे के ऊतकों के एजी सांद्रता अनुमान (कृपया चरण 3 और 4 देखें) ।

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Representative Results

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ह्वेल जिगर और गुर्दे के ऊतकों में AMG सकारात्मक संकेतों के प्रतिनिधि छवियों चित्रा 5में दिखाया गया है । AMG सकारात्मक संकेतों के समीपस्थ गुर्दे ट्यूबलर उपकला, हेपैटोसाइट्स, और Kupffer कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में विभिन्न आकारों के काले granules के लिए बदलती-भूरे रंग के आकार में शामिल हैं । कभी-कभार, अमली सुनहरा पीला करने के लिए ब्राउन AMG सकारात्मक संकेतों कुछ समीपस्थ गुर्दे नलिकाओं के लुमेन और तहखाने झिल्ली में उल्लेख कर रहे हैं । आईसीपी-MS के परिणामों के बीच एक सकारात्मक संबंध है और यकृत और गुर्दे के ऊतकों में धनात्मकता मूल्यों AMG, और मूल के माध्यम से रैखिक प्रतीपगमन अतिरिक्त योग के वर्गों के अनुसार पसंद किया जाता है F परीक्षण और AIC12,26, 27. सटीकता परीक्षण में, जिगर और गुर्दे के लिए CHAA का मतलब एसडीएस क्रमशः ३.२४ और ०.१६ हैं । परिशुद्धता परीक्षण में, जिगर और गुर्दे के लिए CHAA का मतलब एसडीएस क्रमशः २.८ और ०.३५ हैं । सटीकता और परिशुद्धता परीक्षणों के कच्चे डेटा 1 तालिकामें संक्षेप हैं । AMG सकारात्मक मूल्यों, एजी CHAA द्वारा अनुमानित सांद्रता, और एजी आईसीपी द्वारा मापा सांद्रता-इन छह असहाय केटासियन के जिगर और गुर्दे के ऊतकों से एमएस तालिका 2में संक्षेप हैं ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि ऊतकवैज्ञानिक जिगर और गुर्दे के ऊतकों केटासियन में AMG सकारात्मक संकेतों की छवियां (counterstain: hematoxylin दाग) । (क) ह्वेल जिगर ऊतक में AMG सकारात्मक संकेतों समान रूप से वितरित कर रहे है (Grampus griseus (जीजी); field कोड: TP20111116; एजी एकाग्रता byinductively युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीपी-MS): २१.८२ μg/ (ख) AMG सकारात्मक संकेत विभिंन sizesin के काले granules के लिए भूरे रंग के है हेपैटोसाइट्स (लाल तीर) और Kupffer कोशिकाओं (लाल तीर सिर) (जीजी; field कोड: TP20111116) के कोशिका द्रव्य । (ग) ब्राउन काले granules के कुछ AMG सकारात्मक संकेतों हेपैटोसाइट्स (लाल तीर) के कोशिका द्रव्य में दिखाया (Kogia एसपीपी. (Ko); field कोड: TC20110722; एजी एकाग्रता आईसीपी द्वारा मापा-MS: ३.८६ μg/ (घ) ह्वेल गुर्दे के ऊतकों में AMG सकारात्मक संकेतों में मुख्य रूप से गुर्दे प्रांतस्था में स्थित हैं (जीजी; field कोड: TP20111116; एजी एकाग्रता आईसीपी द्वारा मापा-MS: ०.४२ μg/ काले धराशायी लाइन गुर्दे प्रांतस्था और मज्जा के बीच जंक्शन पर रखा गया है । (E) चित्रा 5d (लाल डैश्ड आयत) की उच्चतर magnification । गुर्दे प्रांतस्था में AMG सकारात्मक संकेतों समीपस्थ गुर्दे ट्यूबलर उपकला (लाल तीर) के कोशिका द्रव्य में विभिन्न आकारों के काले granules के लिए भूरे रंग के होते हैं । अमली सुनहरा पीला करने के लिए ब्राउन AMG सकारात्मक संकेतों लुमेन में दिखाया गया है (लाल तीर सिर) और तहखाने झिल्ली (पीला तीर सिर) कुछ समीपस्थ गुर्दे नलिकाओं की । glomeruli (हरा तीर) और बाहर गुर्दे नलिकाओं (हरा तीर सिर) (जीजी; field कोड: TP20111116) में दिखाए जाने वाले न्यूनतम AMG सकारात्मक संकेतों के लिए नहीं । (च) विभिन्न आकारों के बिखरे भूरे granules समीपस्थ गुर्दे ट्यूबलर उपकला (लाल तीर) (Ko; field कोड: TC20110722 के thecytoplasm में दिखाया गया है; एजी एकाग्रता आईसीपी द्वारा मापा-MS: ०.०५ μg/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सटीकता परीक्षण
फ़ील्ड संख्या जिगर गुर्दे
CHAA आईसीपी-MS एसडी CHAA आईसीपी-MS एसडी
TP20111116 १६.८२ २१.८२ ४.९९ ०.६४ ०.४२ ०.२२
TC20110611 १०.१२ २.७७ ०.९६ ०.११ ०.०५ ०.३५
TC20110722 २.७० ३.८६ १.१५ ०.०१ ०.०५ ०.०४
TD20110608 ०.७६ ०.०६ ७.३५ ०.०२ ०.०५ ०.०६
TP20110830 १३.९७ १४.९३ ४.२८ ०.६९ १.०४ ०.२४
IL20110101 ६.०० १.७३ ०.७२ ०.३८ ०.१४ ०.०३
एसडी मतलब ३.२४ एसडी मतलब ०.१६
Precison टेस्ट
फ़ील्ड संख्या जिगर गुर्दे
CHAA आईसीपी-MS एसडी CHAA आईसीपी-MS एसडी
TP20111116 २०.९० २१.८२ ४.०८ ०.२१ ०.४२ ०.४४
१६.११ ०.२२
१७.७५ ०.१४
TD20110608 १.५२ ०.०६ १.७१ ०.०० ०.०५ ०.०२
२.४० ०.००
१.१२ ०.००
TP20110830 १३.१२ १४.९३ २.७० ०.४५ १.०४ ०.५९
१२.५० ०.२६
११.३५ ०.३३
एसडी मतलब २.८३ एसडी मतलब ०.३५
* जिगर और गुर्दे के लिए CHAA की दुर्गति समीकरणों थे क्रमशः y = २.२४९ × x (समायोजित r2 = ०.७४) और y = ०.०७२८८ × x (समायोजित r2 = ०.६९) ।

