Summary
Het doel van het protocol is te tonen longitudinale intravital real-time tracking van thymocytes door laser scanning microscopie in serie implantaten in de voorste kamer van het oog van de muis. De transparantie van het hoornvlies en vascularisatie van de prothese zorgt voor de continu opname progenitor cel aanwerving en rijpe T-cel-uitgang.
Abstract
Het doel van de methode die wordt voorgesteld is om te laten zien, voor de eerste keer, van de transplantatie van pasgeboren thymi in de voorste oog kamer van isogene volwassen muizen voor in vivo longitudinale real-time bewaking van thymocytes´ dynamiek binnen een gevacuoliseerd Thymus segment. Na de transplantatie kan laser scanning microscopie (LSM) via het hoornvlies in vivo noninvasive herhaalde beeldvorming op het niveau van de cellulaire resolutie. Nog belangrijker is, de aanpak wordt toegevoegd aan eerdere intravital T-cel rijping imaging modellen de mogelijkheid voor continue progenitor cel werving en rijpe T-cel egress opnames in hetzelfde dier. Extra voordelen van het systeem zijn de transparantie van het geënte gebied, toelaat macroscopische snelle controle van de geïmplanteerde weefsels, en de toegankelijkheid van het implantaat waardoor gelokaliseerd naast systemische behandelingen. De belangrijkste beperking wordt het volume van het weefsel dat past in de beperkte ruimte van de kamer van de ogen die voor kwab trimmen eist. Integriteit van orgel wordt gemaximaliseerd door de ontrafeling van de thymus kwabben in patronen die eerder functioneel voor volwassen T-cel-productie te zien. De techniek is potentieel geschikt voor het ondervragen van een milieu van medisch relevante vragen met betrekking tot de functie van de thymus autoimmuniteit, immunodeficiëntie en centrale tolerantie; processen die mechanistically slecht gedefinieerde blijven. De fijne dissectie van mechanismen begeleiden thymocyte migratie, differentiatie en selectie moet leiden tot nieuwe therapeutische strategieën gericht op ontwikkeling T-cellen.
Introduction
Intrathymic differentiatie van de T-cel en T-cel populaties selectie vormen belangrijke processen voor de ontwikkeling en het onderhoud van cel-gemedieerde immuniteit in gewervelde dieren1. Dit proces omvat een complexe opeenvolging van strak georganiseerde evenementen, waaronder de aanwerving van progenitoren uit de bloedbaan, celproliferatie en migratie, differentiële expressie van membraaneiwitten en massale geprogrammeerde celdood voor subsets selectie. Het resultaat is de release van volwassen T-cellen reactieve tot een ruim spectrum van vreemde antigenen tijdens het weergeven van geminimaliseerde reacties op zelf-peptides, welke eind-up koloniseren de perifere lymfoïde organen van de afzonderlijke2,3. Afwijkende thymocyte selectie van het repertoire van de αβTCR leidt tot auto-immune ziekte of onbalans immuun4 die voornamelijk voortvloeien uit gebreken tijdens de processen van de voorloper van de negatieve of positieve selectie, respectievelijk.
Directionele migratie van thymocytes over de zwezerik is intrinsiek op alle stadia van T-cel rijping en het is bedoeld als een reeks van gelijktijdige of opeenvolgende meerdere stimuli, met inbegrip van chemokines, lijm, en de lijm extracellulaire matrix (ECM) eiwit interacties3,5. De studie van vaste weefsels heeft verricht kritische informatie over de patronen van meningsuiting voor de trekkende signalen van de thymocyte in de gedefinieerde serie microenvironments5,6, terwijl ex vivo studies is gebleken dat twee bekende trekkende gedrag van thymocytes in twee histologisch vlakken van het orgel: slow stochastic bewegingen in de cortex en snelle, beperkte beweeglijkheid in de medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. verhoogde trekkende tarieven correleren met serie positieve selectie13 en negatieve selectie wordt geassocieerd met kruipende gedrag ondersteunen de hypothese dat de kinetiek van de reis door de zwezerik juiste bepaalt rijping van de thymocytes. Ondanks hun relevantie blijven de topologie van thymocyte-stromale cellen interacties en de dynamiek van de beweeglijkheid van de thymocyte over orgel microenvironments tijdens de rijping van de T-cel vaag.
