Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Inseguimento In Vivo dei timociti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di microscopia a scansione Laser in tempo reale

doi: 10.3791/58236 Published: October 2, 2018

Summary

L'obiettivo del protocollo è di mostrare longitudinale videomicroscopia tracking in tempo reale dei timociti di scansione microscopia in impianti timici nell'alloggiamento anteriore dell'occhio del mouse laser. La trasparenza della cornea e la vascolarizzazione dell'innesto permette di registrare continuamente reclutamento di cellule progenitrici e l'uscita di cellula T maturo.

Abstract

Lo scopo del metodo viene presentato è quello di mostrare, per la prima volta, il trapianto del neonato thymi nella camera anteriore dell'occhio di topi adulti isogeniche per in vivo longitudinale monitoraggio in tempo reale di thymocytes´ dinamiche all'interno di un vascolarizzato segmento di timo. Dopo il trapianto, microscopia (LSM) attraverso la cornea a scansione laser permette in vivo imaging ripetuti non invadente a livello cellulare ad alta risoluzione. D'importanza, l'approccio aggiunge alla maturazione delle cellule T videomicroscopia precedenti modelli di imaging la possibilità per il reclutamento di cellule progenitrici continuo e maturo della T-cellula egress registrazioni nello stesso animale. Ulteriori vantaggi del sistema sono la trasparenza dell'area innestata, permettendo il monitoraggio rapido macroscopica del tessuto impiantato, e l'accessibilità all'impianto consentendo localizzati oltre ai trattamenti sistemici. La limitazione principale essendo il volume del tessuto che si inserisce nello spazio ridotto della camera occhio che esige per il taglio del lobo. L'integrità dell'organo è massimizzata da lobi del timo in modelli precedentemente indicati per essere funzionale per la produzione di T-cellula matura di dissezione. La tecnica è potenzialmente adatta per interrogare un milieu di clinicamente rilevanti questioni relazionati alla funzione del timo che includono l'autoimmunità, immunodeficienza e tolleranza centrale; processi che rimangono meccanicistico scarsamente definiti. La raffinata dissezione dei meccanismi guida timociti migrazione, differenziazione e selezione dovrebbe portare a nuove strategie terapeutiche in via di sviluppo le cellule di T di targeting.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Intratimica differenziazione a cellula T e selezione sottopopolazione di cellule T costituiscono processi chiave per lo sviluppo e la manutenzione di immunità cellulo-mediata in vertebrati1. Questo processo coinvolge una complessa sequenza di eventi strettamente organizzati, tra cui il reclutamento dei progenitori dal flusso sanguigno, la proliferazione e la migrazione, l'espressione differenziale di proteine di membrana e la morte cellulare programmata massiccia per sottoinsiemi selezione. Il risultato è il rilascio di cellule T mature reattive ad un ampio spettro di antigeni estranei durante la visualizzazione ridotta a icona risposte a self-peptidi, che finiscono colonizzare gli organi linfoidi periferici delle singole2,3. Selezione di timociti aberrante del repertorio αβTCR conduce alla malattia autoimmune o squilibrio immunitario4 che derivano principalmente da difetti durante i processi di selezione precursore positivo o negativo, rispettivamente.

Migrazione direzionale di timociti attraverso il timo è intrinseco a tutte le fasi di maturazione delle cellule T ed è concepito come una serie di simultanea o sequenziale stimoli multipli, tra cui chemochine, adesive, e de-adesivo della matrice extracellulare (ECM) proteina interazioni3,5. Lo studio dei tessuti fissi ha reso informazioni critiche per quanto riguarda i modelli di espressione per stecche migratori timociti in microambienti timica definiti5,6, mentre gli studi ex vivo ha rivelato due prevalente i comportamenti migratori dei timociti in due aree istologicamente distinte dell'organo: slow stochastic movimenti nella corteccia e motilità veloce, confinate nel midollo7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. aumento tassi migratori correlano con selezione timica positiva13 e selezione negativa è associato con comportamento strisciante, supportando l'ipotesi che la cinetica del viaggio attraverso il timo determina il corretto maturazione dei timociti. Nonostante la loro rilevanza, la topologia delle interazioni delle cellule stromal timociti e le dinamiche della motilità di timociti attraverso microambienti organo durante la maturazione delle cellule T rimangono mal definite.

