Summary
프로토콜의 목표는 레이저 스캐닝 현미경 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 thymic 임 플 란 트에 의해 thymocytes의 경도 intravital 실시간 추적을 보여주는 것입니다. 각 막의 투명도는 이식의 vascularization 지속적으로 녹음 시 조 셀 모집 및 성숙한 T 세포 출구 수 있습니다.
Abstract
제시 되는 방법의 목적은 쇼, 처음으로, vivo에서 경도 실시간 모니터링를 vascularized 내에서 thymocytes´ 역학의 isogenic 성인 쥐의 앞쪽 눈 챔버로 신생아 thymi의 이식 thymus 세그먼트입니다. 이식, 다음 레이저 스캐닝 현미경 (LSM) 각 막 통해 비보에 비 침 투 적인 반복된 이미징을 셀룰러 해상도 수준에서 수 있습니다. 중요 한 것은, 접근에 추가 이전 intravital T 세포 성숙 모델 이미징 연속 조상 세포 모집 및 성숙한 T 세포 출구 녹음에 대 한 가능성 같은 동물에서 합니다. 시스템의 추가 장점은 이식 조직의 거시적인 신속한 모니터링 허용 이식할 영역의 투명도 그리고 조직의 치료 뿐만 아니라 지역화 된 임 플 란 트에 대 한 허용에 대 한 접근. 주요 제한 되 고 조직의 볼륨을 엽 트리밍에 대 한 요구는 눈 챔버의 감소 된 공간에 맞는. 기관 무결성 패턴 이전 성숙한 T 세포 생산에 대 한 기능 표시 thymus 돌출부를 해 부하 여 최대화 됩니다. 기술은은 잠재적으로 환경 의학 관련 질문 thymus 함수에 관련 된 면역, 면역 결핍, 중앙 허용;의 적합 하다 프로세스 mechanistically 가난 하 게 정의 된 남아 있는입니다. 지도 thymocyte 마이그레이션, 차별화 및 선택 메커니즘의 미세 해 부 소설 치료 전략 개발 T 세포를 대상으로 지도 해야 한다.
Introduction
Intrathymic T-세포 분화 및 T 세포 부분 모집단 선택 개발 및 척추 동물1셀 중재 면역의 유지 보수에 대 한 핵심 프로세스를 구성합니다. 이 과정에서 혈액, 세포 증식 및 마이그레이션 창시자의 채용, 막 단백질, 그리고 하위 집합에 대 한 대규모 프로그램 된 세포 죽음의 차동 식 등 긴밀 하 게 조직 된 이벤트의 복잡 한 순서를 포함 선택입니다. 결과 T-세포로 성숙 외국 항 원의 넓은 스펙트럼에 반응의 출시 자체-펩 티 드, 최소화 된 응답을 표시 하는 동안 주변 림프 기관 개별2,3의 식민지는 끝낼. ΑβTCR 레 퍼 토리의 탈 선 thymocyte 선택 자가 면역 질환 또는 면역 불균형4 주로에서 파생 되는 결함의 음수 또는 양수 전조 선택 프로세스 동안 각각 이끌어 낸다.
Thymus 걸쳐 thymocytes의 방향 이동 T 세포 성숙의 모든 단계에 본질적인 것 이며 그것은 일련의 동시 또는 순차적으로 발산, 접착제를 포함 하 여 여러 자극을 상상 하 고 드 접착제 세포 외 기질 (ECM) 단백질 상호 작용3,5. 고정 조직의 연구는 렌더링 정의 thymic microenvironments5,6, thymocyte 철새 단서에 대 한 표현의 패턴에 관한 중요 한 정보 ex vivo 연구 두 계시는 동안 널리 장기의 2 개의 조직학 명백한 지역에서 thymocytes의 철새 행동: 느린 피 질에서 확률적 움직임과 빠른, 한정 된 운동 성 정도7,8,,910 , 11 , 12 , 13. thymic 긍정적인 선택13 연관 증가 철새 요금 및 부정적인 선택 가설 thymus 통해 여행의 활동 적절 한 결정을 지 원하는 크롤링 동작와 연결 된 thymocytes 성숙 그들의 관련성에도 불구 하 고 thymocyte stromal 세포 상호 작용의 토폴로지 및 기관 microenvironments T 세포 성숙 동안에 걸쳐 thymocyte 운동 역학 병이 정의 유지.