De meeste ex vivo studies tot dusver verrichte omvatten foetale of reaggregate serie orgel culturen14,15, weefsel segmenten of intact serie kwab explantaten waar thymocyte bewegingen worden gevisualiseerd door twee-foton laser scannen microscopie (TPLSM)8, een intravital beeldvormende techniek met een beperkte maximale afstand werken en imaging diepte van 1 mm overeenkomstig het weefsel onderzocht16. In tegenstelling tot de moeizame serie orgel-culturen die afhankelijk van uitgebreide incubatie keer aan formulier 3D-structuren zijn, zowel de serie segment techniek en de intact serie kwab aanpak vergunning gecontroleerd invoering van bepaalde deelverzamelingen van vooraf met het label thymocytes in een inheemse weefsel het platform omgeving. Echter, aangezien de doorbloeding is afwezig in deze modellen, ze zijn duidelijk beperkt voor het bestuderen van het recruitment proces van zwezerik afwikkeling progenitoren (TSPs) naar de thymus parenchym of de dynamiek van de serie egression van volwassen T-cellen.
In vivo modellen voor de studie van de serie T-rijping celfysiologie in muizen bevatten de transplantaties van fragmenten of gehele orgaan lobben geplaatst ofwel binnen de nier capsule17 of intradermaal18. Hoewel deze opties hun nut toonde te ondervragen systemische functionele engraftment van het weefsel, beperkt de positie van de serie transplantaten diep binnen het dier of gedekt door ondoorschijnend weefsellagen hun gebruik voor in vivo onderzoek van implantaten door TPLSM.
De voorste kamer van het oog voorziet in een gemakkelijk toegankelijke ruimte direct toezicht van een geënte weefsel op grond van de transparantie van de cornea lagen. Voordeel is de basis van de kamer gevormd door de iris rijk aan bloedvaten en autonome zenuwuiteinden, waardoor snelle revascularisatie en reinnervation van protheses19,20. Dr. Caicedo heeft deze anatomische ruimte met succes gebruikt voor het onderhoud en longitudinaal onderzoek naar alvleesklier eilandjes in de afgelopen21. Hier, laten we zien dat deze strategie vormt niet alleen een geldige benadering van thymocytes dynamiek binnen de structuur van de native orgel te studeren, maar ook uniek toelaat om uit te breiden de in vivo longitudinale opnamen naar de studie van voorlopercellen werving en rijpe T-cel egression stappen in muis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Miami goedgekeurd alle experimenten volgens IACUC richtlijnen.
1. isolatie en trimmen van pasgeboren Thymi
- Bereiden alle reagentia en instrumenten door autoclaaf of andere methoden, steriele omstandigheden te waarborgen.
- Uitvoeren om te minimaliseren van verontreinigingen, alle chirurgische ingrepen onder de motorkap van een laminaire flow.
- Voorafgaand aan euthanizing donor muizen, vul een steriele schotel van 60 mm met steriele prechilled 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) en plaats deze op het ijs. Het zal worden gebruikt voor het spoelen en opslaan van de verwijderde thymi van donor muizen voorafgaand aan de transplantatie.
- Ga verder met het euthanaseren van pasgeboren donor muizen door onthoofding, overeenkomstig ethische richtsnoeren.
- Plaatst u de muisaanwijzer op steriel absorberend keukenpapier in een dorsale rechtop en spray, en later veeg, de buik van de muis met 70% ethanol.
- De borstholte bloot doordat een oppervlakkige V-vormige insnijding op het niveau van de onderbuik en snijd de huid met een paar rechte 10 cm ontrafeling van schaar na een ventral midline te verlaten een opening van ongeveer 0,5-1 cm op de borstniveau. Vouw de huid over elke kant van de borst bloot van de borstholte.
- Maak twee dieper 0,5-1 cm zijdelingse insnijdingen door middel van het middenrif en de ribbenkast met hetzelfde type schaar voor toegang tot de superieure mediastinum in de voorste borstholte. De zwezerik moet worden weergegeven als twee bleke kwabben pal boven het hart.
- Plaats een aantal gebogen pincet onder de thymus en trek verticaal om op te halen de volledige orgel. Voorkomen dat de foldback van de ribbenkast met een paar pincet. Indien nodig kunt fijne pincet zorgvuldig scheuren het bindweefsel rondom het orgel zonder het verstoren van de capsule voor het extraheren van het orgel.
Opmerking: Deze stap wordt vergemakkelijkt met behulp van een ontleden scope. - De geïsoleerde zwezerik onderdompelen in koude steriele 1 x PBS (pH 7.4) eerder weergegeven in een steriele schotel van 60 mm, en snijd de bindweefsel landengte met een scalpel te scheiden van de serie lobben. Verwijder eventuele puin uit de schotel zonder nadelige gevolgen voor de capsule. Om te minimaliseren van de tijd thymi zijn blootgesteld, trim tijm lobben vlak voor implantaat.