तालिका 1: ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख (CHAA) के लिए सटीकता और परिशुद्धता परीक्षण के प्रतिनिधि परिणाम । CHAA = ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख, आईसीपी-MS = inductively मिलकर प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी, एसडी = मानक विचलन ।

फ़ील्ड संख्या प्रजातियों जिगर गुर्दे
Amg CHAA आईसीपी-MS Amg CHAA आईसीपी-MS
TP20111116 Gg ७.४८ १६.८२ २१.८२ ८.८२ ०.६४ ०.४२
TC20110611 को ४.५० १०.१२ २.७७ १.५२ ०.११ ०.०५
TC20110722 को १.२० २.७० ३.८६ ०.११ ०.०१ ०.०५
TD20110608 Lh ०.३४ ०.७६ ०.०६ ०.२१ ०.०२ ०.०५
TP20110830 Lh ६.२१ १३.९७ १४.९३ ९.४३ ०.६९ १.०४
IL20110101 सा २.६७ ६.०० १.७३ ५.२६ ०.३८ ०.१४
* जिगर और गुर्दे के लिए CHAA की दुर्गति समीकरणों थे क्रमशः y = २.२४९ × x (समायोजित r2 = ०.७४) और y = ०.०७२८८ × x (समायोजित r2 = ०.६९) ।

2 तालिका: AMG सकारात्मक मूल्यों, एजी सांद्रता (μg/जी, शुष्क वजन) ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख (CHAA), और एजी सांद्रता (μg/जी, शुष्क वजन) द्वारा अनुमानित जिगर और गुर्दे के ऊतकों से आईसीपी-MS द्वारा मापा छह असहाय केटासियन । जीजी = Grampus griseus, Ko = Kogia एसपीपी., Lh = Lagenodelphis hosei, सा = Stenella attenuata.

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Discussion

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लेख के अध्ययन के प्रयोजन के लिए एक सहायक विधि को उपअंग के स्तर पर एजी वितरण का मूल्यांकन करने के लिए और ह्वेल ऊतकों में एजी सांद्रता अनुमान स्थापित है । वर्तमान प्रोटोकॉल शामिल है 1) आईसीपी द्वारा ह्वेल ऊतकों में एजी सांद्रता का निर्धारण-MS, 2) जोड़ी के विश्लेषण-ज्ञात एजी सांद्रता के साथ ऊतक के नमूनों का मिलान, 3) प्रतिगमन मॉडल की स्थापना (CHAA) एजी सांद्रता का आकलन करने के लिए द्वारा सकारात्मक मूल्यों AMG, 4) सटीकता और CHAA की परिशुद्धता के मूल्यांकन, और 5) CHAA द्वारा एजी सांद्रता का आकलन ।

