Summary
המטרה של הפרוטוקול היא להציג האורך intravital מעקב בזמן אמת אחר thymocytes על-ידי סריקת מיקרוסקופ ב שתלים הרתי בתא הקדמי של העין עכבר לייזר. את השקיפות של הקרנית, אמוניה השתל מאפשר הקלטה ברציפות קדמון תא גיוס ויציאה T-cell בוגרת.
Abstract
מטרת השיטה שהוצגו היא להראות, בפעם הראשונה, את ההשתלה של היילוד thymi אל החדר העין הקדמי של עכברים בוגרים isogenic לניטור ויוו האורך בזמן אמת של הדינמיקה thymocytes´ בתוך vascularized קטע בלוטת התימוס. בעקבות ההשתלה, סריקת מיקרוסקופ (LSM) דרך הקרנית לייזר מאפשר ויוו לא פולשנית חוזרות הדמיה ברמת רזולוציה הסלולר. חשוב, הגישה מוסיף הקודם ההבשלה T-cell intravital הדמיה מודלים האפשרות עבור גיוס תא קדמון רציפה והקלטות בוגרת T-cell היציאה של אותה חיה. יתרונות נוספים של המערכת השקיפות של האזור המושתל, המתיר ניטור מהיר מאקרוסקופית של הרקמה מושתל, הנגישות השתל המאפשר לשפות אחרות בנוסף טיפולים סיסטמיים. המגבלה העיקרית להיות בנפח של הרקמה זה מתאים במרחב מופחתת של תא העין אשר דורש עבור זמירה האונה. שלמות איבר מוגדל על ידי לנתח אונות בלוטת התימוס בדפוסי בעבר הוכח להיות פונקציונלי לייצור תא T בוגרים. הטכניקה מתאימה באופן פוטנציאלי לחקור וחשש רלוונטי שאלות הקשורות לתפקוד בלוטת התימוס הכוללים מחלת חיסון עצמי, כשל חיסוני וסובלנות המרכזית; תהליכים אשר יישארו מוגדרים mechanistically לקוי. ניתוח מנגנוני המנחה thymocyte ההעברה, בידול ובחירה בסדר אמור להוביל הרומן אסטרטגיות טיפוליות מיקוד מתפתחות בתאי T.
Introduction
Intrathymic T-cell בידול ובחירה subpopulation T-cell מהווים מפתח תהליכים פיתוח ותחזוקה של חסינות תאית חולייתנים1. תהליך זה דורש רצף אירועים מאורגנים היטב כולל הגיוס של אבות למחזור הדם, התפשטות תאים, הגירה, ביטוי דיפרנציאלי של חלבוני ממברנה ולאחר מות תאים מתוכנת מסיבית קבוצות משנה מורכבים מבחר. התוצאה היא שחרורו של T תאים בוגרים תגובתי ספקטרום נרחב של אנטיגנים זרים תוך הצגת תגובות ממוזער העצמי-פפטידים, אשר מקצה את colonizing איברי הלימפה ההיקפית של הפרט2,3. Thymocyte סוטה ממבחר הרפרטואר αβTCR מוביל מחלות אוטואימוניות או חוסר איזון מערכת החיסון4 הנובעות בעיקר פגמים במהלך תהליכי בחירה קודמן חיובית או שלילית, בהתאמה.
כיווני ההגירה של thymocytes מעבר התימוס הוא מהותי בכל שלבי ההבשלה T-cell וזה וליטוש סדרת בו זמנית, או רציף גירויים מרובים, כולל נוגדנים, דבק, ודה-דבק מטריצה חוץ-תאית (ECM) אינטראקציות חלבון3,5. המחקר של רקמות קבוע יש מעובד מידע חיוני לגבי דפוסי ביטוי למקלות נודדות thymocyte microenvironments הרתי מוגדר5,6, בעוד מחקרים לשעבר vivo חשף שתי שכיחה התנהגויות הנדידה של thymocytes בשני תחומים ברורים בהיסטולוגיה איבר: להאט תנועות סטוכסטי בקליפת תנועתיות מהר, סגור לשד7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. תעריפי הנדידה הגדילו לתאם עם הבחירה חיובי הרתי13 והיא שלילית הבחירה קשורה עם אופן פעולה של סריקה התומכים את ההשערה כי קינטיקה של המסע דרך בלוטת התימוס קובע נכונה ההבשלה של thymocytes. למרות הרלוונטיות שלהם, את הטופולוגיה של אינטראקציות תא thymocyte-סטרומה את הדינמיקה של תנועתיות thymocyte על פני איברים microenvironments במהלך ההבשלה T-cell עדיין מעורפל.