대부분의 비보 전 날짜를 수행 연구 태아 포함 또는 thymic 기관 문화14,15, 조직 조각 또는 그대로 thymic 엽 explants thymocyte 움직임 2 광자 레이저 스캔 하 여 시각화는 reaggregate 현미경 검사 법 (TPLSM)8을 제한 된 최대 작동 거리 및 조직에 따라 1 mm의 깊이 이미징 intravital 이미징 기술16를 검사 합니다. 3D 구조 형성을 연장된 보육 시간에 따라 달라 지는 힘 드는 thymic 기관 문화, 달리 thymic 조각 기술과 그대로 thymic 엽 접근 허가 제어 소개의 특정 하위 집합의 모두, 사전 분류 thymocytes 네이티브 조직 건축 환경에. 그러나, 혈액 흐름은 이후 결 석이 모델은 명확 thymus thymus 실질 또는 성숙한 T 세포의 thymic egression 역학 창시자 (TSPs) 정착의 채용 과정을 공부에 대 한 제한.
Vivo에서 모델 쥐에서 thymic T 세포 성숙 생리학의 연구에 대 한 조각 또는 중 신장 캡슐17 또는 intradermally18안으로 배치 하는 전체 기관 돌출부의 이식 포함 됩니다. 비록 이러한 옵션 보여 조직의 조직 기능 engraftment가 그들의 유틸리티, thymic 이식 동물 내에서 깊은 또는 불투명 직물의 층에 의해 덮여의 위치 비보에 의해 임 플 란 트의 시험에 대 한 그들의 사용 제한 TPLSM입니다.
눈의 앞쪽 챔버 각 막 레이어의 투명도 덕택으로 어떤 이식할 조직을 직접 모니터링을 위한 쉽게 접근할 수 있는 공간을 제공 합니다. 이점의 홍 채에 의해 형성 된 챔버의 혈관과 자율 신경 엔딩, 빠른 revascularization 및 이식19,20reinnervation 풍부 하다. 박사 Caicedo 성공적으로 유지 보수 및 지난21에서 췌 장 독도의 종 적 연구에 대 한이 해 부 공간을 사용 하고있다. 자, 우리 보여이 전략 뿐만 아니라 네이티브 기관 구조 내에서 thymocytes의 역학을 공부 하는 유효한 접근을 구성 하지만 또한 고유 하 게 확장 하는 비보에 조상 모집의 연구에 경도 기록을 허용 하 고 성숙한 T 세포 egression 단계 마우스입니다.
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Protocol
기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 마이애미 대학의 IACUC 지침에 따라 모든 실험을 승인 했다.
1. 격리와 신생아 Thymi의 조정
- 모든 시 약 및 압력가 마로 소독 또는 멸 균 상태를 보장 하는 다른 방법으로 악기를 준비 합니다.
- 오염 최소화, 층 류 두건 아래 모든 수술 절차를 수행 합니다.
- Euthanizing 기증자 마우스, 이전 60 m m 메 마른 접시 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) x 살 균 prechilled 1를 얼음에 그것을 배치. Rinsing 하 고 기증자는 이식 전에 마우스에서 삭제 thymi를 저장 하기 위해 사용 됩니다.
- 윤리 지침에 따라 잘린 여 신생아 기증자 마우스를 안락사를 진행 합니다.
- 등 수직 위치에 스프레이, 멸 균 흡수 성 종이 타 올에 마우스를 놓고 나중에 닦 고, 70% 에탄올과 마우스 복 부.
- 낮은 복 부의 수준에서 피상적 V 자형 절 개 하 여 흉 강을 노출 하 고 직선 10cm 약 0.5-1의 개통을 두고 복 부 정중 선 다음가 위를 해 부 한 켤레와 함께 피부를 잘라 cm 가슴 수준에서. 흉 강 노출 가슴의 양쪽에는 피부를 접어.
- 막과 같은 유형의 앞쪽 흉 강에 우수한 mediastinum 액세스할 수가 위 흉 곽을 통해 확인 두 깊이 0.5-1 c m 측면 절 개. Thymus 심장 바로 위에 두 창백 엽으로 나타납니다.
- Thymus와 완벽 한 장기를 추출 수직으로 당겨 아래 곡선된 겸 자 집합 장소. 집게의 쌍으로 흉 곽의 폴드를 방지 합니다. 필요한 경우 미세 집게를 사용 하 여 신중 하 게 장기를 추출 하기 전에 캡슐을 방해 하지 않고 장기를 둘러싼 결합 조직 찢.
참고:이 단계는 해 범위를 사용 하 여 촉진 된다. - 차가운 멸 균 1 x PBS (pH 7.4) 이전 60 m m 메 마른 그릇에 표시 하 고 메스와 연결 지협 잘라 thymic 돌출부를 분리 하에 격리 thymus 잠수함. 캡슐을 해치지 않고 접시에서 모든 파편을 제거 합니다. Thymi 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 임 플 란 트 하기 전에 바로 백 리 향 엽 트림.
참고: 각 격리 된 신생아 thymus 양쪽 눈에 이식 받을 때 약 3 호스트 마우스의 최대 폭 1 m m의 6 세그먼트를 렌더링 됩니다 일반적으로. - 각 기증자 마우스에 대 한 1.4-1.9 단계를 반복 합니다. Thymi 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 한 번에 한 thymus를 격리 합니다.
