Summary
Målet med protokollen er å vise langsgående intravital sanntidssporing av thymocytes ved bruk av laser mikroskopi thymic implantater i fremre kammer av musen øyet. Gjennomsiktigheten av hornhinnen og endometrial blodkar av graftet tillater kontinuerlig opptak stamfar celle rekruttering og modne T-celle egress.
Abstract
Formålet med metoden som presenteres er å vise for første gang, transplantasjon av nyfødte thymi i fremre øye kammeret av isogenic voksen mus i vivo langsgående sanntids overvåking av thymocytes´ dynamikken i en Stangeriaceae Brisselen segmentet. Etter transplantasjon lar laserskanning mikroskopi (LSM) gjennom hornhinnen i vivo noninvasive gjentatte bildebehandling på mobilnettet oppløsning nivå. Viktigere, legger tilnærming til forrige intravital T-celle modning imaging modeller mulighet for kontinuerlig stamfar celle rekruttering og modne T-celle egress opptak i samme dyret. Ytterligere fordeler av systemet er gjennomsiktigheten av podet området, tillater makroskopisk rask overvåking av implantert vev, og tilgjengeligheten til implantatet tillater lokalisert i tillegg til systemisk behandlinger. Hovedbegrensningen er volumet av vev som passer i det nedsatte mellomrom av øyet kammer som krever for lobe trimmer. Orgel integritet er maksimert av dissecting thymus lobes i mønstre tidligere vist seg å være funksjonell for modne T-celle produksjon. Teknikken er muligheter egnet til å lage en kunstnerkoloni medisinsk relevante spørsmål knyttet til thymus funksjon som inkluderer autoimmunitet, immunsvikt og sentrale toleranse; prosesser som er mechanistically dårlig definert. Den fine Disseksjon av mekanismer guiding thymocyte overføring, differensiering og utvalg bør føre til romanen strategier målretting utvikle T-celler.
Introduction
Intrathymic T-celle differensiering og T-celle subpopulasjon utvalg utgjør nøkkelprosesser for utvikling og vedlikehold av celle-mediert immunitet i virveldyr1. Denne prosessen innebærer en omfattende rekke tett organiserte arrangementer inkludert rekruttering av progenitors fra blodet, celle spredning og migrasjon, differensial uttrykk for membran proteiner og massiv programmert celledød for delsett utvalg. Resultatet er utgivelsen av modne T-celler reaktiv til et stort spekter av utenlandske antigener mens minimerte Svar å selv-peptider som ender opp kolonisere perifere lymfoide organer av enkelte2,3. Avvikende thymocyte utvalg av αβTCR repertoaret fører til autoimmune sykdommer eller immun ubalanse4 som hovedsakelig avledet defekter i prosessene av negative eller positive forløper utvalg, henholdsvis.
Retningsbestemt overføring av thymocytes over thymus er sentral i alle faser av T-celle modning og det er tenkt som en rekke simultan eller sekvensiell flere stimuli, inkludert chemokines, lim, og de selvklebende ekstracellulær matrix (EFM) protein interaksjoner3,5. Studiet av fast vev har gjort kritisk informasjon om mønstre av uttrykk for thymocyte trekkfugler bunker i definerte thymic microenvironments5,6, mens ex vivo studier har avdekket to utbredt vandrende atferd av thymocytes i to histologisk forskjellige områder av orgelet: slow Stokastisk bevegelser i cortex og rask, trange motilitet i medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. økt vandrende priser korrelerer med thymic positive utvalg13 og negative utvalg er forbundet med virkemåte for kravlesøk støtter hypotesen at the kinetics av turen gjennom thymus avgjør riktig modning av thymocytes. Til tross for deres relevans fortsatt topologien for thymocyte-stromal cell interaksjoner og dynamikken i thymocyte motilitet over organ microenvironments under T-celle modning dårlig definerte.