Maggior parte degli studi ex vivo eseguita fino ad oggi includono fetale o ricongiungessero organo timico culture14,15, fettine di tessuto o espianti di lobo timico intatto cui movimenti di timociti sono visualizzati da scansione laser del due-fotone microscopia (TPLSM)8, una tecnica di imaging videomicroscopia con un massimo limitato, distanza di lavoro e profondità di 1 mm in conformità con il tessuto di imaging ha esaminato16. In contrasto con le culture di organo timico laborioso che dipendono dai tempi di incubazione estesa a formare 3D-strutture, entrambi, la tecnica di fetta timica e l'introduzione di permesso controllata di approccio lobo timico intatto di sottoinsiemi particolari dei pre-etichettata timociti in ambienti dall'architettura tessuto nativo. Tuttavia, poiché il flusso sanguigno è assente in questi modelli, sono chiaramente limitati per lo studio del processo di reclutamento del timo sedimentazione dei progenitori (TSPs) al parenchima del timo o le dinamiche di egression timica dei linfociti T maturi.

Modelli in vivo per lo studio della fisiologia di maturazione delle cellule T timica in topi includono gli innesti di frammenti o lobi intero organo collocati sia all'interno della capsula renale17 o per via intradermica18. Anche se queste opzioni hanno mostrato la loro utilità per interrogare engraftment sistemico funzionale del tessuto, la posizione degli innesti timici profondi all'interno dell'animale o coperti da strati di tessuto opaco limita il loro uso per esame in vivo degli impianti di TPLSM.

La camera anteriore dell'occhio fornisce uno spazio facilmente accessibile per il monitoraggio diretto di qualsiasi tessuto innestato in virtù della trasparenza di strati corneali. Di vantaggio, la base della camera formata dall'iride è ricca di vasi sanguigni e terminazioni nervose autonomiche, consentendo la rapida rivascolarizzazione e reinnervazione del innesti19,20. Dr. Caicedo ha utilizzato con successo questo spazio anatomico per la manutenzione e lo studio longitudinale degli isolotti pancreatici nel passato21. Qui, indichiamo che questa strategia non solo costituisce un valido approccio per studiare la dinamica dei timociti all'interno della struttura nativa dell'organo, ma anche in modo univoco consente di estendere l' in vivo longitudinale registrazioni allo studio del reclutamento di cellule progenitrici e passaggi di egression cellula T maturi nel topo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L'istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) dell'Università di Miami ha approvato tutti gli esperimenti secondo linee guida IACUC.

1. isolamento e guarnizione del neonato Thymi

  1. Preparare tutti i reagenti e strumenti di sterilizzazione in autoclave o altri metodi, garantendo condizioni di sterilità.
  2. Per minimizzare le contaminazioni, eseguire tutte le procedure chirurgiche sotto cappa a flusso laminare.
  3. Prima dell'eutanasia topi donatore, riempire un piatto sterile di 60mm con sterile prechilled 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4) e posizionarlo sul ghiaccio. Servirà per il risciacquo e memorizzare il thymi asportato da topi di donatore prima del trapianto.
  4. Procedere alla eutanasia topi neonati donatore per decapitazione, conformemente agli orientamenti etici.
  5. Posizionare il mouse sui tovaglioli di carta assorbente sterile in una dorsale in posizione verticale e spray e poi pulire, l'addome del mouse con etanolo al 70%.
  6. Esporre la cavità toracica con un'incisione a forma di V superficiale a livello dell'addome inferiore e tagliare la pelle con un paio di cm 10 dritti per dissezione Forbici seguendo una linea mediana ventrale di lasciare un'apertura di circa 0.5-1 cm a livello del petto. Piegare la pelle sopra ogni lato del torace per esporre la cavità toracica.
  7. Fare due più profondo 0,5-1 cm incisioni laterali attraverso il diaframma e la cassa toracica con lo stesso tipo di forbici per accedere dal mediastino superiore nella cavità toracica anteriore. Il timo dovrebbe apparire come due lobi pallidi proprio sopra il cuore.
  8. Posto una serie di forcipe curvo sotto il timo e tirare verticalmente per estrarre l'organo completo. Prevenire il foldback della gabbia toracica con un paio di pinze. Se necessario, è possibile utilizzare una pinzetta per attentamente lacerare il tessuto connettivo che circonda l'organo senza interrompere la capsula prima di estrarre l'organo.
    Nota: Questo passaggio è facilitato utilizzando un ambito di dissezione.
  9. Immergere il timo isolato in freddo sterile 1X PBS (pH 7.4) precedentemente visualizzata in un piatto sterile di 60 mm e tagliare l'istmo di tessuto connettivo con un bisturi per separare i lobi timici. Rimuovere eventuali detriti dal piatto senza danneggiare la capsula. Per minimizzare il tempo thymi sono esposti, tagliare i lobi di timo destra prima dell'impianto.
    Nota: Ogni isolato timo neonato renderà in genere sei segmenti di circa 1 mm di larghezza per un massimo di tre topi di host quando si ricevono gli impianti in entrambi gli occhi.
  10. Ripetere i passaggi da 1.4-1.9 per ogni mouse di donatore. Per minimizzare il tempo thymi sono esposti, è necessario isolare uno timo alla volta.