2. thymus 이식으로 눈의 앞쪽 챔버
- 이식, 이전 태그와 각 받는 사람 마우스 무게.
- 받는 사람 마우스 anesthetize에 isofluorane 증기의 1-2% 사이의 복용량을 사용 합니다. 수술 절차를 시작 하기 전에 반사 다음 발가락 핀치의 부재에 의해 적절 한 anesthetization를 확인 합니다.
- Thymus 세그먼트 이식으로 다음과 같이 하십시오.
- 장소 마우스 측면 측면 기댄 위치에는 한쪽 눈 직면 하 고 그래서 해 범위의 렌즈에 직접 노출.
- 감기 1 x PBS (pH 7.4)에 누워 격리 thymic 돌출부 중 소비 세-임 플 란 트에 대 한 최대 1 mm 폭 60 m m 접시 조각으로 가득. 각 세그먼트 thymic 피 질과 수 질 포함 되도록 지그재그 패턴을 따릅니다. 욕실이 위를 사용 하 여 그림 1A에 제공 된 지침에 따라 트리밍에 대 한.
참고: thymus의 트리밍은 이식 조직 engraftment를 최적화 하기 전에 행해져야 한다. - 외과 영역에 해당 하는 각 막의 기지에 starting, 해가 위 팁 소개 될 수 있도록 외부 각 막 층으로 작은 절 개를 만들기 위해 40 mm G18 바늘의 팁을 소개 합니다.
- 5-10 m m 각 막 여 잡고 단단히 resealing 방지 하기 위해 전용 욕실이 위를 사용 하는 각 막의 기초의 주위에 직접 절 개 측면을 확인 합니다. 편평한 끝 집게를 사용 하 여 조직 손상을 방지.
- 잘라 각 막 상피를 파악 하 고 개방을 통해 thymic 세그먼트를 추진 하는 동안 평면 종단 집게의 쌍을 가진 각 막 눌러 여 노출. 조작이 완료 될 때까지 조직을 건조를 방지 하기 위해 필요에 따라 살 균 1 PBS (pH 7.4) 또는 인공 눈물으로 눈을 젖은.
- 부드럽게 눈 표면에 eye´s 함수를 유지 하기 위해 학생에 관하여 측면 위치를 소개 조직 세그먼트를 누릅니다. 그는 이식 거짓말 눈 반대 위치에 골 탕 먹 여 이미징 후부 간섭 방지 하 여 확인 합니다.
- 플랫 포 셉의 도움으로 눌러 단단히, 대 한 약 3-5 s, 서로 자기 봉인 홍보에 대 한 각 막 여의 두 측면. 스테이플링 또는 재 수술 필요 하지 않습니다.
- 양쪽 눈에 이식 수행, 마우스를 직접 해 현미경 렌즈에 두 번째 눈을 노출 하 고 반복 단계 2.3.2-2.3.7 측면 반대편 넘겨.
- 수술 완료 되 면, 열 램프와 prewarmed는 빈 케이지를 마우스를 반환 합니다.
- 각 이식된 마우스 차릴 다른 동물 들과 함께 공유 하는 감 금 소에 배치 하기 전에 완전 한 성과 의식 하는 것을 확인 하십시오. 이 일반적으로 수술 후 1 시간 이내에 자리를 걸립니다.
- 이식 시 필요에 따라 진통제와 쥐를 치료 하 고 식 수에 1.6 mg/mL의 농도에서 아 세트 아미노 펜을 쥐를 제공 합니다.
- 각 받는 사람 마우스에 대 한 2.2 2.9 단계를 반복 합니다.
- 잠재적인 건강 합병증을 감지 하는 이식된 눈의 모양 뿐만 아니라 수술 동물 활동을 모니터링 합니다.
3. confocal 영상 3D 단일 광자 형광 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 이식 Thymi의
- Isofluorane 증기의 1-2% 사이의 복용량을 사용 하 여 받는 사람 마우스 anesthetize 적절 한 anesthetization 이미징 절차를 시작 하기 전에 반사 다음 발가락 핀치의 부재에 의해 보장
- 그래서 그 하나의 눈 위로 향하도록 사이드 측면 휴식 위치에서 고정된 단계 현미경 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 열 패드는 녹음 하는 동안 마우스의 일정 한 체온을 보장 하기 위해 현미경 플랫폼에 배치 됩니다.
참고: 자세한 내용은 보충 그림 1 을 참조 하십시오. - Stereotaxic headholder에 마우스의 머리를 삽입 하 고 노브 thymus 이식 들고 눈에 현미경 목표의 직접 접근 측면 사이드 위치에 마우스 머리 억제를 조정 합니다.