De fleste ex vivo studier utført hittil inkluderer fosterets eller Kumuler på nytt thymic orgel kulturer14,15, vev skiver eller intakt thymic lobe explants der thymocyte bevegelser er visualisert ved to-fotonet laserskanning mikroskopi (TPLSM)8, en intravital tenkelig teknikk med begrenset maksimalt arbeidsavstand og tenkelig dybdeskarphet 1 mm i samsvar med vevet undersøkt16. I motsetning til de arbeidskrevende thymic orgel kulturene avhengig utvidet inkubasjon ganger skjemaet 3D-strukturer, både thymic stykke teknikken og intakt thymic lobe tilnærming tillatelse kontrollert innføring av bestemt delsett av pre merket thymocytes i en innfødt vev arkitektur miljø. Men siden blodstrøm er fraværende i disse modellene, de er tydelig begrenset for å studere rekrutteringsprosessen av thymus settling progenitors (TSPs) thymus parenchyma eller dynamikken i thymic egression av modne T-celler.
I vivo modeller for studier av thymic T-celle modning fysiologi i mus inkluderer graftene fragmenter eller hele orgel lobes plassert enten i nyre kapsel17 eller intradermally18. Selv om disse alternativene viste deres nytte å forhøre systemisk funksjonelle engraftment av vev, begrenser plasseringen av thymic grafts dypt inne dyr eller dekket av lag med ugjennomsiktig vev bruken for i vivo undersøkelse av implantater av TPLSM.
Det fremre kammeret av øyet gir en lett tilgjengelig plass for direkte overvåking av alle podet vev i kraft av gjennomsiktigheten av hornhinnen lag. Fordel er bunnen av kammeret dannet av iris rikt på blod fartøy og autonome nerveender, muliggjør rask revaskularisering og reinnervation av grafts19,20. Dr. Caicedo har brukt dette anatomiske området for vedlikehold og langtidsstudie av bukspyttkjertelen holmer i siste21. Her viser vi at denne strategien ikke bare utgjør en gyldig tilnærming for å studere thymocytes' dynamikken i den opprinnelige orgel strukturen, men også unikt tillater for å forlenge den i vivo langsgående opptak til studiet av stamfar rekruttering og modne T-celle egression trinn i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Miami godkjent alle eksperimenter i henhold IACUC retningslinjer.
1. isolering og Trimming av nyfødte Thymi
- Forberede alle reagenser og instrumenter av autoklavering eller andre metoder, sikre sterile forhold.
- For å minimere forurensing, utføre alle kirurgiske prosedyrer under laminær strømning hette.
- Før euthanizing donor mus, Fyll en 60 mm sterilt rett med sterilt prechilled 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7.4) og plasserer den på is. Det vil bli brukt for skylling og lagring av forbrukeravgift thymi fra donor mus før transplantasjon.
- Fortsette å avlive nyfødte donor mus ved halshogging, etiske retningslinjer.
- Plasser musen på steril, absorberende papirhåndklær dorsal stående og spray, og senere tørke, musen magen med 70% etanol.
- Vise bryst hulrom ved å gjøre en overfladisk V-formet snitt på nivå på nedre del av magen, og skjære huden med en rett 10 cm dissekere saks etter en ventrale midtlinjen å forlate en åpning på ca 0,5-1 cm på brystet nivå. Brett huden over hver side av brystet å avsløre bryst hulrom.
- Lag to dypere 0,5-1 cm lateral snitt gjennom membranen og brystkasse med samme type saks til brysthulen i fremre thoracic hulrom. Brisselen skal vises som to blek lobes rett over hjertet.
- Plassere et sett med buet tang under thymus og dra loddrett for å trekke ut hele orgel. Hindre foldback av brystkasse med en tang. Eventuelt kan du bruke fine tang å nøye flerre i bindevev omgir organ uten å forstyrre kapselen tidligere utdrager orgel.
Merk: Dette trinnet er tilrettelagt ved hjelp av en dissecting omfang. - Senk isolert thymus i kalde sterilt 1 x PBS (pH 7.4) tidligere vises i en 60 mm sterilt parabol, og kutte connective landbroen med skalpell skille thymic lobes. Fjern rusk fra parabolen uten å skade kapselen. For å minimere tiden thymi vises, kan du klippe timian lobes rett før protesen.