Opmerking: Elke geïsoleerde pasgeboren thymus zal meestal zes segmenten van ongeveer 1 mm breed voor een maximum van drie host muizen maken wanneer het ontvangen van implantaten in beide ogen. - Herhaal stap 1.4-1.9 voor elke donor muis. Isoleren om te minimaliseren van de tijd thymi zijn blootgesteld, een thymus tegelijk.
2. thymus implantatie in de voorste kamer van het oog
- Voorafgaand aan de transplantatie, tag en weeg elke ontvangende muis.
- Gebruik een dosis tussen 1-2% van de isofluorane dampen te anesthetize de ontvangende muis. Zorg ervoor u juiste afstomping door het ontbreken van reflex volgende teen snuifje voordat de chirurgische ingreep.
- Met zwezerik segmenten transplantatie als volgt:
- Plaatst u de muisaanwijzer in een ligfiets zijligging kant dus dat ene oog boven ligt rechtstreeks blootstaan aan de lens van het ontleden toepassingsgebied.
- Één van de geïsoleerde serie lobben liggen in de koude 1 x PBS (pH 7.4) accijnzen-60 mm schotel gevuld in stukjes met maximaal 1 mm breedte voor implantaat. Een zig-zag patroon om ervoor te zorgen dat elk segment serie cortex en medulla bevat volgen. Gebruik vannas schaar voor trimmen volgens richtlijnen in figuur 1A.
Opmerking: Trimmen van de thymus moet gebeuren vlak voor het implantaat te optimaliseren weefsel engraftment. - Beginnend in de basis van het hoornvlies overeenkomt met het chirurgische gebied, voeren de tip van een 40 mm G18 naald te maken een kleine snede in externe hoornvlies lagen zodat de ontleden schaar tip kan worden ingevoerd.
- Het maken van een 5-10 mm flank incisie direct rond de basis van het hoornvlies met behulp van vannas schaar terwijl de hoornvlies-opening stevig om te voorkomen dat opnieuw verzegelen. Gebruik pincet met platte uiteinden om weefselschade te voorkomen.
- Pak de gesneden hoornvlies epitheel en bloot de opening door het hoornvlies met een paar van flat-ended verlostang terwijl het duwen van een serie segment door de opening. Natte het oog met steriele 1 x PBS (pH 7.4) of kunstmatige tranen zo nodig ter voorkoming van uitdroging van de weefsels, totdat de manipulatie voltooid is.
- Druk zachtjes op het oppervlak van het oog de geïntroduceerde weefsel segment aan een laterale positie ten aanzien van de leerling voor het behoud van de eye´s functie glijden. Ervoor zorgen dat de prothese op een locatie tegenover het oog openen posterieure om interferentie te voorkomen met beeldvorming ligt door hazing.
- Met de hulp van platte Tang, drukt u op stevig, voor ongeveer 3-5 s, de twee zijden van de cornea opening tegen elkaar om zelfsluitende. De operatie vereist geen nieten of naaien.
- Als de transplantaten zijn uitgevoerd op beide ogen, zet u de muis over de laterale overkant rechtstreeks bloot het tweede oog aan de ontleden Microscoop lens en herhaal stappen 2.3.2-2.3.7.
- Na de operatie is voltooid, keren de muis naar een lege kooi voorverwarmde met een warmte lamp.
- Zorg ervoor dat elke getransplanteerde muis herwint volledige mobiliteit en bewustzijn alvorens het te plaatsen in een kooi gedeeld met andere dieren. Dit vindt meestal plaats binnen 1 uur na de operatie.
- Na transplantatie, behandelen van de muizen met pijnstillers, zo nodig, en de muizen voorzien van paracetamol met een concentratie van 1,6 mg/mL in het drinkwater.
- Herhaal stap 2.2-2.9 voor elke geadresseerde muis.
- Post-operatieve dierlijke activiteiten controleren, alsmede het uiterlijk van de geïmplanteerde ogen te detecteren van mogelijke gezondheidscomplicaties.
3. confocal beeldvorming van geïmplanteerde Thymi met behulp van 3D één foton fluorescentie confocale microscopie
- Anesthetize de geadresseerden muis met behulp van een dosis tussen 1-2% van de isofluorane dampen. Juiste afstomping zorgen door het ontbreken van reflex volgende teen snuifje voordat de imaging procedure
- Plaats de muis op een vaste fase Microscoop platform in een kant ligfiets zijligging dus dat ene oog boven ligt. Een warmte pad is geplaatst op het platform van de Microscoop om constante lichaamstemperatuur van muizen tijdens opnames.
Opmerking: Zie aanvullende figuur 1 voor meer informatie. - Het hoofd van de muis aansluit op een stereotaxic headholder en de knop om te bedwingen van de kop van de muis op een positie van de laterale zijde waardoor directe toegang van de doelstelling van de Microscoop voor het oog houden van de thymus prothese aan te passen.