רוב שמחוץ מחקרים שבוצעו עד כה כוללים עוברית או reaggregate איברים הרתי תרבויות14,15, רקמות פרוסות או שלמים האונה הרתי explants איפה thymocyte תנועות הם דמיינו ידי סריקת לייזר שני הפוטונים מיקרוסקופ (TPLSM)8, טכניקת דימות intravital עם מקסימום מוגבלת לעבוד מרחוק והדמיה בעומק של 1 מ"מ בהתאם הרקמה בחן16. לעומת התרבויות איברים הרתי מפרך התלויות דגירה ממושכת פעמים טופס 3D-מבנים, הן, הטכניקה פרוסה הרתי והן המבוא היתר מבוקר ללא פגע באונה הרתי גישה של קבוצות משנה מסוימת של מראש הנקרא thymocytes לתוך סביבה אדריכלות רקמה מקורית. עם זאת, כיוון זרימת הדם הוא נעדר במודלים אלה, הם מוגבלים בבירור ללמוד בתהליך הגיוס של בלוטת התימוס להתיישב אבות (TSPs) parenchyma התימוס או את הדינמיקה של הרתי egression של תאי-T בוגרים.
In vivo הדגמים לצורך המחקר לפיזיולוגיה ההבשלה T-cell הרתי בעכברים כוללים את השתלים של חלקים או אונות האיבר כולו למקם בתוך הכליה קפסולה17 או intradermally18. למרות אפשרויות אלה הראה השירות שלהם לחקור מערכתית engraftment תפקודית של הרקמה, המיקום של שתלי הרתי עמוק בתוך החיה או מכוסה על ידי שכבות של רקמות אטום מגבילה את השימוש בהם ב- vivo בדיקה של שתלים על ידי TPLSM.
התא הקדמי של העין מספק שטח נגיש עבור פיקוח ישיר על כל רקמות המושתל בשל השקיפות של שכבות הקרנית. יתרון, הבסיס של תא הנוצרת על-ידי הקשתית הוא עשיר כלי הדם ואת קצות העצבים האוטונומית, הפעלת revascularization מהירה reinnervation מתוך19,שתלי20. ד ר Caicedo השתמשה בהצלחה את המרחב האנטומי הזה עבור תחזוקה ומחקר אורך של לנגרהנס העבר21. . הנה, אנחנו מראים כי אסטרטגיה זו לא רק מהווה גישה חוקית בחקר הדינמיקה של thymocytes בתוך מבנה איבר מקורי, אך גם באופן ייחודי מאפשר להרחיב ויוו הקלטות האורך במחקר של קדמון גיוס ו שלבים egression של T-cell בוגרת עכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מיאמי אישר את כל הניסויים בהתאם להנחיות IACUC.
1. בידוד וגיזום של היילוד Thymi
- להכין כל ריאגנטים שעוצבו על-ידי autoclaving או בשיטות אחרות, הבטחת בתנאים סטריליים.
- כדי למזער את מציג, לבצע כל הניתוחים תחת תא למינארי.
- לפני המתות חסד התורם עכברים, למלא צלחת סטרילי 60 מ מ עם עקר prechilled 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4) ומניחים אותו על קרח. זה ישמש שטיפה ואחסון של thymi נכרת של התורם עכברים לפני השתלת.
- המשך לבצע המתת חסד היילוד לתורם עכברים ע י עריפת ראשו, בהתאם להנחיות אתית.
- במקום בעכבר על מגבות נייר סופג סטרילי הגבי זקופה, ספריי, לאחר מכן לנגב, הבטן עכבר עם 70% אתנול.
- לחשוף את חלל בית החזה על ידי ביצוע חתך בצורת V שטחית ברמה של הבטן התחתונה, לחתוך את העור עם זוג של 10 ס מ ישר לנתח מספריים בעקבות של קו האמצע הגחון לעזוב פתיחה של 0.5-1 ס מ בגובה החזה. מקפלים את העור מעל כל צד החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה.
- יצירת שני עמוק 0.5-1 ס מ חתכים לרוחב דרך הסרעפת בית החזה עם אותו סוג של מספריים כדי לגשת את. החיץ הקרומי סופריור בחלל בית החזה הקדמי. בלוטת התימוס צריך להופיע שתי האונות חיוור מעל הלב.
- המקום ערכת מלקחיים מעוקל מתחת בלוטת התימוס ולמשוך אנכית כדי לחלץ את האיבר מלאה. למנוע את foldback של קשת הצלעות עם זוג מלקחיים. אם יש צורך, להשתמש מלקחיים בסדר בקפידה יקרע לגזרים ברקמות החיבור שעוטפות את האיבר מבלי לשבש את פעולת הקפסולה לפני מיצוי האיבר.
הערה: שלב זה הוא הקל על-ידי שימוש טווח ויבתר. - להטביע התימוס מבודד אל תוך קר עקר 1 x PBS (pH 7.4) בעבר מוצג לתוך תבשיל סטרילי 60 מ מ, ולחתוך המצר חיבור עם איזמל כדי להפריד בין האונות הרתי. הסר נפולת של המנה מבלי לפגוע הקפסולה. כדי למזער את הזמן thymi חשופים, חתוך קורנית אונות לפני ההשתלה.
הערה: כל התימוס היילוד מבודד בדרך כלל יעבד שישה מקטעים של בערך 1 מ מ רחב לכל היותר שלושה עכברים המארח בעת קבלת שתלים בשתי העיניים. - חזור על הצעדים 1.4-1.9 כל העכבר התורם. כדי למזער את הזמן thymi חשופים, לבודד התימוס אחד בכל פעם.