2. Timo l'impianto nell'alloggiamento anteriore dell'occhio

  1. Prima del trapianto, tag e pesare ogni destinatario mouse.
  2. Utilizzare una dose compresa tra 1-2% dei vapori di surrenalectomia per anestetizzare il destinatario mouse. Garantire la corretta amputate dall'assenza di riflesso pizzico di punta seguenti prima di iniziare la procedura chirurgica.
  3. Procedere con il trapianto di segmenti di timo come segue:
    1. Posizionare il mouse in posizione di decubito laterale lato così che un occhio è rivolto verso l'alto direttamente esposti alla lente dell'ambito per dissezione.
    2. Asportare uno dei lobi timici isolati che si trova nel freddo 1X PBS (pH 7.4)-riempita fino a 1 mm di larghezza per impianto piatto 60mm in pezzi. Seguono uno schema a zig-zag per garantire che ogni segmento contiene midollo e la corteccia timica. Utilizzare Allerød forbici per il taglio secondo le linee guida fornite in Figura 1A.
      Nota: Rimozione del timo dovrebbe essere fatto prima dell'impianto per ottimizzare l'attecchimento del tessuto.
    3. A partire della base della cornea corrispondente all'area chirurgica, introdurre la punta di un ago di 40mm G18 per praticare una piccola incisione in strati di cornea esterna in modo che la punta di forbici per dissezione può essere introdotto.
    4. Fare un 5-10 mm incisione direttamente intorno alla base della cornea con le forbici Allerød tenendo l'apertura di cornea saldamente per evitare una chiusura del fianco. Utilizzare pinze con estremità piatta per evitare danni ai tessuti.
    5. Afferrare l'epitelio cornea tagliato ed esporre l'apertura tenendo la cornea con un paio di pinze estremità piatta mentre spingendo un segmento timico attraverso l'apertura. Bagnare l'occhio con 1x sterile di PBS (pH 7.4) o lacrime artificiali per impedire il disseccamento del tessuto fino al completamento della manipolazione.
    6. Premere delicatamente sulla superficie dell'occhio per far scorrere il segmento di tessuto introdotto una posizione laterale rispetto alla pupilla di conservare la funzione data. Assicurarsi che l'innesto si trova in una posizione di fronte all'occhio apertura per evitare interferenze posteriore con formazione immagine di nonnismo.
    7. Con l'aiuto di pinze piatte, premere saldamente, per circa 3-5 s, i due lati dell'apertura cornea contro l'altro per promuovere autosigillante. La chirurgia non richiede alcun graffatura o cucito.
  4. Se i trapianti vengono eseguiti su entrambi gli occhi, girare il mouse sopra il lato laterale opposto direttamente esporre il secondo occhio alla lente del microscopio per dissezione e ripetere i passi 2.3.2-2.3.7.
  5. Una volta completata l'operazione, è possibile restituire il mouse a una gabbia vuota preriscaldata con una lampada di calore.
  6. Assicurarsi che ogni mouse trapiantato riacquista la completa mobilità e coscienza prima di posizionarla in una gabbia che ha condivisa con gli altri animali. Questo di solito avviene entro 1 h dopo l'intervento chirurgico.
  7. Al momento del trapianto, trattano i topi con antidolorifici come necessario e forniscono i topi con acetaminofene ad una concentrazione di 1,6 mg/mL in acqua potabile.
  8. Ripetere i passaggi da 2.2-2.9 per ogni destinatario mouse.
  9. Monitorare l'attività degli animali post-operatorio, nonché l'aspetto degli occhi impiantati per rilevare potenziali complicazioni di salute.

3. confocale Imaging di Thymi impiantato utilizzando 3D singolo fotone di fluorescenza confocale