- Plaats de snuit van de muis in een gasmasker te houden van het dier verdoofd gedurende de gehele procedure. Hierdoor is de aanpassing van de isofluorane dampen zo nodig.
- Om te vergemakkelijken de stabilisatie van het oog tijdens opnames terwijl het vermijden van de intrekking van de oogleden, trek terug de oogleden terwijl het oog in de cornea marge met een pincet, die hebben hun tips gedekt door een polyethyleen buis die zijn aangesloten op een Oest-2 stevige cardanische koppeling. Deze regeling toelaat een gestage fixatie van het hoofd en ogen en biedt flexibiliteit zonder verstoring van de doorbloeding in het oog, als eerder beschreven22.
Opmerking: Aanvullende cijfers 1B, C Toon de volledige vergadering. - Voeg een paar druppels van steriele zoutoplossing of kunstmatige tranen als de immersie vloeistof tussen het hoornvlies en de lens, alvorens de Microscoop doelstelling in het oog van de muis te brengen.
Opmerking: extra druppels zijn verstrekt over noodzaak gedurende de hele procedure te houden van de Microscoop pad en voorkomen dat oog drogen. - Eerst lage vergroting (5 X) objectief zoekt u de zwezerik in het veld Microscoop. Schakel over naar een hogere resolutie (10, 20 en 40 X) water onderdompeling dompelen doelstellingen met de lange afstand. Vermijd LSM photodamage en bleken van de serie implantaat door minimale laser macht toe te passen en scannen tijd zoveel mogelijk te verminderen. Dit wordt bereikt met behulp van de resonerende scanner van de Microscoop.
Opmerking: De confocal microscoop die we gebruiken is uitgerust met resonant scannen spiegels geschikt voor het verzamelen van beelden bij 25 frames/s. Andere merken hebben hun eigen microscopen met resonant scanners. - Selecteer de modus van de overname met behulp van de Microscoop software en de startmodus van de resonerende scanner. Vervolgens kiest u de XYZT imaging modus en de overname-instellingen als volgt configureren:
- De Argon laser inschakelen en aanpassen van de macht tot 30% voor fluorescentie excitatie.
- Kies van een laser lijn van excitatie en stel het akoestisch-optische lichtbundel besturingselement voor splitsing (AOBS) voor de verschillende emissie golflengten. Bovendien, om te ontdekken van backscatter en structuur van het weefsel af te bakenen, reflectie detectie gelijktijdig gebruiken.
Opmerking: Bij het selecteren van een reeks van kleuren voor excitatie (GFP en RFP), de AOBS is automatisch geprogrammeerd voor directe deze excitatie-lijnen op het model en het doorgeven van de uitstoot tussen hen. Bijvoorbeeld, voor GFP en RFP, gebruiken we smalle reflectie bands voor excitatie licht rond 488 nm en 561 nm, respectievelijk. Dit laat de brede banden voor het verzamelen van uitgestoten fluorescentie fotonen, waardoor de noodzaak voor laser power en overname keer. In de reflectie modus, wordt de AOBS gebruikt als een 50/50 balk splitter om het imago van de gereflecteerde licht in elke golflengte uit de buurt van degene die gebruikt zijn voor de detectie van de emissie van de fluorescentie. - Verzamelen van de uitstoot bij geselecteerde golflengte, kies een resolutie van 512 x 512 pixels en begin live imaging door op de knop Live , de winst-niveaus aan te passen als nodig (typisch winst is ongeveer 600 V).
- Definiëren van het begin en einde van de z-stack door zich te concentreren op de bovenkant van de serie implantaat en selecteer beginnen, dan verplaatsen naar de laatste vliegtuig dat kan worden gericht in de geïmplanteerde zwezerik en selecteer einde. Gebruik een z-stap grootte van 5 µm. De software zal automatisch het aantal confocal vliegtuigen berekenen.
- Kies het tijdsinterval voor de overname van elke z-stack (meestal 1,5 tot 2 seconden) en selecteer de optie verwerven totdat deze wordt gestopt voor continue imaging.
- Druk op de knop Start om te initialiseren.
- Het imago van de transplantaten herhaaldelijk op verschillende tijdstippen van hetzelfde dier herhaalt u stap 3.1-3.9.
Opmerking: Als het dier protheses op beide ogen houdt, opnames van beide ogen kunnen worden genomen door stappen te herhalen 3.2-3.9 nadat u bent overgeschakeld van de kant van de verticale positie van het hoofd van de muis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thymus van pasgeboren muizen werden geïsoleerd uit B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas muizen zoals beschreven in dit protocol (stappen 1.1-1.9). In deze transgene muizen regisseert de kip bèta actine promotor de uitdrukking van de rode fluorescerende eiwit variant DsRed. MST onder invloed van de onmiddellijke vroege enhancer vergemakkelijken van het volgen van implantaten cytomegalovirus (CMV).