2. בלוטת התימוס השרשה אל החדר הקדמי של העין
- לפני ההשתלה, תג, שוקלים כל עכבר הנמען.
- השתמש מנה בין 1-2% של ואדים isofluorane כדי עזים ומתנגד העכבר הנמען. ודא ההרדמה נכונה בגלל היעדר רפלקס קמצוץ הבוהן הבאים לפני תחילת הליך כירורגי.
- . המשך עם התימוס מקטעי להשתלות כדלקמן:
- למקם את העכבר במיקום הצד הלטראלי שכיבה אז פונה מעלה, כי עין אחת נחשף ישירות לעדשה של הטווח ויבתר.
- . נכנסים לאחת האונות הרתי מבודד שוכב בבית של PBS קר 1 x (pH 7.4)-מלא 60 מ מ מאכל לחתיכות עם עד 1 מ מ רוחב עבור השתל. בצע את תבנית זיג-זג כדי להבטיח כי כל מקטע מכיל קורטקס הרתי ואת לשד. השתמש vannas מספריים עבור זמירה על פי ההנחיות באיור 1A.
הערה: זמירה של בלוטת התימוס צריך להיעשות לפני שתל כדי למטב את הרקמה engraftment. - החל את הבסיס של הקרנית המתאים לאזור כירורגי, מציגים את קצה מחט 40 מ מ G18 לעשות חתך קטן לתוך שכבות הקרנית חיצוניים כך קצה המספריים ויבתר יכול להיות מוצג.
- הפוך של 5-10 מ מ לאגף החתך ישירות סביב הבסיס של הקרנית בעזרת מספריים vannas תוך החזקת הפתח קרנית בחוזקה כדי למנוע חתימת. להשתמש מלקחיים עם קצוות שטוחים כדי למנוע נזק לרקמות.
- לתפוס את אפיתל הקרנית לחתוך ולחשוף את הפתיחה על-ידי החזקת הקרנית בעזרת זוג מלקחיים שטוח הסתיימה תוך דחיפת קטע הרתי דרך הפתח. רטוב העין עם עקר 1 x PBS (pH 7.4) או דמעות מלאכותיות כנדרש, כדי למנוע רקמות לייבוש עד המניפולציה תושלם.
- לחץ בעדינות על פני העין להחליק על קטע רקמה הציג עמדה לרוחב ביחס לתלמיד כדי לשמר את הפונקציה eye´s. ודא כי השתל שוכנת במיקום מול העין פתיחה כדי למנוע הפרעה האחורי עם הדמיה על ידי גירוי עצמי.
- בעזרת מלקחיים שטוח, לחץ בחוזקה על 3-5 s, משני צדי הפתח הקרנית אחד נגד השני כדי לקדם את עצמי איטום. הניתוח אינו דורש כל הידוק או תפירה.
- אם ההשתלות מבוצעות על שתי העיניים, להתהפך לכיוון הנגדי לרוחב כדי לחשוף את העין השנייה על העדשה מיקרוסקופ ויבתר וחזור צעדים 2.3.2-2.3.7 ישירות העכבר.
- לאחר הניתוח הושלם, חזור העכבר לכלוב ריק prewarmed עם מנורת חימום.
- ודא כי כל המושתלים העכבר חוזר ניידות מלאה וההכרה לפני הנחת לתוך כלוב משותף עם בעלי חיים אחרים. זה בדרך כלל לוקח מקום בתוך 1 h לאחר הניתוח.
- לאחר ההשתלה, מתייחסים העכברים עם משככי כאבים לפי הצורך, ולספק העכברים פרצטמול-ריכוז של 1.6 מ"ג/מ"ל במי השתייה.
- חזור על הצעדים 2.2-2.9 כל עכבר הנמען.
- לפקח על פעילות בעלי חיים שלאחר הניתוח, כמו גם את המראה של העיניים מושתל לזהות פוטנציאל לסיבוכים בריאותיים.
3. קונאפוקלית הדמיה של מושתל Thymi באמצעות תלת-ממד יחיד פוטון פלורסצנטיות מיקרוסקופיה קונפוקלית
- עזים ומתנגד העכבר נמען באמצעות מנה בין 1-2% של ואדים isofluorane. להבטיח ההרדמה נכונה בגלל היעדר רפלקס קמצוץ הבוהן הבאים לפני תחילת ההליך הדמיה
- במקום בעכבר על פלטפורמה מיקרוסקופ הבמה קבוע במצב שכיבה לרוחב הצד כך פונה מעלה, כי עין אחת. כרית החימום מושם על פלטפורמת מיקרוסקופ כדי להבטיח טמפרטורת גוף קבועה של עכברים במהלך הקלטות.
הערה: ראה איור משלים 1 לפרטים. - להכניס את הראש של העכבר headholder stereotaxic ולהתאים את הידית כדי לרסן את הראש העכבר על עמדה בצד הלטראלי המאפשר גישה ישירה של המטרה מיקרוסקופ לעין מחזיק השתל בלוטת התימוס.