- 절차에 걸쳐 취 동물을 유지 하는 가스 마스크에 마우스 주 둥이 놓습니다. Isofluorane 증기 필요에 따라 조정 수 있습니다.
- 눈 꺼 풀의 철회를 피하 면 서 녹음 하는 동안 눈의 안정화를 촉진 하기 위하여 철수 눈 꺼 풀에 붙어 있는 그들의 팁을 폴 리 에틸렌 관으로 덮여 있는 핀셋의 쌍을 가진 각 막 여백에 눈의 상태를 UST-2 솔리드 범용이 음. 이 머리와 눈의 안정적인 정착을 허용 하 고 앞에서 설명한22로 눈에 혈액 흐름의 중단 없이 유연성을 제공 합니다.
참고: 보조 그림 1B, C는 전체 어셈블리 표시. - 마우스 눈에 현미경 목표를 배치 하기 전에 각 막과 렌즈 사이 침수 액체도 멸 균 식 염 수 나 인공 눈물 몇 방울을 추가 합니다.
참고: 추가 상품 현미경 경로 유지 하 고 눈의 건조를 방지 하는 절차를 통해 필요에 적절 하 게 됩니다. - 먼저 낮은 배율 (X 5) 렌즈를 사용 하 여 현미경 필드에서 thymus를 찾습니다. 다음 더 높은 해상도 (10, 20 및 40 X) 물 침수 긴 작동 거리와 목표를 찍기로 전환. LSM photodamage와 최소한의 레이저 파워를 적용 하 여 thymic 플 표백을 방지 하 고 가능한 스캔 시간을 단축. 이 현미경의 공명 스캐너를 사용 하 여 이루어집니다.
참고: 우리가 사용 하는 confocal 현미경 공명 검사 거울 25 프레임/s에서 이미지를 수집 능력을 갖추고 있다. 다른 브랜드는 공명 스캐너와 함께 자신의 현미경. - 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 수집 모드를 선택 하 고 공명 스캐너 모드 시작. 다음 XYZT 이미징 모드를 선택 하 고 인수 설정을 다음과 같이 구성:
- 아르곤 레이저를 켜고 형광 여기 30% 전력 조정.
- 여기 레이저 라인을 선택 하 고 다른 방출 파장 acousto 광 빔 스플리터 (AOBS) 제어를 설정 합니다. 또한, 후방 산란 검출 및 조직 구조를 나타내는, 사용 반사 탐지 동시에.
참고: 여기 (GFP와 RFP)에 대 한 색상의 세트를 선택할 때는 AOBS는 자동으로 프로그래밍이 여기 라인 표본에와 그들 사이의 방출 전송. 예를 들어, GFP와 RFP, 우리를 사용 하 여 좁은 반사 밴드 여기 빛 약 488 nm 및 561 nm, 각각. 이것은 내보낸된 형광 광자, 레이저 파워 및 수집 시간에 대 한 필요성 감소의 컬렉션에 대 한 광범위 한 밴드. 반사 모드에서는 AOBS 형광 방출 감지에 사용 하는 것 들에서 어떤 파장에서 반사 된 빛의 이미지를 50: 50 빔 스플리터로 사용 됩니다. - 선택 된 파장에서 방출 수집 다음 512 × 512 픽셀의 해상도 선택 하 고 필요에 따라 이득 레벨을 조정 하는 라이브 버튼을 눌러 이미징 라이브 시작 (일반적인 이득은 약 600 V).
- Thymic 임 플 란 트 위에 초점을 맞춤 으로써 시작 및 z 스택의 끝을 정의한 고 시작, 선택 다음 마지막 이식된 thymus에서 집중 될 수 있는 최종선택 평면 이동 합니다. 5 µ m의 z 단계 크기를 사용 합니다. 소프트웨어 자동으로 confocal 비행기의 수를 계산 합니다.
- 각 z-스택 (일반적으로 2 초에 1.5)의 수집에 대 한 시간 간격을 선택 하 고 연속 이미징 멈출 때까지 취득 옵션 선택.
- 초기화를 시작 버튼을 누릅니다.
- 이미지는 이식 반복적으로 같은 동물에서 서로 다른 시간에 단계 3.1 3.9를 반복 하 여 합니다.
참고: 동물 이식 양쪽 눈에 좋다면 어느 눈에서 녹음 단계 3.2 3.9 마우스 머리의 수직 위치 측을 전환 후 반복 하 여 이동 수 있습니다.
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Representative Results
Thymus 신생아 쥐에서 b 6에서에서 격리 했다. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas 쥐가이 프로토콜 (단계 1.1-1.9)에 설명 된 대로. 이러한 유전자 변형 쥐에서 닭 베타 걸 발기인 빨간 형광 단백질 변형 DsRed의 식을 지시합니다. 임 플 란 트의 추적을 촉진 세포 (CMV) 즉시 초기 증강의 영향 아래 산악 표준시.