  1. Anestetizzare il destinatario mouse usando una dose compresa tra 1-2% dei vapori di surrenalectomia. Garantire la corretta amputate dall'assenza di riflesso pizzico di punta seguenti prima di iniziare la procedura di imaging
  2. Posizionare il mouse su una piattaforma di microscopio palco fisso in posizione di decubito laterale lato in modo che un occhio è rivolto verso l'alto. Un pad termico è posto sulla piattaforma microscopio per garantire una temperatura corporea costante dei topi durante le registrazioni.
    Nota: Vedere complementare figura 1 per i dettagli.
  3. Inserire la testa del mouse in un headholder stereotassiche e regolare la manopola per trattenere la testa del mouse su una posizione laterale che permette accesso diretto dell'obiettivo microscopio all'occhio che tiene l'innesto di timo.
  4. Mettere il muso del mouse in una maschera antigas per tenere l'animale anestetizzato tutta procedura. Questo permette la regolazione dei vapori isofluorano come necessario.
  5. Per facilitare la stabilizzazione dell'occhio durante le registrazioni, evitando la retrazione delle palpebre, tirare indietro le palpebre mentre si tiene l'occhio al margine cornea con un paio di pinzette che hanno loro suggerimenti coperti da un tubo di polietilene che sono fissate ad una UST-2 solido giunto universale. Questa disposizione permette una fissazione stabile della testa e degli occhi e fornisce la flessibilità senza interruzioni del flusso di sangue nell'occhio, come descritto in precedenza22.
    Nota: Figure complementari 1B, C mostrano l'assemblaggio completo.
  6. Aggiungere poche gocce di lacrime artificiali o soluzione fisiologica sterile come il liquido di immersione tra la cornea e la lente, prima di mettere l'obiettivo del microscopio sull'occhio del mouse.
    Nota: ulteriori gocce sono dispensati necessità durante tutta la procedura per mantenere il percorso di microscopio e prevenire la secchezza degli occhi.
  7. In primo luogo utilizzare lente di ingrandimento basso (5 X) per individuare il timo nel campo del microscopio. Quindi passare alla maggiore immersione in acqua ad alta risoluzione (10, 20 e 40 X) immersione obiettivi con lunga distanza di lavoro. Evitare LSM photodamage e lo sbiancamento dell'impianto timica applicando potenza laser minimale e ridurre il tempo di scansione per quanto possibile. Ciò si ottiene utilizzando lo scanner risonante del microscopio.
    Nota: Il microscopio confocale che usiamo è dotato di specchi scansione risonante in grado di raccogliere immagini 25 fotogrammi/s. Altre marche hanno i propri microscopi con scanner risonante.
  8. Selezionare la modalità di acquisizione utilizzando il software di microscopio e avviare la modalità scanner risonante. Quindi scegliere la modalità di imaging XYZT e configurare le impostazioni di acquisizione come segue:
    1. Accendere il laser di Argon e regolare la potenza al 30% per l'eccitazione di fluorescenza.
    2. Scegliere una linea di laser di eccitazione e impostare il controllo splitter (AOBS) di fascio acusto-ottico per lunghezze d'onda di emissione differenti. Inoltre, per rilevare backscatter e delineare la struttura del tessuto, utilizzano il rilevamento di riflessione contemporaneamente.
      Nota: Selezionando un set di colori per l'eccitazione (GFP e RFP), il AOBS è programmato per indirizzare queste linee di eccitazione sul campione e trasmettere l'emissione tra di loro. Per esempio, per GFP e RFP, usiamo bande strette di riflessione per la luce di eccitazione circa 488 nm e 561 nm, rispettivamente. Questo lascia larghe bande per la raccolta dei fotoni di fluorescenza emessa, riducendo così la necessità di tempo di acquisizione e potenza del laser. In modalità di riflessione, il AOBS viene utilizzato come un divisore di fascio 50/50 per luce riflessa in qualsiasi lunghezza d'onda lontano da quelli usati per la rilevazione della fluorescenza emissione di immagine.
    3. Raccogliere l'emissione alla lunghezza d'onda selezionata, quindi selezionare una risoluzione di 512 × 512 pixel e avviare live imaging premendo il tasto Live , regolando i livelli di guadagno come necessario (guadagno tipico è intorno a 600 V).
    4. Definire l'inizio e la fine dello z-stack focalizzando l'attenzione sulla parte superiore dell'impianto timica e selezionare iniziare, quindi spostarsi all'ultimo piano che possa essere focalizzato nel timo impiantato e seleziona fine. Utilizzare una dimensione di z-passaggio di 5 µm. Il software calcolerà automaticamente il numero di aerei confocale.
    5. Scegliere l'intervallo di tempo per l'acquisizione di ogni z-stack (in genere 1,5-2 secondi) e selezionare l'opzione di acquisire deve essere interrotta per l'imaging di continuo.
  9. Premere il tasto Start per inizializzare.
  10. Gli innesti della battuta ripetutamente in momenti diversi dall'animale stesso ripetendo i passaggi 3.1-3.9.
    Nota: Se l'animale contiene innesti su entrambi gli occhi, le registrazioni da occhio possono essere assunto ripetendo i passaggi 3.2-3.9 dopo il passaggio il lato verticale della testa del mouse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Timo da topi neonati sono stati isolati da B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas topi come descritto in questo protocollo (punti 1.1-1.9). In questi topi transgenici, il promotore di pollo beta actina dirige l'espressione della variante della proteina fluorescente rossa DsRed. MST sotto l'influenza del rinforzatore di inizio immediato del citomegalovirus (CMV) facilitando il monitoraggio degli impianti.