- מקם את החוטם העכבר לתוך מסכת גז כדי לשמור את החיה ומורדמת לאורך כל הליך. פעולה זו מאפשרת התאמת ואדים isofluorane לפי הצורך.
- כדי להקל על הייצוב של העין במהלך הקלטות תוך הימנעות משיכת העפעפיים, למשוך בחזרה את העפעפיים תוך החזקת העין בקצה תחום הקרנית בעזרת זוג מלקחיים יש טיפים מכוסה על ידי צינור ניילון אשר מחוברים רק-2 מפרק אוניברסלי מוצק. סידור זה מאפשר אובססיה יציב של ראש העין ומספק גמישות ללא הפרעה של זרימת הדם בעיניים, כפי שתואר לעיל22.
הערה: דמויות משלים 1B, C להציג את מכלול שלם. - להוסיף כמה טיפות של דמעות סטרילי מלוחים או מלאכותיים כמו הנוזל טבילה בין הקרנית העדשה, לפני הצבת המטרה מיקרוסקופ על העין העכבר.
הערה: טיפות נוספים הם ויתרו על הצורך לאורך כל ההליך כדי להשאיר את הנתיב מיקרוסקופ ולמנוע עין ייבוש. - תחילה להשתמש עדשת הגדלה נמוכה (5 X) כדי לאתר את בלוטת התימוס בשטח מיקרוסקופ. ואז לעבור טבילה במי רזולוציה (10, 20 ו- 40 X) גבוה יותר, טובלים מטרות עם זמן ומרחק עבודה. למנוע נזקי LSM ולהלבנה של השתל הרתי על-ידי החלת עוצמת הלייזר מינימלי ולהפחית ככל האפשר סריקה זמן. זו מושגת על ידי שימוש בסורק התהודה של המיקרוסקופ.
הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי שנשתמש הינו מצויד עם מראות סריקת תהודה מסוגל איסוף תמונות ב 25 מסגרות לשנייה. מותגים אחרים יש מיקרוסקופים משלהם עם סורקים תהודה. - בחר את מצב רכישה באמצעות מיקרוסקופ התוכנה ולהתחיל את מצב סורק תהודה. ואז לבחור את מצב הדמיה XYZT ולהגדיר את ההגדרות הרכישה כדלקמן:
- להפעיל ללייזר ולהתאים את הכוח 30% עבור עירור קרינה פלואורסצנטית.
- בחרו קו לייזר עירור וקבעו את הפקד ספליטר (AOBS) קרן אקוסטו אופטי עבור אורכי גל שונים פליטה. בנוסף, כדי לזהות backscatter ניסחו מבנה רקמות, להשתמש זיהוי השתקפות בו-זמנית.
הערה: בעת בחירת ערכת צבעים עבור עירור (GFP ו- RFP), AOBS באופן אוטומטי מתוכנת ישיר שורות אלה עירור על גבי הדגימה ולשדר הפליטה ביניהם. למשל, עבור ה-GFP ו- RFP, אנו משתמשים להקות השתקפות צר שהנורה עירור בסביבות 488 ננומטר ו-561 nm, בהתאמה. זה משאיר להקות רחבה עבור האוסף של הפוטונים הנפלטים פלורסצנטיות, ובכך להקטין את הצורך כוח לייזר בזמן הרכישה. במצב השתקפות, משמש את AOBS מפצל חצי קרן לשיקוף האור משתקף לכל אורך הגל מהאנשים המשמש לצורך זיהוי פליטת קרינה פלואורסצנטית. - לאסוף את הפליטה-גל שנבחרו, ולאחר מכן בחר רזולוציה של 512 × 512 פיקסלים ולהתחיל חיים הדמיה על ידי לחיצה על לחצן ' חי ', התאמת רמות רווח לפי הצורך (רווח טיפוסי הוא בסביבות 600 V).
- להגדיר את ההתחלה ואת הסוף של z-המחסנית על-ידי התמקדות על השתל הרתי, בחר להתחילולאחר מכן מעבר המטוס יכול להיות ממוקד התימוס מושתל ובחר הקצההאחרון. השתמש בגודל z-צעד של 5 מיקרומטר. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את מספר מטוסים קונפוקלי.
- בחר את מרווח הזמן עבור רכישת כל z-ערימה (בדרך כלל 1.5 עד 2 שניות) ובחר את האפשרות לרכוש עד הפסיק עבור הדמיה רציפה.
- לחץ על לחצן התחל כדי לאתחל.
- תמונה את השתלים שוב ושוב במועדים שונים של אותה חיה מאת וחזור על שלבים 3.1-3.9.