इस अध्ययन में, आईसीपी-MS के डेटा काफी थे और सकारात्मक मूल्यों amg के उन लोगों के साथ संबंधित है, सुझाव है कि ह्वेल ऊतकों में एजी एकाग्रता amg सकारात्मक मूल्य से अनुमान लगाया जा सकता है । इसलिए, CHAA, जो AMG सकारात्मक मूल्य और प्रतिगमन मॉडल पर आधारित है, केटासियन के जिगर और गुर्दे के ऊतकों में एजी सांद्रता का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है । सामान्यतया, अधिक पैरामीटर (यानी, एक अधिक जटिल प्रतीपगमन मॉडल) के साथ एक प्रतीपगमन मॉडल डेटा में अच्छी तरह से फिट बैठता है, लेकिन यह अनिर्धारित है कि अधिक जटिल एक वास्तव में एक सरल से बेहतर है । इसलिए, श्रेष्ठ प्रतीपगमन मॉडल सांख्यिकीय विश्लेषण26,27द्वारा चुना जाना चाहिए सांख्यिकीय विश्लेषण के परिणाम इंगित करते हैं कि रेखीय प्रतीपगमन मॉडल में AMG धनात्मक मान12पर आधारित Ag एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए पर्याप्त है ।

गुर्दे के ऊतकों के लिए CHAA में, सटीक परीक्षण का मतलब एसडी (०.३५) सटीकता परीक्षण (०.१६) की तुलना में बड़ा था. इसके विपरीत, जिगर ऊतक के लिए CHAA में, सटीक परीक्षण का मतलब एसडी (२.८) सटीकता परीक्षण (३.२४) की तुलना में छोटा था. इस परिणाम के आधार पर, यह सुझाव दिया है कि AMG सकारात्मक संकेतों और अपेक्षाकृत कम ह्वेल गुर्दे ऊतक में एजी सांद्रता के असमान वितरण गुर्दे के ऊतकों के लिए CHAA की परिशुद्धता के साथ नकारात्मक हस्तक्षेप । इसलिए, गुर्दे के ऊतकों के लिए CHAA सटीक लेकिन गलत हो सकता है । हालांकि, AMG सकारात्मक संकेतों और ह्वेल जिगर के ऊतकों में अपेक्षाकृत उच्च एजी सांद्रता का भी वितरण सुझाव है कि जिगर ऊतक के लिए CHAA एक विश्वसनीय विधि ह्वेल जिगर के ऊतकों में एजी सांद्रता का अनुमान है । इसके अलावा, अगर आईसीपी द्वारा निर्धारित ज्ञात एजी सांद्रता के साथ अधिक ऊतकों-MS उपलब्ध हैं, एक और अधिक सटीक और सटीक प्रतिगमन मॉडल एजी एकाग्रता का अनुमान करने के लिए विकसित किया जा सकता है ।

हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल पशु ऊतकों में एजी की जांच करने के लिए एक सहायक विधि प्रदान करते हैं, AMG विधि पर कुछ सीमाएं ध्यान दिया जाना चाहिए । पहले, झूठी-सकारात्मक AMG संकेतों अंय भारी धातुओं से हस्तक्षेप के कारण उपस्थित हो सकता है, जैसे पारा, विस्मुट और28जस्ता के रूप में । इसलिए, AMG विधि के परिणामों को अंय विशिष्ट विधियों, जैसे आईसीपी-MS, के साथ की व्याख्या करने के लिए भारी धातुओं की वास्तविक संरचना28की निगरानी है । दूसरा, यह एक homogenously वितरित भारी धातु का पता लगाने के लिए मुश्किल है क्योंकि यह उज्ज्वल अमली AMG सकारात्मक संकेतों, जो सूक्ष्म परीक्षा के तहत दृश्य द्वारा पहचाना नहीं जा सकता है उत्पंन कर सकते हैं । इसके अलावा, अमली और चमकीला amg सकारात्मक संकेतों के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण मुश्किल है क्योंकि AMG सकारात्मक संकेतों का रंग पृष्ठभूमि के समान हो सकता है (जैसे, अमली AMG सकारात्मक संकेतों में पाया समीपस्थ गुर्दे नलिकाओं के लुमेन) । इसलिए, AMG धनात्मक संकेतों छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में थ्रेशोल्ड के कट-ऑफ मान का समायोजन करने के बाद हाइलाइट नहीं किया जा सकता है । तीसरा, amg सकारात्मक मूल्यों amg सकारात्मक संकेतों के क्षेत्र के प्रतिशत पर आधारित हैं, क्योंकि यह संभव है कि उच्च केंद्रित भारी धातुओं के मूल्यों को कम करके आंका जा सकता है ।

FFPE नमूनों को इकट्ठा करने और स्टोर करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं, और हमारे पिछले अध्ययन है कि वर्तमान AMG विधि सफलतापूर्वक FFPE नमूने पर 15 साल12के लिए संग्रहीत बढ़ाना कर सकते है दिखा दिया है । AMG का तंत्र विभिंन पशु प्रजातियों से प्रभावित नहीं है, के लिए यह बेतहाशा विभिंन पशु प्रजातियों में इस्तेमाल किया गया है20,29,30,31। हालांकि वर्तमान लेख केटासियन पर केंद्रित है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल भी विभिंन पशु प्रजातियों में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, आईसीपी-एमएस के साथ AMG विधि की लागत अपेक्षाकृत कम है (के रूप में लेजर पृथक की तुलना में-आईसीपी-ms), और इस प्रकार वर्तमान प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं या पर्याप्त अनुसंधान धन की कमी के लिए वितरण की जांच देशों के लिए मूल्यवान है और पशुओं के ऊतकों में भारी धातुओं की एकाग्रता । अंत में, मात्रात्मक विश्लेषण के साथ AMG का उपयोग करने के लिए स्थानीयकरण और अर्द्ध मात्रा भारी धातुओं spatio-लौकिक और पार प्रजातियों के अध्ययन के लिए एक सुविधाजनक पद्धति प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम ताइवान ह्वेल सोसायटी, ताइपे सहित नमूना संग्रह और भंडारण के लिए ताइवान ह्वेल किनारा नेटवर्क का धन्यवाद; ह्वेल अनुसंधान प्रयोगशाला (प्रो धारणाधिकार-सियांग चाऊ), पारिस्थितिकी और विकासवादी जीवविज्ञान संस्थान, राष्ट्रीय ताइवान विश्वविद्यालय, ताइपे; राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान संग्रहालय (Dr. Chiou-जू याओ), ताइचुंग; और समुद्री जीव विज्ञान और ह्वेल अनुसंधान केंद्र, राष्ट्रीय चेंग-कुंग विश्वविद्यालय । हम भी वानिकी ब्यूरो, कृषि परिषद, उनके परमिट के लिए कार्यकारी युआन धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HQ Silver enhancement kit Nanoprobes #2012
Surgipath Paraplast Leica Biosystems 39601006 Paraffin
100% Ethanol Muto Pure Chemical Co., Ltd 4026
Non-Xylene Muto Pure Chemical Co., Ltd 4328
Silane coated slide Muto Pure Chemical Co., Ltd 511614
Cover glass (25 x 50 mm) Muto Pure Chemical Co., Ltd 24501
Malinol Muto Pure Chemical Co., Ltd 20092
GM Haematoxylin Staining Muto Pure Chemical Co., Ltd 3008-1
10% neutral buffered formalin solution Chin I Pao Co., Ltd ---
Tip (1000 μL) MDBio, Inc. 1000
PIPETMAN Classic P1000 Gilson, Inc. F123602
15 ml Centrifuge Tube GeneDireX, Inc. PC115-0500
Dogfish liver National Research Council of Canada DOLT-2
Dogfish muscle National Research Council of Canada DORM-2
Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) PerkinElmer Inc. PE-SCIEX ELAN 6100 DRC
FreeZone 6 liter freeze dry system Labconco 7752030 For freeze drying
BRAND® SILBERBRAND volumetric flask Merck Z326283
30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure Savillex Corporation 200-030-12 For diagestion
Nitric acid, superpur®, 65.0% Merck 1.00441 For diagestion
Hot Plate/Stirrers Corning® PC-220 For diagestion
High Shear lab mixer Silverson SL2T For homogenization
Sterile polypropylene sample jar (250mL) Thermo Scientific™ 6186L05 For homogenization
Digital camera Nikon Corporation DS-Fi2
Light microscope Nikon Corporation ECLIPSE Ni-U
Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome Thermo Scientific™ A78100001H
Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome Sakura 1429
Microtome blade S35 FEATHER® 207500000
Slide staining dish and cover Brain Research Laboratories #3215
Steel staining rack Brain Research Laboratories #3003
Shandon embedding center Thermo Scientific™ S-EC
Shandon Citadel® tissue processor Thermo Scientific™ 69800003
Slide warmer Lab-Line Instruments 26005
Water bath Shandon Capshaw 3964
Filter paper Merck 1541-070
Prism 6.01 for windows GraphPad Software Statistic software
ImageJ National Institutes of Health
Stainless steel tissue embedding mould Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd RD-TBM003 For paraffin emedding

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References

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ह्वेल ऊतकों में information and अर्द्ध-मात्रा चांदी के Autometallography का प्रयोग
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Li, W. T., Liou, B. Y., Yang, W. C., Chen, M. H., Chang, H. W., Chiou, H. Y., Pang, V. F., Jeng, C. R. Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues. J. Vis. Exp. (140), e58232, doi:10.3791/58232 (2018).More

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