Merk: Hver isolert nyfødte thymus gjengis vanligvis seks segmenter av ca 1 mm bred for maksimalt tre vert mus når du mottar implantater i begge øynene. - Gjenta trinn 1.4-1.9 for hver donor musen. For å minimere tiden thymi vises, kan du isolere en thymus samtidig.
2. thymus implantasjon i det fremre kammeret av øyet
- Før transplantasjon, tag og veie hver mottaker musen.
- Bruk en dose mellom 1-2% av isofluorane damp til å bedøve mottaker musen. Sikre riktig anesthetization ved fravær av refleks følgende tå knipe før den kirurgiske prosedyren.
- Fortsette med thymus segmenter transplantasjon som følger:
- Plass musen i siden lateral tilbakelent posisjon slik at ett øye vender opp. direkte utsatt for linsen av dissecting omfanget.
- Avgiftsdirektoratet blant isolerte thymic lobes liggende i kalde 1 x PBS (pH 7.4)-fylt 60 mm parabolen i stykker med opptil 1 mm bredde for implantatet. Følg en sikk-sakk mønster for å sikre at hvert segment inneholder thymic cortex og forlengede. Bruk vannas saks for trimming i henhold til retningslinjene i figur 1A.
Merk: Trimming av brisselen bør gjøres rett før protesen å optimalisere vev engraftment. - Starter i bunnen av hornhinnen tilsvarer det kirurgiske området, introdusere spissen av en 40 mm G18 nål å gjøre et lite innsnitt i eksterne hornhinnen lag slik at dissecting saks spissen kan innføres.
- Gjør en 5-10 mm flanke snitt direkte rundt foten av hornhinnen bruke vannas saks mens du holder hornhinnen åpningen fast for å hindre resealing. Bruk tang med flate ender for å unngå skade på vev.
- Forstå kuttet hornhinnen epitel og utsette åpningen ved å holde hornhinnen med en flat-slutt tang mens skyve et thymic segment gjennom åpningen. Våt øyet sterilt 1 x PBS (pH 7.4) eller artificial tårer for å hindre vev uttørking til manipulering er fullført.
- Trykk sakte på øyet overflaten å skyve introdusert vev segmentet til en lateral posisjon med hensyn til eleven å bevare eye´s funksjon. Sikre at graftet ligger et sted midt imot øyet åpning å hindre bakre forstyrrelser med imaging av Trakkasering.
- Med hjelp av flat tang, trykk fast, for om 3-5 s, de to sidene av hornhinnen åpningen mot hverandre for å fremme selvtettende. Operasjonen krever ikke noen stifting eller sy.
- Hvis transplantasjon utføres på begge øyne, slå musen over motsatt lateral side direkte avsløre det andre øyet på dissecting mikroskop linsen og gjenta trinn 2.3.2-2.3.7.
- Når operasjonen er fullført, kan du returnere musen til en tom bur prewarmed med en varmelampe.
- Kontroller at hver enkelt musen gjenvinner mobilitet og bevissthet før du plasserer dem i et bur delt med andre dyr. Dette skjer vanligvis innen 1 time etter operasjonen.
- På transplantasjon, behandle mus med smertestillende som nødvendig, og gir musene acetaminophen i en konsentrasjon av 1.6 mg/mL i drikkevannet.
- Gjenta trinn 2.2-2.9 for hver mottaker musen.
- Overvåke postoperativ dyr aktivitet samt utseendet på implantert øynene å oppdage potensielle helse komplikasjoner.
3. AC confocal avbildning av implantert Thymi med 3D enkelt Foton fluorescens AC Confocal mikroskopi
- Bedøve mottaker musen benytter en dose mellom 1-2% av isofluorane damp. Sikre riktig anesthetization ved fravær av refleks følgende tå knipe før tenkelig prosedyren
- Plass musen på en fast scenen mikroskop plattform i siden lateral tilbakelent posisjon slik at ett øye vender opp.. En heten pute er plassert på mikroskopet plattformen å sikre konstant kroppstemperatur mus under opptak.
Merk: Se utfyllende figur 1 for detaljer. - Leder av musen inn i en stereotaxic headholder og justere bryteren til å beherske musen hodet på en lateralt posisjon direkte tilgang av mikroskopet målet for øyet holder thymus graftet.
- Plass musen snute i gass maske å holde dyr anesthetized hele prosedyren. Dette gjør at justering av isofluorane damp etter behov.
- For å lette stabilisering av øyet under opptak samtidig unngå tilbakekallingen av øyelokkene, trekke tilbake øyelokkene mens du holder øyet i hornhinnen margen med et par pinsett som har deres tips dekket av en polyeten rør som er knyttet til en UST-2 solid universalledd. Denne ordningen tillater en jevn fiksering av hodet og øye og gir fleksibilitet uten avbrudd av blodstrøm i øyet, som beskrevet tidligere22.
Merk: Utfyllende tall 1B, C vise hele samlingen. - Legge noen dråper av sterilt saltvann eller kunstig tårer som nedsenking væsken mellom hornhinnen og linsen, før du plasserer mikroskop målet på musen øyet.
Merk: ekstra drops gis på behov gjennom hele prosedyren for å holde mikroskop banen og forhindre øye tørking. - Først bruke lav forstørrelse (5 X) linse for å finne thymus i feltet mikroskop. Deretter bytte til høyere oppløsning (10, 20 og 40 X) vann nedsenking dipping mål med lang arbeidsavstand. Unngå LSM photodamage og bleking av thymic implantatet ved å bruke minimal laser makt og redusere skanningen tid som mulig. Dette oppnås ved skannerens resonans av mikroskopet.
Merk: AC confocal mikroskopet vi bruker er utstyrt med resonans skanning speil kan samle bilder på 25 bilder/s. Andre merker har egne mikroskop med resonans skannere. - Kjøp modus ved hjelp av mikroskop programvaren og starte resonans skanner modus. Deretter velge XYZT tenkelig modus og konfigurere oppkjøpet innstillingene på følgende måte:
- Aktivere Argon laser og justere kraften til 30% for fluorescens eksitasjon.
- Velg en eksitasjon laser linje og angi kontrollen acousto-optiske strålen splitter (AOBS) for ulike utslipp bølgelengder. I tillegg å oppdage backscatter og avgrense vevet struktur, bruke gjenkjenning av refleksjon samtidig.
Merk: Når du velger et sett med farger for eksitasjon (GFP og RFP), AOBS er automatisk programmert direkte disse eksitasjon linjene på prøven og overføre utslipp mellom dem. For eksempel GFP og RFP, vi bruker smale refleksjon band for eksitasjon lys rundt 488 nm og 561 nm, henholdsvis. Dette etterlater bred band for innsamling av slippes ut fluorescens fotoner, dermed redusere behovet for laser makt og oppkjøp. I refleksjon-modus brukes på AOBS som en 50/50 strålen splitter for å image reflektert lys i en bølgelengde fra de som brukes for fluorescens utslipp gjenkjenning. - Samle utslipp på valgte bølgelengde, og oppløsningen 512 × 512 piksler og starte live bildebehandling ved å trykke på knappen Live , justere gain nivåer etter behov (typisk gevinst er rundt 600 V).
- Definere begynnelsen og slutten av z-stakken ved å fokusere på thymic implantatet Velg begynner, og flytte til den siste fly som kan være fokusert i implantert thymus og velg slutt. Bruk punktstørrelse z-trinn på 5 µm. Programmet beregner automatisk antallet AC confocal fly.
- Velg tidsintervallet for oppkjøpet av hver z-stack (vanligvis 1,5 til 2 sekunder) og velg alternativet erverve til stoppet for kontinuerlig bildebehandling.
- Trykk Start for å starte.
- Bilde graftene gjentatte ganger til forskjellige tider fra samme dyret ved å gjenta trinn 3.1-3.9.
Merk: Hvis dyr har grafts på begge øyne, opptak fra enten øye kan tas ved å gjenta trinn 3.2-3.9 etter bytte stående siden av mus hodet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brisselen fra nyfødte mus ble isolert fra B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas mus som beskrevet i denne protokollen (trinn 1.1-1,9). I transgene mus angir kylling beta begrepsordbok arrangøren uttrykket av den røde fluorescerende protein varianten DsRed. MST under påvirkning av den cytomegalovirus (CMV) umiddelbar tidlig enhancer tilrettelegge sporing av implantater.
Å hindre vevsavvisning, isogenic personer med genotype: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J ble valgt som vertskap. I transgene mus sender menneskelige ubiquitin C arrangøren uttrykk for forbedret grønne fluorescerende protein (GFP) i alle vev gir klart skille mellom mottaker og donor vevet. Handlingen av menneskelig ubiquitin C arrangøren fører til differensial GFP uttrykk mønstre i visse blodkreft celletyper. Spesielt T celler presentere et 2-fold høyere GFP uttrykk nivåer enn CD19+B220+ B celler eller andre eksterne blodceller som kan lette deres identifikasjon av kvantitative følsom teknikker som flow cytometri, uten behov for henvisninger. Videre fluorescerende uttrykk i disse musene er observert i voksen dyr og alle embryonale stadier og det er uniform innen en celle type avstamning gi markør stabilitet.
Mønsteret for thymus trimmer vist i figur 1A følger tidligere beskrivelser av funksjonelle thymus implantert i nyre capsula23. Denne trimming prosedyren kan en reduksjon av det totale volumet av vev å bli implantert samtidig bevare histologiske grunnleggende funksjonsenhetene av orgelet (cortex, marg og cortico-medullær krysset (CMJ) blod fartøy). Bemerkelsesverdige forskjellen i størrelse nyfødt thymus (figur 1A, venstre) og thymus fra en - uke gamle mus (figur 1A, høyre) bør tas i betraktning ved trimming som plass å passe implantater i fremre kammer av musen øyet er begrenset. Resultatene presenteres her inkluderer implantater fra nyfødte bare. Figur 1B viser en makroskopisk bilde av et thymic segment implantert i fremre kammer av en GFP musen øye, innkvartert Kunnskapsbasens dyr visjon. Histologiske detaljer av implant referanse til hornhinnen (GFP vev ved RFP implantat) kan observeres i 3D rekonstruksjon av AC confocal bilder i supplerende Video 1. Engraftment til iris vises i videoen 1 og figur 2.
Figur 1 c og 1 D illustrerer henholdsvis lysende felt og fluorescens bilder av samme område som kan tjene på en dobbel-makroskopisk oppfølging av vevvekst og involution i videreføring studier. Figur 1 c illustrerer også endometrial blodkar av implantert vev som skal unikt for å studere thymus fysiologi avhengig av orgelet blodtilførsel frem tid.
Endometrial blodkar av innsatte thymic fragmenter inntraff innen 72h etter implantatet. Rask endometrial blodkar prosessen er god avtale med den store mengden av blod fartøy i iris og rikdom av Brisselen i cytokiner produksjonen. Disse egenskapene gjør rask engraftment av innsatte thymi. Endometrial blodkar av implantater er illustrert i Video 2viser engraftment av thymic blodkar med iris´ på verten personlige (GFP vev ved RFP implantat), derfor bekrefter at modellen presentert her, tillater faktisk Noninvasiv kontinuerlig monitorization av Stangeriaceae thymus på mikroskopisk nivå. Bruk av LSM visualisere endogene thymus eller thymus tidligere implantert i ulike anatomiske steder er begrenset av vev tetthet og vev tykkelse 1 mm. Det fremre kammeret av øyet anses som et "vindu" organismen tilrettelegge observasjon av implantert vev på mikroskopisk nivå.
Her vises den modellen utviklet av vår gruppe at effekten av transmigration i cellene fra blod torrent (Video 2) i implantert thymus (antagelig progenitors); sporing av kontakter på GFP progenitor celler innkommende i thymic implantatet med epitel og stromal thymic bosatt celler (RFP-merket) under differensiering og utvalg prosesser (videoer 3 og 4), og også for egress celler (antagelig modne T-celler) i blodkar (Video 5).
Tilnærmingen vi beskrive dermed representerer "bevis på prinsippet", basert på opptak tatt mellom 72 h og en måned etter implant fra seks individer transplantert med segmenter fra tre uavhengige nyfødte givere, for en dyr modell som tillater i vivo sanntid sporing av thymocyte modning i et vascularized thymic fragment noninvasive prosedyrer langs tid, og som protokollen kan trenger ytterligere avgrensninger. Denne modellen kan bli videre arbeidet ut gjør bruk av transgene dyr skjuler merket thymocyte molekylære markører, for eksempel som fluorescerende fusion produkter, og tillater direkte visualisering av T-celle modning intermediater. Systemet kan hjelpe å løse kontroverser og svare incognitas koblet til thymocyte differensiering og utvalg hendelser blant andre.
Figur 1. Snitt av donor nyfødte thymic fliker og transplantasjon i det fremre kammeret av mus øye. (A) nyfødte (venstre) og en uke postnatal (høyre) thymi bilder. Dash linjer på nyfødte thymus representerer guider å forberede deler transplantasjon i fremre øye kammeret av mus å beregne maksimalt antall transplantasjon fra en donor. (B) representativt bilde viser nylig implantert thymus. (C) representativt bilde av podet, Stangeriaceae thymus 2 uker etter implantatet. (D) fluorescens bilde av thymus pode vises på (C). Skala linjen vises (1 mm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. AC confocal bilde som viser detaljene i thymus segmentet (rød) engraftment i iris (grønn). Bilde hentet med et mikroskop, ved hjelp av følgende innstillinger: 488 og 561 nm eksitasjon/500 og 575 nm utslipp bølgelengder, 512 x 512 piksler oppløsning og 40 X dipping målet med lang arbeidsavstand. Skala linjen vises (40 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1. Oppsett for AC confocal avbildning av thymic pode bruker 3D enkelt Foton fluorescens laser AC confocal mikroskopi. (A) Heatpad, stereotaxic headholder og gass maske detaljer. (B) Angi museklikk holder thymus graftet for LSM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1. I vivo avbilding av thymus implantater i fremre kammer av musen øyet. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2. Rekruttering av presumable thymus settling progenitors (TSP) fra blodet (GFP) i den thymic parenchyma (RFP). Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 3. Stokastisk bevegelse av thymocytes (tidlig thymic progenitors eller ETPs) i cortex. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 4. Samspillet av thymocytes (GFP) med thymic stromal celler (RFP) cTECs (kortikale thymic epitelceller) eller mTECs (medullær thymic epitelceller). Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 5. Sanntid egress avbilding av potensielle modne T-celler. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Supplerende Video 1. 3Di vivo bildebehandling av thymus implantater i fremre kammer av musen øyet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydningen av T-celle modning prosessen for individuelle immun kompetanse4 og antatte virkningen av forløperen celle dynamikken på modne T-celler produsert av thymus2,3, har omfattende arbeid blitt investert å utvikle alternativer til den klassiske faste vev øyeblikksbilde tilnærmingen.
Selv om vev skiver og andre explants er bedre enn inne reproduserbar vev arkitektur enn monolayers eller samlet thymic orgel kulturer14,15, fravær av en tilkobling til blodkar begrenser bruken å studere den trinnene i oppføring eller TS (translokasjon av progenitors over blod fartøy endotelceller barriere) og exit (translokasjon av modne T-celler over blod fartøy endotelceller barriere) fra orgelet. Som det er en teori om at dynamikken i T-celle kontakter med andre celler, inkludert thymic stromal celler og motilitet over microenvironments cortex og medulla avgjøre statusen differensiering og prosessen med subpopulasjon utvalg (positive og negative)2,3,4,5, og siden disse prosessene kan avhenge TSP og modne T-celle egress hendelser, en modell som inneholder koblingen til individual´s blodstrøm systemet ville være ønskelig.
Intradermal og nyre kapsel implantater av brisselen tillate denne oppgradere17,18. Men utgjør de invasive metoder med begrensninger bildebehandling av TPLSM på grunn av dyp plasseringen av implantatet i kroppen eller tilstedeværelse av ugjennomsiktig lag av vev over graftet. Tilpasning av musen fremre øye kammeret, tidligere brukt som et "vindu"21,22 langs overvåke ytelsen til flere vev, som et sted å spore T-celler innenfor en vascularized thymus gir flere fordeler mot andre transplantasjon strategier. På den ene siden er kirurgi enklere fordi ingen suturer kreves, fører til raskere restitusjon vert dyr. På den andre siden krever observasjon av implantater ikke en ekstra kirurgi når det skjer for nyre kapsel implantater, slik at gjentatte opptak fra samme dyret. I tillegg kunne bestemte anatomiske kjennetegner øyet lett modulerer regulatoriske innganger på implantert vev ikke bare systemisk men også lokalt. Som tidligere beskrevet vil med denne tilnærmingen, kan stoffer brukes på øyet lokalt eller injisert i fremre øye kammeret. Dette representerer også en enkel mulighet å innføre stoffer eller celler direkte i thymus (dvs., progenitors eller modning mellomprodukter merket ex vivo og adoptively overført), som tradisjonelt har vært en svært komplisert prosedyre på grunn av thymus anatomiske sted24,25. Videre tillater perfusjon av fremre kammer utveksling av aqueous humor eller lasting av graftet ved diffusjon med fluorescerende indikatorer, som tidligere vises for andre typer implantater26.
Tilnærmingen som tillater mer trofast studiet av thymus fysiologi tilbys av intravital avbilding av transgene medaka fisk uttrykke fluorescently merket lymfocytt markører. Gjennomsiktigheten av medaka under utvikling og hele livet i mange medaka stammer gjør denne organismen fordelaktig for overvåking mobilnettet dynamikken i vivo21. Det lave antallet motile thymocytes observert i medaka (29%)18 referanse til mouse´s (95%)13, i tillegg til forskjeller i motilitet priser mellom disse to organismer, men foreslår at kaldt blod minste virveldyr med en adaptive immunsystemet kan begrenses ved avsløre bestemt mekanistisk kinetics høyere virveldyr T-celle modning hendelser.
En begrensning av bruk av fremre kammer av musen øyet som stedet for thymus transplantasjon er mellomrom begrensning. Langsiktige studier kan være, derfor kompromittert; spesielt for nyfødte eller embryonale vev med forstørret vekstpotensial. I denne forstand, må vi tilstand at selv om nyfødte implantater presentert med tilsynelatende vev utvidelse etter det første uken etter implantatet i musen øyet (data ikke vist), utvidelsen ikke synes å sette integriteten til øyet i fare opp til to måneder etter implantatet. Likevel, det bør være av interesse å vurdere om vev miljøet av implantatet (øye kammer, nyre kapsel eller dermis) påvirker implant´s vekst og/eller endometrial blodkar før tilstrekkeligheten av tilnærming kan opprettes definert programmer.
Den store snittet kreves på hornhinnen tillate tidens thymic fragmentet til fremre øye chamber fører noen ganger til noen Trakkasering på dette nivået (data ikke vist), sannsynligvis knyttet til viss fibrose knyttet til helbredelsesprosessen. Oppmerksomhet er krevde på trinn 2.3.6 av protokollen for å sikre at hvis Trakkasering oppstår vil minimal forstyrre nedstrøms tenkelig trinnene. Som i snitt er gjort på en lateral nivå, skal verken implantatet eller den Trakkasering påvirke dyr syn ytelse.
Behovet for vev trimming å gjøre thymus passer inn i øyet kammeret synes å være en ulempe hvis sammenlignet med andre anatomiske nettsteder som ikke krever endre anatomiske integritet orgel. Likevel, den nyre kapsel tilnærmingen har vist at fragmenter av thymus inneholder, både cortex og marg ved samme disseksjon retningslinjer til de som vises i figur 1, blir fullt fungerende som de kan gjeninnføre T-celle mediert immunitet i immunodeficient thymeless verter18. Dette argumenterer for intakt funksjonelle egenskaper denne typen thymus segmenter. Også protokollen beskrevet her påkjenninger som isolert thymus må holdes i kalde (trinn 1,9) og bare trimmet rett før protesen (trinn 2.3.2) å minimere kaldt iskemi og vev eksponering mot optimalisere vev engraftment.
En ekstra potensielle begrensning av tilnærming ligger i komposisjon forskjellene mellom aqueous humor i fremre kammer av øyet og blodplasma, problemet må holdes i bakhodet når tolke observasjonene gjort anatomiske her . Tidligere studier med andre vev, men har ikke rapportert noen åpenbare effekter på normal pode funksjonen av de lokale øye miljø22. Selv om opplevelsen med modellen presentert her er begrenset til noen få individer (N = 6 og N = 3 mottakere & givere, henholdsvis) i dag, vi ikke observerer noen store endringer knyttet til implantatet området ved thymic implantater i noen av de individer enten.
Protokollen presenteres her utgjør bevis av prinsippet for studiet av intravital langsgående avbildning av thymocyte dynamics av implanting thymic vev i det fremre kammeret av musen øyet. På grunn av valg av immunkompetente mottakere tillater systemet ikke avhør systemisk funksjonen til graftet. Fremtidige studier kan bygge på denne tilnærmingen ved å velge ulike givere og/eller mottakere og/eller ved å utsette verter irradiation og benmarg (BM) transplantasjon ifølge studien design. For eksempel valg av SCID (alvorlig kombinert immunsvikt) mus som mottakere eliminerer forstyrrelser av endogene T-celler, og valg av transgene mus givere (thymic implantatet og/eller BM) presentere T-celle markører, DC markører, thymic stromal celle-markører, osv., enkeltvis eller samlet bør tillate direkte i vivo sporing av mobilnettet subpopulasjoner. Alternativt kan subpopulasjoner av celler i fremre øye Mysteriekammeret mus spores, som tidligere beskrevet, av i vivo fluorescens cytolabeling26.
En stor fordel med modellen presentert her er at det tillater stamfar og modne T-celler translokasjon fra og mot blod fartøy. Dermed bør det være relevant å avgjøre hvis de raskt kjøpt endometrial blodkar av brisselen etter blir implantert i fremre øye kammeret viser er endogene blodkar. For denne muligheten, bør det nevnes at neovascularization i fremre musen kammeret synes å bli diktert av pode18,20 i stedet for mottakeren og derfor forbindelser til iris blodkar bør opprettholde dataintegriteten endogene thymus cortico-medullær krysset (CMJ) domene.
En ekstra fordel kommer fra at systemet tillater evaluering av to uavhengige implantater (to fremre øye chambers) på identiske personlige bakgrunn (en enkelt vert). Studier som krever kombinasjoner av vev kan også finne det en fordel å bruke dette systemet.
Som thymus spiller en viktig rolle i autoimmune og immun mangelfull patologi, kan denne fremgangsmåten brukes til å ta en myriade av potensielle spørsmål. Spesielt bør systemet tillate makroskopisk i tillegg intra-orgel bildebehandling for utviklingen av thymus involution. Det kan også tjene transplantasjon toleranse hendelser og immun dysfunksjoner knyttet til infeksjoner. Det er sannsynlig at den fine Disseksjon av mekanismer som styrer thymocyte modning vil gi nye ledetråder for design av flere strategier målretting utvikle T-celler.
Transplantasjon av thymus til det fremre kammeret av øyet tar mindre enn 45 min, inkludert neonatal thymus isolasjon og trimming for hver vert individ med implantater i enten øye. I vivo tenkelig opptak krever 1 til 5 h, avhengig av overvåkede funksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet ved NIH tilskudd R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) og R21ES025673 (AC), og den beste/2015/043 grant (Consellería de Educació, cultura jeg esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spania) (EO). Forfatterne takker de sendt ved Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spania og Alberto Hernandez på Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spania for deres hjelp med filming og redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