Om te voorkomen dat weefsel afwijzing, isogene personen met genotype: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J werden geselecteerd als gastheer. In deze transgene muizen bestuurt de menselijke ubiquitin C-promotor de uitdrukking van verbeterde groen fluorescente proteïne (GFP) in alle weefsels, waardoor een duidelijk onderscheid tussen de ontvanger en donor weefsel. De actie van de menselijke ubiquitin C-promotor leidt tot differentiële GFP-expressiepatronen in bepaalde soorten hematopoietische cellen. In het bijzonder, T-cellen risiconiveaus een 2-fold hoger GFP expressie dan CD19+B220+ B cellen of andere perifere bloedcellen, die hun identificatie door kwantitatieve gevoelige technieken zoals vergemakkelijken kan stroom cytometry, zonder behoeften aan extra labeling. Bovendien, fluorescerende expressie in deze muizen wordt waargenomen in volwassen dieren, alsmede in alle stadia van de embryonale en het is uniforme binnen een cel type afkomst marker stabiliteit te verlenen.
Het patroon voor het trimmen van de thymus weergegeven in figuur 1A volgt op eerdere beschrijvingen van functionele thymus fragmenten geïmplanteerd in de nier capsula23. Deze procedure trimmen zorgt voor een vermindering van het totale volume van weefsel te worden geïmplanteerd met behoud van de functionele histologische basiseenheden van het orgel (cortex, medulla en cortico-Wallenberg junction (CMJ) bloedvaten). Het opmerkelijke verschil in de grootte tussen pasgeboren zwezerik (figuur 1A, links) en thymus van één - weken oude muizen (figuur 1A, rechts) moet worden meegewogen voor trimmen, als de ruimte beschikbaar te passen in de voorste kamer van de muis implantaten oog is beperkt. De hier gepresenteerde resultaten omvatten de implantaten pasgeborenen alleen verkregen. Figuur 1B toont een macroscopische beeld van een serie segment geïmplanteerd in de voorste kamer van een GFP muis oog, voor het behoud van dierlijke visie ondergebracht. Histologische details van het implantaat met betrekking tot het hoornvlies (GFP weefsel grenzend aan RFP implantaat) kunnen worden waargenomen in de 3D-reconstructie van de confocal beelden in aanvullende Video 1. De engraftment aan de iris wordt weergegeven in de Video 1 en Figuur 2.
Figuur 1 c en 1 D respectievelijk helder veld illustreren en fluorescentie beelden van hetzelfde gebied dat voor een dubbele-macroscopische dienen kan follow-up van weefsel groei en involutie in voortzetting studies. Figuur 1 c illustreert ook de vascularisatie van de geïmplanteerde weefsels die uniek voor de bestudering van de Fysiologie van de thymus orgel bloedtoevoer langs tijd afhankelijk zou moeten toestaan.
De vascularisatie van de ingevoegde serie fragmenten is opgetreden binnen 72 uur na implantaat. Het snelle vascularisatie proces is goed akkoord met de grote hoeveelheid van de bloedvaten in de iris en de rijkdom van de thymus in cytokine productie gevonden. Deze kenmerken stellen snelle engraftment van de ingevoegde thymi. De vorming van implantaten wordt geïllustreerd in de Video 2, waaruit blijkt dat de engraftment van de serie bloedvaten met de iris´ van de host individuele (GFP weefsel grenzend aan RFP implantaat), daarom, waarin wordt bevestigd dat het model gepresenteerd hier, in feite, kan voor noninvasive continue monitorization van gevacuoliseerd zwezerik op microscopisch niveau. Het gebruik van LSM te visualiseren endogene thymus of zwezerik eerder geïmplanteerd in verschillende anatomische locaties wordt beperkt door weefsel dekking en de dikte van het weefsel van meer dan 1 mm. De voorste kamer van het oog wordt beschouwd als een "venster" naar het organisme te vergemakkelijken van de waarneming van de geïmplanteerde weefsels op microscopisch niveau.
Hier, is het aangetoond dat het model ontwikkeld door onze fractie toestaat de visualisatie van transmigratie van de cellen van het bloed torrent (Video 2) in de geïmplanteerde zwezerik (vermoedelijk progenitoren); voor het volgen van de contacten van GFP voorlopercellen inkomende in de serie implantaat met epitheliale en stromale serie inwoner cellen (RFP-geëtiketteerden) tijdens de processen van differentiatie en selectie (video's 3 en 4) en ook voor de uitgang van cellen (vermoedelijk volwassen T-cellen) in bloedvaten (Video 5).