הערה: אם החיה מחזיק שתלי בשתי העיניים, ניתן לקחת הקלטות מהעין או על-ידי וחזור על שלבים 3.2-3.9 לאחר מעבר לצד זקופה הראש העכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התימוס של היילוד עכברים הם בודדו אותנו מהמתרחש B6. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/ג'ס עכברים כפי שמתואר פרוטוקול זה (שלבים 1.1-1.9). באלה העכברים הטרנסגניים, עוף ביתא אקטין האמרגן מנחה את הביטוי של variant חלבון פלואורסצנטי אדום DsRed. MST תחת השפעת cytomegalovirus (CMV) מיידית מוקדם משפר להקל על המעקב של שתלים.
כדי למנוע דחיית רקמה, אנשים isogenic עם גנוטיפ: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J נבחרו כפונדקאים. באלה העכברים הטרנסגניים, יזם האדם אוביקוויטין C מנחה את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) משופרת ברקמות כל המאפשר הבחנה ברורה בין הרקמות התורם ונמען. הפעולה של האמרגן האנושי אוביקוויטין C מוביל דיפרנציאלית GFP ביטוי דפוסים מסוימים סוגי תאים hematopoietic. בפרט, תאי T להציג ביטוי GFP גבוה יותר 2-fold רמות יותר CD19+B220+ B תאים או אחרים בתאי הדם ההיקפיים, אשר עשויה להקל את הזיהוי שלהם על ידי טכניקות רגיש כמותי כגון flow cytometry, ללא שום צרכים נוספים תיוג. יתר על כן, ביטוי פלורסנט בעכברים אלו נצפית אצל בעלי חיים למבוגרים, כמו גם בשלבים עובריים כל וזה אחיד בתוך שושלת סוג התא מעניק יציבות סמן.
התבנית עבור זמירה התימוס באיור איור 1A בעקבות תיאורים קודמות של תפקודי בלוטת התימוס קטעים מושתלים כליה capsula23. הליך זמירה מאפשרת הפחתה של הנפח הכולל של רקמות כדי להיות מושתל תוך שמירה על היחידות תפקודית בסיסית היסטולוגית של האיבר (קליפת המוח, לשד, צומת cortico-מדולרי (CMJ) כלי דם). ההבדל הבולטים בגודל בין היילוד התימוס (איור 1A, משמאל) התימוס של עכברים אחד - בן שבועיים (איור 1A, נכון) צריך להילקח בחשבון עבור זמירה, כמו השטח הזמין להתאים שתלים בתא הקדמי של העכבר עין היא מוגבלת. התוצאות המובאות כאן כוללים את השתלים המתקבל ילודים בלבד. איור 1B מציג תמונה מאקרוסקופית של קטע הרתי מושתל בתא הקדמי של העין העכבר GFP, לאכלס כדי לשמר את חזון חיים. פרטים היסטולוגית של השתל ביחס הקרנית (GFP רקמות סמוכים השתל RFP) ניתן לצפות בהשבת 3D תמונות קונאפוקלית 1 וידאו משלימים. Engraftment כדי הקשתית מוצג וידאו 1 ו- 2 איור.
איור 1C ו- 1 D בהתאמה להמחיש את שדה בהיר ומעקב פלורסצנטיות תמונות של אותו אזור אשר עשוי לשרת עבור כפול-מאקרוסקופית של צמיחה רקמות לפוף בלימודי המשך. איור 1C מדגימה גם את אמוניה רקמת מושתל אשר אמור לאפשר באופן ייחודי עבור לימודי פיזיולוגיה התימוס תלויים איברים אספקת הדם לאורך זמן.
אמוניה השברים הרתי שנוספו אירעה בתוך 72h שלאחר השתל. תהליך vascularization מהירה הוא הסכם טוב עם כמות גדולה של כלי הדם נמצאו הקשתית ואת העושר של בלוטת התימוס בייצור ציטוקינים. מאפיינים אלה מאפשרים engraftment מהירה של thymi שנוסף. אמוניה שתלים מודגם סרטון 2, מציג את engraftment של כלי הדם הרתי עם iris´ של המחשב המארח בודדים (GFP רקמות סמוכים השתל RFP), לכן, המאשר כי המודל המוצג כאן, למעשה, מאפשר עבור monitorization רציף לא פולשנית של בלוטת התימוס vascularized ברמה המיקרוסקופית. השימוש LSM להמחיש התימוס אנדוגני או בלוטת התימוס מושתל בעבר במקומות שונים אנטומיים הוא מוגבל על ידי רקמת לאטימות של רקמות עובי מעל 1 מ מ. התא הקדמי של העין הוא נחשב "חלון" האורגניזם הקלת התצפית של רקמות מושתל ברמה המיקרוסקופית.
. כאן, זה הוכיח כי המודל שפותח על ידי הקבוצה שלנו מאפשר את החזיית לנדידת תאים מן הדם את הטורנט (סרטון 2) לתוך בלוטת התימוס מושתל (ככל הנראה אבות); עבור המעקב אנשי הקשר של GFP ובתאים נכנסות לתוך השתל הרתי עם תושב הרתי אפיתל, סטרומה תאים (שכותרתו RFP) במהלך תהליכי בידול ובחירה (קטעי וידאו 3 ו- 4), בנוסף, את היציאה של תאים (ככל הנראה בוגר-בתאי T) לתוך כלי הדם (5 וידאו).
הגישה שנתאר ובכך מייצג את "הוכחת העיקרון", מבוסס על ההקלטות נלקחה בין 72 h חודש שלאחר השתל מאנשים שישה מושתלים עם המקטעים מתורמים שלושה היילוד עצמאית, בעל חיים מודל זה היתרים ויוו בזמן אמת מעקב של התבגרות thymocyte ב קטע הרתי vascularized שגרות לא פולשנית לאורך זמן, ככזה, הפרוטוקול אולי צריכים עוד ליטושים. מודל זה יכול עוד יותר הסתדרו עשיית שימוש של חיות הטרנסגניים מחסה thymocyte שכותרתו סמנים מולקולריים, לדוגמה, כמו פלורסנט מוצרים פיוז'ן, וכך מאפשר פריט חזותי ישיר של T-cell ההבשלה intermediates. המערכת עשויה לסייע לפתרון המחלוקות ולהגיב incognitas מקושרת thymocyte בידול ובחירה אירועים בין היתר.
איור 1. אופטים של האונות הרתי היילוד לתורם והשתלות אל החדר הקדמי של העין עכברים. (א) היילוד (משמאל) ותמונות thymi (מימין) אחרי לידה שבוע אחד. מקף קווים על היילוד התימוס מייצגים מדריכים כדי להתכונן מקטעים השתלת אל החדר העין הקדמי של עכברים כדי להעריך את המספר המרבי של השתלות מתורם אחד. תמונה ייצוגית (B) מציג לאחרונה מושתלים בלוטת התימוס. (ג) נציג דימוי הושתל, vascularized התימוס 2 שבועות שלאחר השתל. (ד) זריחה תמונה של בלוטת התימוס שתל המוצגות (C). סרגל קנה מידה מוצג (1 מ"מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. התמונה קונאפוקלית מציג הפירוט של בלוטת התימוס קטע (אדום) engraftment של הקשתית (ירוק)- התמונה שהושג עם מיקרוסקופ, באמצעות ההגדרות הבאות: 488, 561 nm עירור/500, 575 אורכי גל nm פליטה, 512 x 512 פיקסלים ברזולוציה, 40 X טובלים המטרה עם זמן ומרחק עבודה. סרגל קנה מידה מוצג (40 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1. תוכנית ההתקנה עבור הדמיה קונאפוקלית של שתל הרתי באמצעות קרינה פלואורסצנטית 3D פוטון יחיד לייזר מיקרוסקופיה קונפוקלית- (א) Heatpad, stereotaxic headholder ופרטים מסכת גז. (B) הגדר של העכבר מחזיק השתל התימוס LSM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו 1. In vivo הדמיה של בלוטת התימוס שתלים בתא הקדמי של העין העכבר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 2. גיוס של בלוטת התימוס presumable יה אבות (כפית) של זרם הדם (GFP) parenchyma הרתי (RFP). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 3. תנועת thymocytes (אבות הרתי מוקדם או ETPs) בקליפת סטוכסטיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 4. האינטראקציה של thymocytes (GFP) עם תאי סטרומה הרתי (RFP) או cTECs (תאי אפיתל הרתי קורטיקליים) או mTECs (תאי אפיתל הרתי מדולרי). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 5. הדמיה היציאה בזמן אמת של תאי-T בוגרת פוטנציאלי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
משלים Video 1. 3D -ויוו הדמיה של בלוטת התימוס שתלים בתא הקדמי של העין העכבר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשל החשיבות של תהליך ההבשלה T-cell עבור הפרט כשירות המערכת החיסונית4 ואת ההשפעה המשוער של קודמן תא dynamics על תאי-T בוגרים המיוצר על ידי בלוטת התימוס2,3, הושקעו מאמצים נרחבים לפתח חלופות הגישה בזק קלאסי רקמות קבוע.
למרות פרוסות רקמות ו explants אחרים יותר ברור מתרבה אדריכלות רקמות מאשר monolayers או צבירה איברים הרתי תרבויות14,15, העדר קשר להערכת מגבילה את השימוש שלהם ללמוד מדרגות כניסה או כפית (טרנסלוקציה של אבות על פני מחסום תאי אנדותל כלי הדם) ויציאה (טרנסלוקציה של תאי-T בוגרת על פני מחסום תאי אנדותל כלי הדם) של האיבר. כמו זה המשוערות הדינמיקה של T-cell יוצר קשר עם תאים אחרים, כולל תאי סטרומה הרתי, תנועתיות שלהם על פני microenvironments בתוך קליפת המוח, לשד לקבוע את מעמדם בידול ואת התהליך של subpopulation בחירה (חיוביים ושליליים)2,3,4,5, ו מאז תהליכים אלה תלויים כפית ואירועים היציאה בוגרת T-cell, מודל הכולל את הקשר individual´s דם זורם המערכת תהיה רצויה.
Intradermal וכליות שתלים קפסולה של בלוטת התימוס מאפשרים את השדרוג17,18. עם זאת, הם מהווים שיטות פולשניות עם מגבלות על הדמיה מאת TPLSM עקב המיקום עמוק של השתל בתוך הגוף או הנוכחות של שכבות אטום של רקמה מעל השתל. הסתגלות החדר הקדמי העין העכבר, בעבר משמש longitudinally21,"חלון"22 כדי לפקח על הביצועים של מספר רקמות, כמו אתר כדי לעקוב אחר תאי-T בתוך בלוטת התימוס vascularized מספקת מספר יתרונות לעומת אחרים אסטרטגיות השתלת. מצד אחד, הניתוח הוא פשוט כי אין תפרים נדרשים, מובילים להחלמה מהירה יותר של המארח חיות. בצד השני, התצפית של שתלים אין צורך בניתוח נוסף כפי שזה קורה עבור שתלים קפסולה כליות, המאפשר הקלטות חוזרות של אותה חיה. בנוסף, המאפיינים אנטומי מסוים של העין מאפשרים בקלות לווסת תשומות הרגולציה על הרקמה מושתל לא רק מערכתית אלא גם באופן מקומי. כפי שתואר קודם לכן, עם גישה זו, חומרים ניתן למריחה על העין או מוזרק תא העין הקדמי. הוא מייצג גם אפשרות נוחה להציג חומרים או תאים ישירות לתוך בלוטת התימוס (כלומר., אבות או התבגרות intermediates שכותרתו ex-vivo , הועבר adoptively), אשר באופן מסורתי הליך מורכב עקב בלוטת התימוס מיקום אנטומי24,25. יתר על כן, זלוף החדר הקדמי מאפשר חילופי ההומור aqueous או טעינה של השתל על ידי דיפוזיה עם אינדיקטורים פלורסנט, כאמור המוצג עבור סוג אחר של שתלים26.
הגישה המאפשרת יותר בנאמנות המחקר של בלוטת התימוס פיזיולוגיה מסופק על ידי ההדמיה intravital של דגים medaka הטרנסגניים לבטא לימפוציט fluorescently שכותרתו סמנים. השקיפות של medaka במהלך הפיתוח ולאורך החיים זנים medaka הופך את האורגניזם הזה יתרון לניטור דינמיקה סלולר ויוו21. המספר הנמוך של תאי thymocytes הנהוגות medaka (29%)18 ביחס mouse´s (95%)13, בנוסף הבדלים בשיעורי תנועתיות בין אורגניזמים שני אלה, אולם, מרמז כי הקור הדם הקטנים בעלי חוליות עם מערכת החיסון מסתגלת עלולה להיות מוגבלת לחשיפת מסוים מכניסטית קינטיקה של גבוה יותר אירועים ההבשלה חוליות של T-cell.
מגבלה אחת של השימוש של התא הקדמי של העין העכבר כמו האתר עבור השתלת התימוס הוא הגבלת שטח. מחקרים ארוכי טווח אולי, לכן, תיפגם; במיוחד בשביל לרקמות היילוד או עובריים עם פוטנציאל צמיחה מוגדלת. במובן זה, אנחנו חייבים המדינה כי למרות שתלים היילוד הציג עם הרחבת הרקמה נראית לעין לאחר שבוע שלאחר ההשתלה הראשונה בעין העכבר (נתונים לא מוצג), ההרחבה לא נראתה לסכן את השלמות של העין עד חודשיים לאחר השתל. בכל זאת, זה צריך להיות עניין להעריך, אם הסביבה רקמות של השתל (עין קאמרית, כליות כמוסה או הדרמיס) משפיע על גדילה implant´s ו/או vascularization לפני הלימות של הגישה יכול להתבסס על הגדרת יישומים.
חתך גדול נדרש על הקרנית כדי לאפשר שהמעבר של השבר הרתי לתא העין הקדמי מוביל מדי פעם כמה זובור ברמה זו (נתונים לא מוצג), ככל הנראה קשור במידה מסוימת של פיברוזיס הקשורים לתהליך הריפוי. תשומת לב הוא דרש על שלב 2.3.6 של הפרוטוקול כדי להבטיח זה אם זובור מתרחשת מינימלית יפריע השלבים הדמיה במורד הזרם. כמו החתך נעשה ברמה לרוחב, השתל ולא ההשפלה צריכה להשפיע באופן משמעותי על חיות מראה ביצועים.
הצורך זמירה רקמות להפוך התימוס להשתלב תא העין מופיעה להיות בעמדת נחיתות לעומת אתרים אחרים אנטומיים שאינם דורשים לשנות את שלמות אנטומי של איבר המין. יחד עם זאת, הגישה קפסולה כליות, הראה ש הרסיסים של בלוטת התימוס המכיל, שניהם, קליפה, לשד מתקבל על ידי הנחיות ניתוח דומה לאלו המוצגות באיור 1, הופכים באופן תקין, כפי שהם יכולים לשקם T-cell חסינות בתיווך המארחים thymeless immunodeficient18. זה טוען לטובת שלמים פונקציונלי תכונות של סוג זה של בלוטת התימוס מקטעים. בנוסף, הפרוטוקול המתוארים כאן מדגיש כי בלוטת התימוס מבודד חייב להישמר בקור (שלב 1.9) ונחתך רק ממש לפני שתל (שלב 2.3.2) כדי למזער את החשיפה הקרה איסכמיה ורקמות לכיוון אופטימיזציה של הרקמה engraftment.
הגבלה פוטנציאליים נוספים של הגישה שוכן קומפוזיציה ההבדלים בין ההומור aqueous בתא הקדמי של העין, פלזמה, בעיה צריך להישמר בראש כאשר עשה תצפיות תרגום סימולטני במיקום אנטומי זה . מחקרים קודמים עם רקמות אחרות, עם זאת, לא דיווחו על תופעות ברור על תפקוד שתל נורמלי על ידי הסביבה המקומית עין22. למרות החוויה עם המודל המוצג כאן הוא מוגבל כמה בודדים (N = 6 ו- N = 3 עבור נמענים & תורמים, בהתאמה) כיום, לא נתבונן שינויים עיקריים הקשורים להשתיל האתר במקרה של שתלים הרתי בכל אחד אנשים גם.
פרוטוקול המובאת כאן מהווה הוכחה של עיקרון לחקר intravital הדמיה האורך של דינמיקה thymocyte על ידי השתלת רקמות הרתי אל החדר הקדמי של העין העכבר. בשל הבחירה של נמענים immunocompetent, המערכת לא איפשרה לחקור את תפקוד השתל מערכתית. מחקרים עתידיים עשויים לבנות על גישה זו על-ידי בחירת תורמים שונים ו/או הנמענים ו/או במינים המארחים הקרנה, השתלת מח עצם (מוניטור) על פי מחקר מסוים עיצובים. לדוגמה, הבחירה של עכברים SCID (severe משולבים כשל חיסוני) כ נמענים שולל ההפרעה של תאי T אנדוגני, הבחירה של העכברים הטרנסגניים תורמים (שתל הרתי ו/או מוניטור) מציג T-cell סמנים, סמנים DC, הרתי סטרומה תא-סמנים, וכו '., בנפרד או בשילובים צריך לאפשר מעקב ישיר ויוו של הסלולר subpopulations. לחלופין, subpopulations של תאים במחסנית העין הקדמי של עכברים אפשר לעקוב אחריהם, תיאר כאמור, אין ויוו זריחה cytolabeling26.
אחד היתרונות של המודל המוצג כאן הוא שהוא מאפשר ללמוד קדמון, בוגרת רוברטסונית תאי-טי מ וכלפי כלי הדם. לכן, זה צריך להיות רלוונטי לקבוע אם רכשה במהירות אמוניה התימוס לאחר להיות מושתל בבית הבליעה העין הקדמי recapitulates את להערכת אנדוגני. בעד האפשרות הזו, יש לציין כי כורוידאלית בבית הבליעה העכבר הקדמי נראה להיות מוכתבים על-ידי ה18,שתל20 במקום המטופל ולכן הקשרים להערכת איריס צריך לשמור על השלמות של תחום צומת cortico-מדולרי (CMJ) התימוס אנדוגני.
יתרון נוסף נובע מהעובדה כי המערכת מאפשרת את ההערכה של שני שתלים עצמאית (שתי לשכות העין הקדמי) על רקע זהות בודדים (שורה אחת). מחקרים הדורשים שילוב של רקמות ייתכן גם שיהיה כדאי להשתמש במערכת זו.
כמו בלוטת התימוס ממלא תפקיד חשוב בפתולוגיות לקוי אוטואימונית של מערכת החיסון, גישה זו יכול לשמש כדי לטפל מספר עצום של שאלות אפשריות. בפרט, המערכת צריכה לאפשר מאקרוסקופית בנוסף אינטרה-איבר הדמיה על ההתקדמות של בלוטת התימוס לפוף. זה עשוי לשמש גם ללמוד השתלת סובלנות אירועים ו בתפקוד מערכת החיסון הקשורות לזיהומים. סביר כי הקרע בסדר של מנגנונים המסדירים ההבשלה thymocyte תספק רמזים חדשים על עיצוב האתר של אסטרטגיות טיפוליות נוספות מיקוד מתפתחות בתאי T.
השתלת של בלוטת התימוס לתא הקדמי של העין לוקח פחות מ 45 דקות, כולל בידוד התימוס neonatal, זמירה עבור כל מחשב מארח בודדים עם שתלים בעין אחת. In vivo הקלטות הדמיה דורשים h 1 עד 5, תלוי בתכונות תחת פיקוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) ו R21ES025673 (AC), ועל ידי המענק הטוב/2015/043 (Consellería de Educació, קולטורה אני esport, Generalitat valenciana, ולנסיה, ספרד) (EO). מחברים להודות לצוות שנשלחו אוניברסיטת ולנסיה דה Católica סן ויסנטה Mártir, ולנסיה, ספרד ו אלברטו הרננדז-סנטרו דה Investigación פרינסיפה פליפה, ולנסיה, ספרד על עזרתם עם צילום וידאו ועריכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