Per prevenire il rigetto del tessuto, isogeni individui con genotipo: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J sono stati selezionati come padroni di casa. In questi topi transgenici, il promotore umano ubiquitina C dirige l'espressione di migliorata della proteina fluorescente verde (GFP) in tutti i tessuti, permettendo una chiara differenziazione tra tessuto del donatore e del destinatario. L'azione del promotore umano di ubiquitin C conduce a differenziale modelli di espressione di GFP in determinati tipi di cellule ematopoietiche. In particolare, le cellule T presentano una 2 volte più alta espressione di GFP livelli di CD19+B220+ B cellule o altre cellule del sangue periferico che possono facilitarne l'identificazione di tecniche quantitative sensibili come flusso cytometry, senza alcun esigenze di etichettatura supplementari. Inoltre, l'espressione fluorescente in questi topi è osservata in animali adulti, così come in tutte le fasi embrionali ed è uniforme all'interno di un lignaggio di tipo cellulare garantendo stabilità di marcatore.

Il modello per il taglio di timo mostrato in Figura 1A segue le descrizioni precedenti di frammenti di timo funzionale impiantati nel rene capsula23. Questa procedura di trimming consente una riduzione del volume totale del tessuto da impiantare, preservando le unità funzionali di base istologiche dell'organo (corteccia, midollo e giunzione cortico-midollare (CMJ) vasi sanguigni). La notevole differenza nelle dimensioni tra timo neonato (Figura 1A, sinistra) e timo da uno - settimana-vecchi topi (Figura 1A, destra) dovrebbe essere presi in considerazione per la guarnizione, come lo spazio disponibile per montare impianti nell'alloggiamento anteriore del mouse occhio è limitato. I risultati presentati qui sono le protesi ottenute dai neonati solo. Figura 1B Mostra un'immagine macroscopica di un segmento timica impiantato nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di mouse GFP, accomodato per preservare la visione degli animali. Dettagli istologici dell'impianto in riferimento la cornea (tessuto GFP adiacente ad innesto RFP) possono essere osservati nella ricostruzione 3D delle immagini confocal in supplementare Video 1. L'attecchimento di iride è mostrato nel Video 1 e Figura 2.

Figura 1 e 1 D rispettivamente illustrano campo luminoso e immagini di fluorescenza della stessa area che possono servire per una matrimoniale-macroscopica follow-up di crescita dei tessuti e l'involuzione negli studi di continuazione. Figura 1 illustra anche la vascolarizzazione del tessuto impiantato che dovrebbe consentire in modo univoco per lo studio della fisiologia del timo dipenda dal rifornimento di anima di organo lungo tempo.

La vascolarizzazione dei frammenti inseriti timici si è verificato all'interno post-dell'impianto 72h. Il processo di rapida vascolarizzazione è in buon accordo con la grande quantità di vasi sanguigni trovate l'iride e la ricchezza del timo nella produzione di citochina. Queste caratteristiche consentono veloce attecchimento di thymi inserito. La vascolarizzazione delle protesi è illustrata nel Video 2, mostrando l'attecchimento dei vasi sanguigni timici con il iris´ dell'host individuali (GFP il tessuto adiacente all'impianto RFP), pertanto, confermando che il modello qui presentato, infatti, consente monitorizzazione continua non invadente del timo vascularized a livello microscopico. L'uso di LSM per visualizzare endogeno timo o timo precedentemente impiantati nelle posizioni anatomiche differenti è limitato dal tessuto opacità e spessore del tessuto superiore a 1 mm. La camera anteriore dell'occhio è considerata come una "finestra" per l'organismo facilitando l'osservazione dei tessuti impiantati a livello microscopico.

Qui, è dimostrato che il modello sviluppato dal nostro gruppo permette la visualizzazione di trasmigrazione delle cellule dal torrente di sangue (Video 2) nei timo impiantato (presumibilmente progenitori); per il tracciamento dei contatti delle cellule del progenitor GFP in ingresso nell'impianto timica con residente timici epiteliali e stromali cellule (RFP-etichettato) durante i processi di differenziazione e di selezione (video 3 e 4) e, anche, per l'uscita delle cellule (cellule T presumibilmente mature) nei vasi sanguigni (Video 5).

L'approccio che descriviamo così rappresenta la "prova di principio", basato su registrazioni prese tra 72 ore e un mese dopo l'impianto da sei individui trapiantati con i segmenti da tre donatori neonati indipendenti, per un animale modello che permette in vivo inseguimento in tempo reale di maturazione del timocita in un frammento timico vascolarizzato da lungo tempo, non invasive e come tale, il protocollo potrebbe essere necessario ulteriori perfezionamenti. Questo modello potrebbe essere ulteriormente elaborato facendo uso di animali transgenici che harboring marcatori molecolari con etichetta timociti, ad esempio, prodotti di fusione come fluorescenti, permettendo così la visualizzazione diretta di intermedi di maturazione delle cellule T. Il sistema può aiutare la risoluzione delle controversie e rispondere incognitas legato alla selezione e differenziazione di timociti eventi tra l'altro.