De aanpak die we dus beschrijven vertegenwoordigt het "bewijs van beginsel", gebaseerd op opnames genomen tussen 72 uur en een maand na implantaat van zes personen getransplanteerde met de segmenten uit drie onafhankelijke pasgeboren donoren, voor een dier model dat vergunningen in vivo real-time tracking van thymocyte rijping in een gevacuoliseerd serie fragment door noninvasive procedures langs tijd, en als zodanig het protocol wellicht verdere verfijningen. Dit model kan worden verder uitgewerkt maken gebruik van transgene dieren herbergen gelabelde thymocyte moleculaire merkers, bijvoorbeeld als tl fusion producten, dus directe visualisatie van T-cel rijping tussenproducten toe te staan. Het systeem kan helpen oplossen van controverses en reageren incognitas gekoppeld aan thymocyte differentiatie en selectie evenementen onder andere.
Figuur 1. Vectorafbeeldingsbestanden van pasgeboren serie lobben van de donor en transplant in de voorste kamer van muizen oog. (A) pasgeborene (links) en een week na de geboorte (rechts) thymi beelden. Dash lijnen op pasgeboren thymus vertegenwoordigen gidsen voor het bereiden van secties voor transplantatie in de bedwelmingsruimte anterior oog van muizen voor het schatten van het maximum aantal transplantaties van een donor. (B) representatieve afbeelding toont onlangs geïmplanteerd zwezerik. (C) representatieve foto van geënt, gevacuoliseerd zwezerik 2 weken na implantaat. (D) beeld van de fluorescentie van zwezerik prothese op (C) weergegeven. Schaal balk wordt weergegeven (1 mm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Confocale afbeelding toont de details van de thymus segment (rood) engraftment in de iris (groen). Afbeelding verkregen met een Microscoop, met de volgende instellingen: 488 en 561 nm excitatie/500 en 575 nm emissie golflengten, 512 x 512 pixelresolutie en 40 X dompelen doelstelling met lange afstand. Schaal balk wordt weergegeven (40 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1. Setup voor confocal beeldvorming van serie entt u met behulp van 3D één foton fluorescentie laser confocal microscopie. (A) Heatpad, stereotaxic headholder en gasmasker details. (B) het instellen van de muis houdt de thymus prothese voor LSM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Video 1. In vivo imaging van zwezerik implantaten in de voorste kamer van het oog van de muis. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2. Werving van vermoedelijk thymus afwikkeling van progenitoren (TLP) van de bloedstroom (GFP) in de serie parenchym (RFP). Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 3. Stochastische verkeer van thymocytes (vroege serie progenitoren of ETP's) in de cortex. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 4. Interactie van thymocytes (GFP) met serie stromale cellen (RFP) cTECs (corticale serie epitheliale cellen) of mTECs (Wallenberg serie epitheliale cellen). Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 5. Real-time egress beeldvorming van potentiële volwassen T-cellen. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende Video 1. 3D -in vivo imaging van zwezerik implantaten in de voorste kamer van het oog van de muis. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege het belang van het rijpingsproces van de T-cel voor individuele immuun competentie4 en de vermoedelijke gevolgen van voorloper cel dynamiek op volwassen T-cellen geproduceerd door de thymus2,3, hebben uitgebreide inspanningen geïnvesteerd om alternatieven te ontwikkelen voor de aanpak van de momentopname klassieke vaste weefsel.
Hoewel weefsel segmenten en andere explantaten duidelijk superieur zijn op het reproduceren van weefsel architectuur dan monolayers of statistische serie orgel culturen14,15, het ontbreken van een verbinding met de therapieën beperkt hun gebruik te bestuderen de stappen van of Theelepel (translocatie van voorlopercellen over bloedvat endotheliale cellen barrière) en uitreis (translocatie van volwassen T-cellen in de hele bloedvat endotheliale cellen barrière) van het orgel. Zoals het hypothetische is dat de dynamiek van T-cel met andere cellen contacten, met inbegrip van de serie stromale cellen en hun beweeglijkheid over microenvironments binnen de cortex en de medulla bepalen hun status van differentiatie en het proces van de subpopulatie selectie (positief en negatief)2,3,4,5, en aangezien deze processen kunnen afhangen van een Theelepel en rijpe T-cel egress-evenementen, een model waarin de verbinding met de individual´s blood flow systeem zou wenselijk zijn.
Intradermale en nier capsule implantaten van de thymus toestaan voor deze upgrade17,-18. Ze vormen echter een invasieve methoden met opgelegde beperkingen aan imaging door TPLSM als gevolg van de diepe positie van het implantaat in het lichaam of de aanwezigheid van ondoorzichtige lagen van weefsel boven de prothese. De aanpassing van de muis anterior oog kamer, vroeger als een "venster"21,22 lengterichting bewaken van de prestaties van verschillende weefsels, zoals een site voor het bijhouden van T-cellen binnen een gevacuoliseerd zwezerik verschillende voordelen biedt ten opzichte van andere strategieën van de transplantatie. Aan de ene kant is de operatie eenvoudiger omdat geen hechtingen nodig, wat leidt tot sneller herstel van host dieren zijn. Aan de andere kant hoeft de waarneming van implantaten niet een extra chirurgie als het gebeurt voor nier capsule implantaten, waardoor herhaalde opnames van hetzelfde dier. De bijzondere anatomische kenmerken van het oog laat bovendien gemakkelijk moduleren regelgevende ingangen van de geïmplanteerde weefsels niet alleen systemisch maar ook lokaal. Zoals eerder is beschreven, met deze benadering, kunnen stoffen worden toegepast op het oog topisch of geïnjecteerd in de voorste oog kamer. Het vertegenwoordigt ook een eenvoudige optie in te voeren stoffen of cellen rechtstreeks in de thymus (dwz., progenitoren of rijping tussenproducten label ex vivo en adoptively overgedragen), die is van oudsher een zeer complexe procedure Als gevolg van de thymus anatomische locatie24,25. Bovendien toelaat de doorbloeding van de voorste kamer de uitwisseling van de aqueous humor of laden van de prothese door diffusie met fluorescerende indicatoren, zoals eerder weergegeven voor andere soorten implantaten26.
De aanpak waarmee de studie van zwezerik fysiologie getrouwer wordt verzorgd door de intravital beeldvorming van transgene medaka vis uiting van fluorescently geëtiketteerde lymfocyt markeringen. De transparantie van medaka tijdens de ontwikkeling en gedurende het hele leven in vele medaka spanningen is dit organisme voordelig zijn voor het toezicht op de cellulaire dynamiek in vivo21. Het geringe aantal motile thymocytes waargenomen in medaka (29%),18 met betrekking tot mouse´s (95%)13, naast de beweeglijkheid tariefverschillen tussen deze twee organismen, maar suggereert dat de kou bloed kleinste gewervelde met een adaptieve immuunsysteem kan worden beperkt op het openbaren van bepaalde mechanistische kinetiek van hogere gewervelde T-cel rijping gebeurtenissen.
Een beperking van het gebruik van de voorste kamer van het oog van de muis als de site voor de thymus transplantatie is beperking van de ruimte. Lange termijn studies kunnen, daarom, in het gedrang komen; met name voor pasgeboren of embryonale weefsels met uitgebreide groeipotentieel. In dit opzicht moeten we vaststellen dat hoewel pasgeboren implantaten gepresenteerd met duidelijk weefsel expansie na de eerste week na implantaat in de muis oog (gegevens niet worden weergegeven), de uitbreiding niet lijkt te dreigen de integriteit van het oog tot twee maanden na implantaat. Toch moet het van belang om te evalueren of de omgeving van het weefsel van het implantaat (oog kamer, nier capsule of dermis) implant´s groei beïnvloedt en/of vascularisatie voordat de toereikendheid van de aanpak kan worden gebracht voor gedefinieerd toepassingen.
De grote insnede nodig op het hoornvlies om dat de overgang van de serie fragment naar de voorste oog kamer leidt soms tot enkele hazing op dit niveau (gegevens niet worden weergegeven), meest waarschijnlijk verband met zekere fibrose gekoppeld aan het genezingsproces. Aandacht wordt verlangd op stap 2.3.6 van het protocol om ervoor te zorgen dat als hazing optreedt zal minimaal verstoren de stroomafwaartse imaging stappen. Wanneer de incisie wordt op een laterale niveau gemaakt, het implantaat noch de hazing moet aanzienlijk dieren gezicht prestaties beïnvloeden.
De behoefte aan weefsel trimmen te maken van de zwezerik die passen in de oog-kamer lijkt te zijn een nadeel als in vergelijking met andere anatomische sites waarvoor geen wijziging van de anatomische integriteit van het orgaan. Niettemin, de nier capsule aanpak is gebleken dat de fragmenten van de thymus, die beide bevatten, cortex en medulla verkregen door soortgelijke dissectie richtsnoeren op die worden weergegeven in Figuur 1, volledig functionele geworden zoals zij T-cel reconstrueren kunnen gemedieerde immuniteit van immunodeficiëntie thymeless hosts18. Dit betoogt ten gunste van intact functionele eigenschappen van dit type van zwezerik segmenten. Ook het protocol beschreven hier benadrukt dat de geïsoleerde zwezerik in kou (stap 1.9) moet worden bewaard en alleen getrimd vlak voor implantaat (stap 2.3.2) tot een minimum beperken van koude ischemie en weefsel exposure naar weefsel engraftment optimaliseren.