조직 제거, 유전자와 isogenic 개인을 방지 하기 위해: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J 는 주인으로 선정 됐다. 이러한 유전자 변형 생쥐에서 인간 유비퀴틴 C 발기인 기증자와 받는 사람이 조직 사이 명확한 차별화에 대 한 허용 하는 모든 조직에 향상 된 녹색 형광 단백질 (GFP)의 표현에 지시 합니다. 인간의 유비퀴틴 C 발기인의 행동 특정 조 혈 세포 유형에 서 차동 GFP 식 패턴으로 이어집니다. 특히, T 세포 2-fold 높은 GFP 식 CD19 보다 수준을 제시+B220+ B 세포 또는 다른 주변 혈액 세포 수 용이 하 게 그들의 식별 양적 민감한 기술로 같은 흐름 없이 cytometry 추가 라벨 요구 또한,이 쥐에 형광 식 성인 동물 뿐만 아니라 모든 배아 단계에서 관찰은 그리고 마커 안정성 부여 셀 유형 혈통 내에서 균일 한.
Thymus 조정 그림 1A 에 표시에 대 한 패턴 기능 thymus 조각 신장 capsula23에 이식에 대 한 이전 설명 다음과 같습니다. 이 트리밍 절차 (피 질, 수 질 및 cortico 골 수 접합 (CMJ) 혈관) 장기의 기능적인 조직학 기본 단위를 유지 하면서 이식 조직의 총 볼륨의 감소에 대 한 수 있습니다. 주목할 만한 차이 크기에서 신생아 thymus (그림 1A, 왼쪽)와 thymus 1 주 된 쥐 (그림 1A, 오른쪽)에서 고려 해야한다 트리밍에 대 한 계정에 맞게 사용할 수 있는 공간 마우스의 앞쪽 챔버에 임 플 란 트 눈은 제한. 여기에 제시 된 결과 신생아만에서 얻은 임 플 란 트를 포함 합니다. 그림 1B 동물 비전을 유지 하기 위해 수용 GFP 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 이식 thymic 세그먼트의 거시적인 이미지를 보여줍니다. 참조 (GFP RFP 임 플 란 트에 인접 한 조직) 각 막 이식의 조직학 세부 사항은 보충 비디오1에서 공초점 이미지의 3 차원 재구성에 관찰할 수 있습니다. 홍 채에 engraftment 비디오 1 과 그림 2에 표시 됩니다.
그림 1C 및 1d 각각 밝은 필드를 설명 하 고 두 번 매크로 대 한 봉사 수 있습니다 동일한 영역의 형광 이미지 조직의 성장 및 계속 연구에 대 한 합의 후속. 그림 1C 는 또한 시간에 따라 장기 혈액 공급에 의존 thymus 생리학 공부에 대 한 유일 하 게 허용 해야 이식 조직의 vascularization를 보여 줍니다.
삽입 thymic 조각의 vascularization 72 h 후 임 플 란 트 내에서 발생 했습니다. 빠른 vascularization 과정이 좋은 계약에 홍 채와 cytokine 생산에서 thymus의 풍요로움을 발견 하는 혈관의 큰 금액. 이러한 특성 삽입 된 thymi의 빠른 engraftment를 사용합니다. 임 플 란 트의 vascularization에에서 설명 된 비디오 2, 개별 호스트의 iris´와 thymic 혈관의 engraftment를 보여주는 (GFP 조직 RFP 임 플 란 트에 인접 한), 따라서, 여기 제시 하는 모델에 대 한 사실, 수 확인 미세한 수준 vascularized thymus의 비 침범 성 연속 monitorization. LSM 생 thymus 또는 이전 다른 해 부 위치에 이식 thymus 시각화를 사용 하 여 조직 불투명도 및 조직 이상 1 m m의 두께 의해 제한 됩니다. 눈의 앞쪽 챔버는 이식된 조직 현미경 수준에서의 관측을 촉진 하는 유기 체에 "창"으로 간주 됩니다.
여기, 그것은 우리의 그룹에 의해 개발 된 모델 혈액 급류 (동영상 2)에서 세포의 이식된 thymus (아마도 창시자);으로 환생의 시각화 수 표시 상피와 실질 thymic 거주와 thymic 이식으로 들어오는 GFP 조상 세포의 연락처의 추적 세포 (RFP 표시) 차별화 및 선택 프로세스 (동영상 3 , 4) 중 고, 또한,는 출구에 대 한 혈관 (비디오 5)로 셀 (아마도 성숙한 T 세포).
따라서 설명 하는 접근 방식을 나타내는 "원리의 증거", 녹음 6 개인 3 명의 독립적인 신생아 기증자에서 세그먼트와 이식 후 이식 72 h와 한 달 간의 촬영을 바탕으로, 동물에 대 한 모델을 함께 시간, 비 침범 성 절차에 의해 실시간으로 추적 vascularized thymic 조각에서 thymocyte 성숙의 비보에 허용 등, 프로토콜 수 있습니다 필요 추가 수정. 이 모델 레이블이 thymocyte 분자 마커 등을 은닉 하는 유전자 변형 동물의 따라서 T-세포 성숙 중간체의 직접적인 시각화를 허용으로 형광 퓨전 제품 사용 하 고 밖으로 더 일 될 수 있습니다. 시스템은 논쟁을 해결 하는 데 도움이 하 고 incognitas 연결 thymocyte 차별화 및 선택에 다른 이벤트에 응답 수 있습니다.
그림 1입니다. 쥐 눈의 앞쪽 챔버로 신생아 thymic 돌출부가 기증자와 이식의 단면. (A) 신생아 (왼쪽) 및 1 주 출생 (오른쪽) thymi 이미지. 신생아 thymus에 대시 라인 하나의 기증자 로부터 이식의 최대 수를 추정 하는 쥐의 앞쪽 눈 챔버로 이식에 대 한 섹션을 준비 하는 가이드를 나타냅니다. (B) 대표 이미지 새로 thymus 이식. (C) 대표 이미지의 융합, thymus 2 주 후 임 플 란 트를 나가도록. (D) (C)에 표시 된 thymus 이식의 형광 이미지. 눈금 막대 (1 mm) 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 홍 채 (녹색)에 thymus 세그먼트 (레드) engraftment의 세부를 보여주는 confocal 이미지. 다음 설정을 사용 하 여 현미경으로 얻은 이미지: 488 고 561 nm 여기/500 및 575 nm 방출 파장, 512 x 512 픽셀 해상도 및 긴 작동 거리와 목표를 찍기 X 40. 눈금 막대 (40 µ m) 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1입니다. 설치 사용 하 여 3D 단일 광자 형광 thymic 이식의 confocal 영상에 대 한 레이저 confocal 현미경 검사 법. (A) Heatpad, stereotaxic headholder와 가스 마스크 세부 정보. (B)는 LSM thymus 이식 들고 마우스의 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1입니다. Vivo에서 화상 진 찰 thymus의 이식 마우스 눈의 앞쪽 챔버에. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 2입니다. 추정할 수 thymus thymic 실질 (RFP)에 혈 류 (GFP)에서 창시자 (TSP) 정착의 모집. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 3입니다. Thymocytes (초기 thymic 창시자 또는 ETPs) 피 질에서의 확률적 운동. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 4입니다. Thymic 기질 세포 (RFP)와 thymocytes (GFP)의 상호 작용 cTECs (대뇌 피 질의 thymic 상피 세포) 또는 mTECs (골 수 thymic 상피 세포). 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 5입니다. 잠재적인 성숙한 T 세포의 실시간으로 송신 이미징. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
보충 비디오 1. 3Dvivo에서 이미징 thymus의 이식 마우스 눈의 앞쪽 챔버에. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
개별 면역 능력4 T 세포 성숙 과정의 중요성 및 성숙한 T 세포 thymus2,3에 의해 생산에 선구자 세포 역학의 추정된 영향, 광범위 한 노력이 투자 되었습니다. 대안 클래식 고정된 조직 스냅샷 접근을 개발 하십시오.
조직 조각과 다른 explants는 분명히 우수한 재현 monolayers 또는 집계 thymic 기관 문화14,15보다 조직 아키텍처에서 비록는 맥 관 구조에 대 한 연결의 부재 제한 그들의 사용을 공부 하는 항목 또는 TSP (혈관 내 피 세포 장벽 가로질러 창시자의 전 좌)와 출구 (혈관 내 피 세포 장벽 가로질러 성숙한 T 세포의 전 좌) 기관에서의 단계. 그것은 T 세포의 역학 다른 세포와 접촉 가설로 thymic 기질 세포와 그들의 운동 피 질 및 모 수 내 microenvironments에 걸쳐 결정 부분 모집단의 과정과 그들의 분화 상태 선택 (긍정적 및 부정적)2,3,,45, 그리고 이후 이러한 프로세스는 TSP 및 성숙한 T 세포 출구 이벤트에 따라 달라질 수 있습니다, 포함 하는 individual´s에 연결 하는 모델 혈액 흐름 시스템 바람직한 것입니다.
Thymus의 피부와 신장 캡슐 보 형 물이 업그레이드17,18에 대 한 수 있습니다. 그러나, 그들은 침략 적 방법 영상 TPLSM에 의해 신체 내에서 임 플 란 트의 깊은 위치 또는 조직 위에 이식의 불투명 한 층의 존재 때문에 한계를 부과 구성. 이전으로 사용 되는 "창"21,22 경도 여러 조직의 성능을 모니터링 하 vascularized thymus 내 T-세포를 추적 하는 사이트 몇 가지 장점이 제공 마우스 앞쪽 눈 챔버의 적응 다른 이식 전략 대. 1 개의 측에 아무 봉합 필요, 호스트 동물의 빠른 회복을 선도 하기 때문에 수술은 간단. 다른 쪽에 임 플 란 트의 관찰 필요 하지 않습니다 추가 수술으로 신장 캡슐 임 플 란 트, 같은 동물에서 반복된 녹음에 대 한 허용에 대 한 발생. 또한, 눈의 특정 해 부 특성 쉽게 체계적으로 뿐만 아니라 또한 로컬로 이식된 조직에 규정 입력을 변조 하는 것 허용. 앞에서 설명한이 방법을,로 물질 눈에 몸에 붙이기도 적용 하거나 앞쪽 눈 챔버에 주입 될 수 있습니다. 그것은 또한 물질 또는 세포 thymus에 직접 소개 하기 쉬운 옵션을 나타냅니다 (즉,., 창시자 또는 성숙 중간체 비보 전 분류 하 고 adoptively 전송)는 전통적으로 매우 복잡 한 절차 thymus 해부학 위치24,25때문. 또한, 앞쪽 챔버의 관류 형광 표시기, 임 플 란 트26의 다른 유형에 대 한 이전 표시로 확산 하 여 수성 유머의 교환 또는 이식의 로드를 허용 합니다.
Thymus 생리학의 연구에 더 충실 하 게 있도록 접근 intravital 이미징 붙일 레이블된 림프 구 마커를 표현 하는 유전자 변형 메 다카 물고기의 의해 제공 됩니다. 개발 하는 동안, 많은 메 다카 긴장에 생활 내내 메 다카의 투명성은이 유기 체 vivo에서세포 역학21모니터링을 위한 유리한. 그러나 메 다카 (29%)18 mouse´s (95%)13,이 두 유기 체,, 운동 속도 차이 외에 관하여 관찰 메구미 thymocytes의 낮은 수 제안 추위와 작은 등뼈 동물 혈액을 적합 한 면역 계통은 더 높은 척 추가 있는 T 세포 성숙 이벤트의 특정 기계 활동 공개에 제한 있을 수 있습니다.
Thymus 이식에 대 한 사이트와 마우스 눈의 앞쪽 챔버의 사용의 한계가 공간 제한입니다. 장기 연구 수 있습니다, 그러므로, 손상; 특히 확대 성장 잠재력과 신생아 또는 미 발달 조직에 대 한 이런이 의미에서 우리는 비록 신생아 이식 마우스 눈 (데이터 표시 되지 않음), 확대에에서 첫 번째 주 후 이식 후 명백한 조직 확장 되 게 최대 위험에 눈의 무결성을 넣어 것 같지 않 았 2 개월 후 임 플 란 트를 명시 해야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 여부 (눈 챔버, 신장 캡슐 또는 진 피) 이식의 조직 환경 영향 implant´s 성장 및 접근의 타당성에 대 한 설정할 수 있습니다 전에 vascularization 정의 평가에 대 한 관심의 이어야 한다 응용 프로그램입니다.
Thymic 단편의 통로 앞쪽 눈 챔버에 이끌어 때때로 일부 허용 하는 각 막에 필요한 큰 절 개가이 수준 (데이터 표시 되지 않음)에서 신입생, 대부분의 섬유 증 치유 과정에 관련 된 어느 정도 관련. 관심 있는 경우 신입생 최소한 방해가 됩니다 다운스트림 이미징 단계 되도록 프로토콜의 단계 2.3.6에 요구 된다. 절 개는 측면 수준으로, 이식도는 신입생 크게 미치지 동물 시력 성능.
Thymus 눈 챔버에 적합 하도록 조직 트리밍에 대 한 필요 경우에 장기의 해부학 무결성을 변경 하지 않아도 다른 해부학 사이트에 비해 불이익을 것 처럼 보인다. 그럼에도 불구 하 고, 신장 캡슐 접근 보이고 있다를 포함 하는, 둘 다, 피 질과 수 질 나온 그림 1로 그들은 T 세포를 다시 구성할 수 있습니다 완전 기능성 될 그 비슷한 해 부 지침에 의해 얻은 thymus의 파편 immunodeficient thymeless 호스트18중재 면역. 이이 유형의 thymus 세그먼트의 본래 기능 특성에 찬성 하 여 주장 하고있다. 또한, 프로토콜 스트레스 절연된 thymus 감기 (단계 1.9)에 보관 해야 합니다 여기에 설명 된 고만 조직 engraftment 최적화 향해 찬 허 혈 및 조직의 노출을 최소화 하기 위해 임 플 란 트 (단계 2.3.2) 직전 손질.
눈과 혈액 플라스마, 명심 될 때 통역 관찰이 해 부 위치에서 해야 하는 문제의 앞쪽 챔버에 액의 조성 차이에 거주 하는 접근의 추가 잠재적인 제한 . 그러나 다른 조직, 이전 연구는, 현지 눈 환경22일반 이식 기능에 어떤 명백한 효과 보고 하지 있다. 경험을 여기에 제시 된 모델은 몇 가지 개인에 게 제한 (N = 6, N = 3 받는 사람 및 기증자, 각각) 현재 우리 사이트 thymic 이식의 경우 이식 하 관련 된 모든 주요 변경을 관찰 않았다 하지는 개인 중 하나.
여기에 제시 된 프로토콜 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 thymic 조직을 이식 하 여 thymocyte 역학의 intravital 경도 이미징의 연구에 대 한 증거의 원리 를 구성 한다. Immunocompetent 수신자의 선택으로 인해 시스템은 이식의 조직 기능에의 문을 허용 하지 않았다. 미래 연구는이 접근에 다른 기증자 또는 받는 사람을 선택 하 여 및/또는 방사선 및 특정 연구 디자인에 따라 골 수 (BM) 이식 호스트를 쓰는 하 여 만들 수 있습니다. 받는 사람으로 SCID (심한 결합 된 면역 부전) 쥐의 내 인 성 T-세포의 간섭을 제거 하는 예를 들어 유전자 변형 쥐 기증자 (thymic 이식 또는 BM)의 제시 T 세포 마커, DC 마커, thymic 기질 셀-마커, 등., 개별적으로 또는 조합에서 직접 vivo에서 세포 부분 모집단의 추적을 허용 한다. 또는, 마우스의 앞쪽 눈 챔버에 세포의 부분 모집단 수 추적 앞에서 설명한, 형광 cytolabeling26 비보에 의해.
여기에 제시 된 모델의 주요 장점 중 하나는 뿌리 및 성숙한 T 세포 전 그리고 혈관 쪽으로 공부에 대 한 수입니다. 따라서, 그것은 관련이 경우 눈 앞쪽 챔버에 이식 되 고 이후 thymus의 급속 하 게 취득된 vascularization이 생 맥 관 구조 결정 이어야 한다. 이 가능성에 찬성 하 여 그것은 언급 한다 앞쪽 마우스 챔버에 neovascularization 이식18,20 보다는 받는 사람 및 따라서 아이리스 맥 관 구조에 대 한 연결에 의해 결정 될 것으로 보인다 생 thymus cortico 골 수 접합 (CMJ) 도메인의 무결성을 보존 한다.
추가적인 이점은 동일한 개별 배경 (단일 호스트) 시스템 두 개의 독립적인 임 플 란 트 (두 눈 앞쪽 챔버)의 평가 허용 한다는 사실에서 온다. 연구 조직의 조합이 필요로 찾을 수 있습니다 또한 그것은이 시스템을 사용 하 여 유리.
Thymus는 면역과 면역 결핍 병 리에 중요 한 역할을,이 이렇게 잠재적인 질문의 무수를 해결 하기 위해 사용할 수 수 있습니다. 특히, 시스템 흉 선 퇴 화의 진행에 대 한 내부 기관 영상 뿐만 아니라 거시적인 허용 해야 합니다. 그것은 또한 이식 공차 이벤트 및 면역 장애 감염에 관련 된 공부 하 역할 수 있습니다. 그것은 가능성이 thymocyte 성숙 관리 메커니즘의 미세 해 부 개발 T 세포를 대상으로 하는 추가적인 치료 전략의 디자인에 대 한 새로운 단서를 제공할 것입니다.
눈의 앞쪽 챔버에 thymus의 이식 중 눈에 임 플 란 트와 개별 신생아 thymus 격리를 포함 하 고 각 호스트에 대 한 트리밍, 45 분 미만 걸립니다. Vivo에서 화상 진 찰 기록 모니터링된 기능에 따라 1 ~ 5 h 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 교부 금 R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) 및 R21ES025673 (AC)에 의해 고 최고/2015/043 그랜트에 의해 지원 되었다 (Consellería de Educació, 문화 나, esport Generalitat 발렌시아, 발렌시아, 스페인) (EO). 저자는 대학 Católica 드 발렌시아 산 비센테 Mártir, 발렌시아, 스페인, 센트로 데 Investigación 프린시페 펠리페, 발렌시아, 스페인에 대 한 그들의 비디오 촬영과 편집에서 알베르토 헤 르 난 데스에서 보낸 팀을 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
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