Figure 1
Figura 1. Sezionamento del neonato lobi timici donatore e trapianto nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di topi. Appena nato (A) (a sinistra) e una settimana postnatale thymi (a destra) immagini. Linee di Dash il neonato timo rappresentano guide per preparare sezioni per trapianto nella camera anteriore dell'occhio dei topi per stimare il numero massimo dei trapianti da un donatore. (B) immagine rappresentativa risultati appena impiantato del timo. (C) immagine rappresentativa di innestate, vascolarizzato timo 2 settimane dopo l'impianto. (D) immagine di fluorescenza dell'innesto di timo sulla (C). Barra della scala è indicato (1 mm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Confocale immagine mostra il dettaglio del engraftment di segmento (rosso) di timo nell'iride (verde). Immagine ottenuta con un microscopio, utilizzando le seguenti impostazioni: 488 e 561 nm eccitazione/500 e 575 nm emissione lunghezze d'onda, risoluzione di 512 x 512 pixel e 40 X immersione obiettivo con lunga distanza di lavoro. Barra della scala è mostrato (40 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 1
Complementare figura 1. Installazione per imaging confocale dell'innesto timico usando 3D singolo fotone di fluorescenza confocale microscopia laser. (A) Heatpad, headholder stereotassiche e maschera antigas dettagli. (B) impostare il mouse tenendo premuto l'innesto di timo per LSM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1
Video 1. In vivo imaging del timo impianti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio mouse. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 2
Video 2. Reclutamento di timo presumibile assestamento dei progenitori (TSP) dal flusso sanguigno (GFP) nel parenchima timico (RFP). Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 3
Video 3. Stocastico movimento dei timociti (primi progenitori del timo o PTE) nella corteccia. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 4
Video 4. Interazione dei timociti (GFP) con cellule stromali del timo (RFP) CTEC (cellule epiteliali timiche corticale) o mTECs (cellule epiteliali timiche midollare). Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 5
Video 5. Formazione immagine di uscita di tempo reale di potenziali cellule T mature. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Supplementary Video
Supplementare Video 1. 3D -in vivo imaging del timo impianti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio mouse. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dovuto l'importanza del processo di maturazione della T-cellula per competenza immunitaria individuale4 e il presunto impatto delle dinamiche delle cellule precursore su cellule T mature prodotte dal timo2,3, notevoli sforzi sono stati investiti sviluppare alternative all'approccio classico tessuto fisso dello snapshot.

Anche se fettine di tessuto e altri espianti sono chiaramente superiori a riprodurre l'architettura del tessuto di monostrati o aggregati organo timico culture14,15, l'assenza di una connessione al sistema vascolare limita il loro uso per studiare il passaggi di entrata o TSP (traslocazione dei progenitori attraverso barriera di cellule endoteliali del vaso sanguigno) e uscita (traslocazione dei linfociti T maturi attraverso barriera di cellule endoteliali del vaso sanguigno) dall'organo. Come è stato ipotizzato che le dinamiche del T-cell contatti con altre cellule, compreso le cellule stromali del timo e loro motilità attraverso microambienti all'interno della corteccia e il midollo determinano loro status di differenziazione e il processo di sottopopolazione selezione (positivi e negativi)2,3,4,5, e dal momento che questi processi possono dipendere da TSP e gli eventi di uscita della T-cellula maturi, un modello che include la connessione per il sostare il flusso di sangue sistema sarebbe auspicabile.

Gli impianti capsula intradermico e rene del timo permettono per questo aggiornamento17,18. Tuttavia, essi costituiscono metodi invasivi con limitazioni imposte all'imaging di TPLSM dovuto la posizione profonda dell'impianto all'interno del corpo o la presenza di strati opachi del tessuto sopra l'innesto. L'adattamento della camera oculare anteriore del mouse, precedentemente usata come una "finestra"21,22 al longitudinalmente di monitorare le prestazioni dei diversi tessuti, come un sito per tenere traccia di cellule T all'interno un timo vascularized offre diversi vantaggi contro altre strategie di trapianto. Da un lato, l'intervento chirurgico è più semplice perché suture non sono necessari, che porta al recupero più veloce di ospitare animali. Da altro lato, l'osservazione degli impianti non richiede un ulteriore intervento chirurgico come accade per gli impianti di capsula renale, permettendo per registrazioni ripetute dall'animale stesso. Inoltre, le particolari caratteristiche anatomiche dell'occhio permettono di modulare facilmente regolamentazione ingressi sul tessuto impiantato non solo sistemica ma anche localmente. Come descritto in precedenza, con questo approccio, sostanze possono essere applicati sull'occhio per via topica o iniettati nella camera anteriore dell'occhio. Esso rappresenta anche un'opzione facile introdurre sostanze o cellule direttamente nel timo (cioè., progenitori o maturazione intermedi con etichetta ex vivo e trasferiti passivamente), che è stato tradizionalmente una procedura altamente complessa a causa della posizione anatomica timo24,25. La perfusione dell'alloggiamento anteriore consente inoltre lo scambio di umore acquoso o caricamento dell'innesto di diffusione con indicatori fluorescenti, come precedentemente indicato per altro tipo di protesi26.