Een extra mogelijke beperking van de aanpak die zich bevindt in de samenstelling verschillen tussen de aqueous humor in de voorste kamer van het oog en bloedplasma, probleem dat moet worden bewaard in gedachten wanneer vertolking opmerkingen gemaakt bij deze anatomische locatie . Eerdere studies met andere weefsels, echter hebben niet gemeld geen duidelijke effecten op normale graft functie door de lokale oog milieu22. Hoewel de ervaring met het gepresenteerde model beperkt tot een klein aantal personen is (N = 6 en N = 3 voor ontvangers & donoren, respectievelijk) op dit moment deden we niet observeren belangrijke wijzigingen verbonden implantaat site in het geval van serie implantaten in een van de individuen hetzij.
Het hier gepresenteerde protocol vormt een bewijs-van beginsel voor de studie van intravital longitudinale beeldvorming van thymocyte dynamiek door het implanteren van serie weefsel in de voorste kamer van het oog van de muis. Als gevolg van de selectie van immunocompetent ontvangers, het systeem niet toe vraagtekens bij de systemische functie van de prothese. Toekomstige studies kunnen worden voortgebouwd op deze benadering door te kiezen voor verschillende donoren waarborgt en/of ontvangers en/of door het onderwerpen van de gastheer voor de bestraling en beenmergtransplantatie (BM) volgens bepaalde studie ontwerpen. Bijvoorbeeld de keuze van de SCID (strenge gecombineerde immunodeficiency) muizen als ontvangers elimineert de inmenging van endogene T-cellen, en de keuze van transgene muizen donoren (serie implantaat en/of BM) presenteren van T-cel markeringen, DC markeringen, serie stromale cel-markeringen, enz., afzonderlijk of in combinaties mogen toestaan dat directe in-vivo bijhouden van cellulaire subpopulaties. Anderzijds kon subpopulaties van cellen in de kamer van de voorste oog van muizen worden bijgehouden, zoals hiervoor is beschreven, door in vivo fluorescentie cytolabeling26.
Een groot voordeel van het hier gepresenteerde model is dat het mogelijk maakt voor de studie van voorlopercellen en volwassen T-cellen translocatie van en naar de bloedvaten. Dus, het moet relevant zijn om te bepalen als het snel verworven vascularisatie van de thymus na wordt ingeplant in de voorste eye zaal de endogene therapieën recapituleert. In het voordeel van deze mogelijkheid, moet worden vermeld dat de neovascularization in de voorste muis kamer lijkt te worden gedicteerd door de prothese18,20 in plaats van de ontvanger, en dus de verbindingen met de iris therapieën moet het behoud van de integriteit van endogene thymus cortico-Wallenberg junction (CMJ) domein.
Een bijkomend voordeel komt van het feit dat het systeem de evaluatie van twee onafhankelijke implantaten (twee anterior oog chambers toelaat) op identieke individuele achtergrond (één host). Studies die combinaties van weefsels kunnen ook vinden het voordelig om dit systeem te gebruiken.
Zoals de thymus een belangrijke rol in auto-immune en immuun-deficiënte pathologieën speelt, kan deze aanpak worden gebruikt om aan te pakken een groot aantal mogelijke kwesties. Met name mag het systeem macroscopische naast intra-orgel beeldvorming voor de progressie van de thymus involutie. Het kan ook dienen om transplantatie tolerantie gebeurtenissen en immuun disfuncties aan infecties gerelateerde studie. Het is waarschijnlijk dat de fijne dissectie van mechanismen inzake thymocyte rijping zorgt voor nieuwe aanwijzingen voor het ontwerp van aanvullende therapeutische strategieën gericht op ontwikkeling T-cellen.
Transplantatie van de thymus aan de voorste kamer van het oog neemt minder dan 45 min, met inbegrip van neonatale thymus isolatie en bijsnijden voor elke host individuele met implantaten in beide ogen. In vivo imaging opnames vereist 1 tot en met 5 h, afhankelijk van gecontroleerde functies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) en R21ES025673 (AC), en door de beste/2015/043-subsidie (Consellería de Educació, cultura ik esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spanje) (EO). Auteurs bedanken het team van de verzonden van de Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanje en Alberto Hernandez at Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanje voor hun hulp bij de video filmen en bewerken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