L'approccio che più fedelmente permette lo studio della fisiologia del timo è fornito l'imaging videomicroscopia di pesci medaka transgenici che esprimono gli indicatori fluorescente contrassegnati del linfocita. La trasparenza di medaka durante lo sviluppo e per tutta la vita a molti ceppi di medaka rende vantaggioso per il monitoraggio dinamica cellulare in vivo21questo organismo. Il basso numero di timociti motili osservata in medaka (29%)18 in riferimento al mouse´s (95%)13, oltre alle differenze nei tassi di motilità tra questi due organismi, tuttavia, suggerisce che il freddo sangue vertebrato più piccolo con un sistema immunitario adattativo può essere limitata a rivelare particolare cinetica meccanicistico di eventi di maturazione della T-cellula vertebrati superiori.

Una limitazione dell'uso della camera anteriore dell'occhio del mouse come il sito per il trapianto di timo è limitazione di spazio. Studi a lungo termine potrebbero essere, pertanto, compromessa; in particolare per tessuti embrionali o neonati con potenziale di crescita allargata. In questo senso, dobbiamo affermare che anche se gli impianti appena nati ha presentati con l'espansione del tessuto apparente dopo il prima settimana dopo l'impianto nell'occhio del mouse (dati non mostrati), l'allargamento non sembrano mettere a rischio l'integrità dell'occhio la fino a due mesi post-implantare. Tuttavia, dovrebbe essere di interesse per valutare se l'ambiente di tessuto dell'impianto (camera occhio, capsula del rene o derma) influenza la crescita implant´s e/o definito vascolarizzazione prima di poter stabilire l'adeguatezza dell'approccio per applicazioni.

Il grande incisione richiesta sulla cornea per consentire che il passaggio del frammento timico nella camera anteriore dell'occhio conduce occasionalmente ad alcuni nonnismo a questo livello (dati non mostrati), molto probabilmente è legato a certo grado di fibrosi associata al processo di guarigione. Attenzione è richiesto il passaggio 2.3.6 del protocollo per garantire che in caso di nonnismo minimamente interferirà con la procedura di imaging a valle. Come l'incisione è praticata a livello laterale, né l'impianto né il nonnismo dovrebbe influenzare significativamente le prestazioni di vista di animali.

La necessità per il taglio del tessuto rendere il timo si inseriscono nella camera occhio sembra essere uno svantaggio se rispetto ad altri siti anatomici che non necessitano di alterare l'integrità anatomica dell'organo. Tuttavia, l'approccio di capsula renale ha dimostrato che i frammenti del timo contenente, entrambi, corteccia e midollo ottenute da linee guida di dissezione simili a quelli mostrati in Figura 1, diventano completamente funzionale come essi possono ricostituire T-cellula immunità mediata in ospiti immunodeficienti thymeless18. Tutto questo depone a favore di intatti caratteri funzionali di questo tipo di segmenti di timo. Inoltre, il protocollo descritto qui sottolinea che il timo isolato dovrà essere tenuto a freddo (passaggio 1,9) e solo parzialmente rasata diritto prima dell'impianto (punto 2.3.2) per ridurre al minimo l'esposizione fredda di ischemia e tessuto verso l'ottimizzazione di attecchimento del tessuto.

Un'ulteriore limitazione potenziale dell'approccio risiede nelle differenze di composizione tra l'umore acqueo nella camera anteriore dell'occhio e del plasma sanguigno, problema che deve essere tenuto in mente quando interpretare le osservazioni fatte in questa posizione anatomica . Gli studi precedenti con altri tessuti, tuttavia, non sono segnalati effetti evidenti per la funzione normale dell'innesto dall'occhio locale ambiente22. Anche se l'esperienza con il modello qui presentato è limitato a pochi individui (N = 6 e N = 3 per destinatari & donatori, rispettivamente) allo stato attuale, non abbiamo osservato alcun principali alterazioni associate per impiantare il sito nel caso di impianti timici in uno qualsiasi dei gli individui in entrambi.

Il protocollo qui presentato costituisce un principio di prova per lo studio di imaging videomicroscopia longitudinale delle dinamiche di timociti impiantando tessuto timico nell'alloggiamento anteriore dell'occhio del mouse. Dovuto la selezione dei destinatari immunocompetenti, il sistema non ha permesso di mettere in discussione la funzione sistemica dell'innesto. Gli studi futuri possono costruire su questo approccio, scegliendo diversi donatori e/o destinatari e/o sottoponendo i padroni di casa per irradiazione e trapianto di midollo osseo (BM) secondo i disegni di studio particolare. Ad esempio, la scelta dei topi SCID (immunodeficienza combinata grave) come destinatari Elimina l'interferenza delle T-cellule endogene, e la scelta dei donatori di topi transgenici (impianto timica e/o BM) che presenta indicatori a cellula T, marcatori di DC, timici stromale gli indicatori delle cellule, ecc., singolarmente o in combinazioni dovrebbe permettere il rilevamento diretto in vivo delle sottopopolazioni cellulari. In alternativa, potrebbero essere rintracciate sottopopolazioni delle cellule nella camera anteriore dell'occhio dei topi, come precedentemente descritto, da in vivo fluorescenza cytolabeling26.

Uno dei principali vantaggi del modello presentato qui è che esso permette lo studio progenitore e traslocazione di cellule T mature da e verso i vasi sanguigni. Così, dovrebbe essere pertinente determinare se la vascolarizzazione rapidamente acquisita del timo dopo essere impiantato nella camera anteriore dell'occhio ricapitola il vasculature endogeno. A favore di questa possibilità, dovrebbe essere accennato che il neovascularization nel vano anteriore del mouse sembra essere dettata da innesto18,20 , piuttosto che dal destinatario e, pertanto, le connessioni al sistema vascolare iris deve preservare l'integrità di dominio giunzione cortico-midollare (CMJ) endogeno del timo.

Un ulteriore vantaggio deriva dal fatto che il sistema permette la valutazione di due impianti indipendenti (bicamerale oculare anteriore) su fondo individuale identico (un singolo host). Studi richiede combinazioni di tessuti possono anche risultare vantaggioso utilizzare questo sistema.

Come il timo svolge un ruolo importante in patologie autoimmuni e sistema immunitario carente, questo approccio potrebbe essere utilizzato per affrontare una miriade di potenziali domande. In particolare, il sistema dovrebbe consentire macroscopico oltre a imaging intra-organo per la progressione dell'involuzione del timo. Essa può anche servire per studiare gli eventi di tolleranza di trapianto e disfunzioni immunitarie legate alle infezioni. È probabile che il bene dissezione dei meccanismi che regolano la maturazione del timocita fornirà nuovi indizi per la progettazione di ulteriori strategie terapeutiche in via di sviluppo le cellule di T di targeting.

Trapianto del timo per la camera anteriore dell'occhio prende meno di 45 min, compreso isolamento timo neonatale e la rifilatura per ogni host individuali con gli innesti a occhio. In vivo imaging registrazioni richiedono h 1 a 5, a seconda delle caratteristiche monitorati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) e R21ES025673 (AC) e con la concessione BEST/2015/043 (Consellería de Educació, cultura ho esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spagna) (EO). Autori ringraziano la squadra di inviati presso la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spagna, Alberto Hernandez Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spagna per il loro aiuto con riprese video e montaggio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane Kent Scientific Corp VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source Zeiss Stemi 305
Fine dissection forceps WPI 500455
Medium dissection forceps WPI 501252
Curved tip fine dissection forceps WPI 15917
Vannas scissors WPI 503371
Dissecting scissors WPI 503243
Scalpel WPI 500353
40 mm 18G needles BD 304622
Disposable transfer pipette Thermofisher 201C
Heat pad and heat lamp Kent Scientific Corp Infrarred
Ethanol 70% VWR 83,813,360
60 mm sterile dish SIGMA CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4) Thermofisher 10010023
Sterile wipes Kimberly-Clark LD004
Drugs for pain management Sigma-Aldrich A3035-1VL
Saline solution or Viscotears Novartis N/A
Stereomicroscope Leica MZ FLIII
Head-holding adapter Narishige SG-4N-S
Gas mask Narishige GM-4_S
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Laminar flow hood Telstar BIO IIA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
  2. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6, (2), 127-135 (2006).
  3. Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69, (5), 663-682 (2012).
  4. James, K. D., Jenkinson, W. E. &, Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go? Journal of Leukocyte Biology. (2018).
  5. Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75, (6), 951-961 (2004).
  6. Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
  7. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  8. Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
  9. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
  10. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  11. Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
  12. Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
  13. Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3, (6), e160 (2005).
  14. Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. Chapter 3, Unit 3.18 (2006).
  15. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
  16. Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
  17. Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
  18. Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179, (3), 1605-1615 (2007).
  19. Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
  20. Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10, (1), 73-80 (2002).
  21. Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3, (8), 1278-1286 (2008).
  22. Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14, (5), 574-578 (2008).
  23. Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99, (99), (2015).
  24. Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87, (2), 140-147 (2012).
  25. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
  26. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (31), 12863-12868 (2011).
Inseguimento <em>In Vivo</em> dei timociti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di microscopia a scansione Laser in tempo reale
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).More

Oltra, E., Caicedo, A. Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (140), e58236, doi:10.3791/58236 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter