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Biochemistry

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Presentiamo un metodo per la generazione di in vitro autosostenuto mitotica oscillazioni a livello di singola cellula incapsulando gli estratti di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di acqua in olio.

Abstract

Misura in tempo reale delle oscillazioni a livello di singola cellula è importante scoprire i meccanismi di orologi biologici. Anche se alla rinfusa gli estratti preparati con uova di Xenopus laevis di sono stati potenti in reti biochimiche che sono alla base della progressione del ciclo cellulare di dissezione, loro misura media ensemble in genere porta ad un'oscillazione smorzata, nonostante ciascuno oscillatore individuale essendo sostenuta. Ciò è dovuto la difficoltà di sincronizzazione perfetta tra singoli oscillatori in sistemi biologici rumorosi. Per recuperare la cella singola dinamica dell'oscillatore, abbiamo sviluppato un sistema di cellula artificiale basata su goccia che può ricostituire mitotic cicli nei compartimenti di cellula-come incapsulare ciclismo estratti citoplasmatici di uova di Xenopus laevis . Queste semplici cellule solo citoplasmatici presentano oscillazioni sostenute per oltre 30 cicli. Per costruire più complicate cellule con i nuclei, abbiamo aggiunto della cromatina di sperma demembranated per attivare l'auto-assemblaggio nuclei nel sistema. Abbiamo osservato una progressione periodica del cromosoma condensazione/decondensazione e nuclei avvolgono ripartizione/riforma, come nelle celle reali. Questo indica che l'oscillatore mitotica funzioni fedelmente per guidare più a valle eventi mitotic. Contemporaneamente abbiamo rintracciato la dinamica dei processi a valle in goccioline individuali utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse multi-canale e oscillatore mitotica. Il sistema di ciclo cellulare artificiale fornisce un framework di alto-rendimento per manipolazione quantitativa e l'analisi delle oscillazioni mitotiche con cella singola ad alta risoluzione, che probabilmente fornisce importanti intuizioni la regolamentazione macchine e funzioni di l'orologio.

Introduction

Estratti citoplasmatici preparati con uova di Xenopus laevis di rappresentano uno dei modelli più predominanti per lo studio biochimico dei cicli cellulari, dato il grande volume di ovociti, la progressione del ciclo cellulare rapida e la capacità di ricostituzione eventi mitotic in vitro1,2. Questo sistema ha permesso la scoperta iniziale e caratterizzazione meccanicistico di regolatori del ciclo cellulare essenziale come fattore di promozione di maturazione (MPF) così come i processi mitotici a valle tra cui spindle assembly e cromosoma segregazione1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Gli estratti di uovo di Xenopus sono stati utilizzati anche per la dissezione dettagliata delle reti regolatori del ciclo cellulare orologio8,12,13,14 e per gli studi del danno del DNA /Replication checkpoint15 e il fuso mitotico Assemblea checkpoint16,17,18.

Questi studi dei cicli cellulari usando gli estratti di uovo di Xenopus sono principalmente basati su misurazioni di massa. Tuttavia, analisi di reazione di massa convenzionale non possono imitare i comportamenti reali delle cellule, dati una discrepanza di maggiore dimensioni e subcellulare compartimentalizzazione spaziale delle molecole di reazione. Inoltre, misurazioni di massa di attività mitotica sono inclini a dare un numero limitato di cicli prima di smorzamento rapidamente8. Questi svantaggi delle reazioni di massa hanno impedito il sistema estratto per fornire ulteriore comprensione delle proprietà dinamiche complesse orologio e funzioni. Studi recenti hanno incapsulato senza cellula citostatico fattore-arrestato (CSF) Xenopus estrae19,20 in dimensione definita cellula-come compartimenti, che hanno contribuito a delucidare come dimensione del mandrino è modulata dalla volume citoplasmatico. Tuttavia, questo sistema in vitro è arrestato alla metafase della meiosi II dall'azione del fattore citostatico1, ed è necessario un sistema capace di oscillazioni sostenute a lungo termine a livello di singola cellula per ulteriori indagini del ciclo cellulare oscillatore.

Per studiare le oscillazioni del ciclo cellulare con cella singola risoluzione, abbiamo sviluppato una cella-scala, sistema ad alta produttività per la ricostituzione e la misura simultanea di più processi oscillatori mitotici autogestiti in microemulsione individuo goccioline. In questo protocollo dettagliato dei video, dimostriamo la creazione del sistema artificiale oscillazione mitotica incapsulando ciclismo citoplasma di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di dimensioni che vanno da 10 a 300 µm. In questo sistema, sono stati mitotiche oscillazioni tra cui condensazione cromosomica e de-condensazione, ripartizione busta nucleare e riforma e la degradazione e sintesi dei substrati anafase (ad es., securin-mCherry in questo protocollo) ricostituito con successo.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.

1. preparazione dei materiali per il rilevamento e la ricostituzione del ciclo cellulare

  1. Assemblea di Gibson clonazione per la costruzione del DNA del plasmide e la purificazione di mRNA di securin-mCherry
    1. Preparare tre frammenti di DNA, tra cui una spina dorsale di vettore di pMTB2, securin e mCherry tramite reazione a catena della polimerasi (PCR) e gel purificazione21,22.
    2. Misurare le concentrazioni di frammenti usando un fluorospectrometer. Combine 100 ng di dorsali con inserti securin e mCherry a un 1:1:1 rapporto molecolare e aggiungere acqua deionizzata per regolare il volume totale di reazione a 5 µ l.
    3. Preparare 6 mL di tampone di reazione isotermica Assemblea: 5x con 3 mL di 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 300 µ l di 1 M MgCl2, 600 µ l di 10 mM dNTP, 300 µ l di 1 M DTT, 1,5 g di PEG-8000 e 20 mg di NAD23.
    4. Aggiungere i frammenti combinati a un 15 µ l di 1 tampone di reazione isotermica Assemblea x aliquota. Incubare la reazione in un tubo di reazione di PCR a 50 ° C per 15 minuti.
    5. Rendere un'agarosi 0,8% gel e funzionare con una tensione di 10 V/cm per verificare l'efficienza di ricottura di questi frammenti.
    6. Purificare il plasmide costruito ed eluire utilizzando 15 µ l di acqua RNAsi-libera. Trasformare 1 µ l del DNA del plasmide purificato in 50 µ l di competenti DH5α Escherichia coli cellule24 per un utilizzo futuro.
    7. Estrarre e purificare il plasmide del DNA di securin-mCherry dai competenti DH5α Escherichia coli cellule.
    8. Trascrivere il DNA del plasmide linearizzato securin-mCherry in mRNA e purificare il mRNA. Utilizzare uno spettrofotometro per verificare che la concentrazione del mRNA è più di 100 ng / µ l e il rapporto di assorbanza a 260 nm e 280 nm è circa 2.0.
  2. Preparazione di demembranated DNA dello sperma di Xenopus laevis
    Nota: Adattato da Murray 19911.
    1. Eutanasia maschio adulto Xenopus laevis25 e sezionare i testicoli da quattro rane maschio26,27.
    2. Posto testicoli da quattro rane nella stessa mL 100 di Petri. Sciacquare i testicoli tre volte in 50 mL di soluzione fredda di x MMR 1 (0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM di MgCl2, 2mm CaCl2, 5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA).
    3. Rimuovere il sangue in eccesso e il grasso dai testicoli in una capsula Petri 100 mL e poi lavare due volte nel buffer di preparazione nucleare fredda (NPB) (250 mM saccarosio, 15 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, triidrocloruro di spermidina 0,5 mM, 0,2 mM spermina tetrahydrochloride).
    4. Rimuovere il buffer di preparazione nucleare (NPB) e tagliare i testicoli in pezzi con lunghezze inferiori a 0,2 cm utilizzando delle forbici affilate per dissezione in un 100ml di Petri. Aggiungere 8 mL di NPB freddo ai testicoli per ulteriore ripartizione.
    5. Maglia di nylon di uso tessuti con un diametro dei pori di 70 µm per filtrare i testicoli e prelevare il campione di sperma in una provetta conica da 15 mL. Rotazione verso il basso gli spermatozoi raccolti a 1.730 x g a 4 ° C per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
    6. Fornire le cellule dello sperma con 1 mL di NPB e 50 µ l di 10 mg/mL lisolecitina e incubare a temperatura ambiente per 5 min a demembranate spermatozoi.
    7. Lavare il DNA dello sperma demembranated con 10 mL di NPB freddo con soluzione al 3% BSA tre volte.
    8. Misurare la densità del DNA spermatico con un emocitometro.
    9. Congelare il DNA dello sperma in aliquote di 5 µ l in azoto liquido e conservato a-80 ° C. La concentrazione ottimale del DNA spermatico è circa 105 nuclei / µ l.
  3. Purificazione della proteina del segnale di localizzazione nucleare-GFP (GFP-NLS)
    1. Trasformare il plasmide di GST-tagged GFP-NLS BL21 (DE3) competente Escherichia coli cellule5.
    2. Incubare le cellule senza antibiotici a 37 ° C per 1 h e poi diffusa su un piatto di agarosio LB con ampicillina di 100 µ g/mL.
    3. Incubare la piastra a 37 ° C per 14 a 18 ore a crescere le cellule in singole colonie. Pick e inoculare singole colonie in 4 mL di terreno LB con ampicillina di 100 µ g/mL. Agitare le cellule a 37 ° C per 12 ore.
    4. Preparare il supporto di YT autoclavato (16 g di Bacto-tryptone, 10 g di Estratto di Bacto-lievito, 5 g di NaCl) e riscaldare i media di YT a 37 ° C.
    5. Inoculare 1 mL delle cellule incubate overnight LB media in 250 mL di media di YT preriscaldato con ampicillina di 100 µ g/mL e agitare per 2 ore aumentare la densità delle cellule.
    6. Misurare la densità ottica (OD) di cella ogni 30 minuti, utilizzando uno spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 600 nm. Aggiungere 0,1 mM IPTG nelle cellule per indurre l'espressione della proteina GFP-NLS, una volta che raggiunge il valore di OD 0,1.
    7. Agitare le cellule a 18 ° C durante la notte per ridurre il tasso di crescita delle cellule e consentire la sintesi e la migliore espressione della proteina.
    8. Rotazione verso il basso le cellule a 34.524 x g a 4 ° C per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
    9. Risospendere il pellet cellulare in 40 mL di PBS buffer (fornito con 800 µ l di lisozima di 50 mg/mL, 100 µ l di 0,2 M PMSF, 13,2 µ l di una miscela di 10 mg/mL di leupeptina e pepstatina chymostatin e 8 µ l di EDTA 0.5 M) e incubare a 4 ° C per 20 minuti.
    10. Rompere giù celle utilizzando un sonicatore ad una frequenza di 20 kHz per 4 x 30 s, con intervalli di 30 s tra ogni sonicazione, di rilasciare espressa della proteina GFP-NLS.
    11. Spin a 20.000 x g per 35 minuti per rimuovere le cellule rotte.
    12. Cromatografia di affinità consente di estrarre e purificare la proteina GFP-NLS.
    13. Lavare i residui di perlina di 1,5 mL tre volte con 15 mL di tampone PBS e incubare 250ml di lisato con perline per 4 ore a 4 ° C con inversione.
    14. Rotazione verso il basso le perline a 2000 x g per 5 min e aggiungere 10 mL di soluzione di lavaggio (25 mM Tris base, pH 7.5, NaCl, 500 mM e 5 mM DTT) perle. Incubare perline in 700 µ l di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 20mm ridotto glutatione e 5 mM DTT) con rotazione a 4 ° C. Raccogliere un'aliquota dell'eluizione con un volume di 50 µ l.
    15. Misurare la concentrazione di proteina raccolta eseguendo un gel blu di Coomassie28.
    16. Eluire le proteine usando PD-10 colonne con 3 mL di buffer di memoria (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glicerolo, pH 7,7) attraverso lo scambio di buffer.

2. preparazione del ciclismo Xenopus estratti

Nota: La procedura generale di preparare gli estratti è illustrata in Figura 1A. Adattato da Murray 19911.

  1. Iniettare la femmina matura tre Xenopus laevis con 66 UI cavalla incinta del siero di gonadotropina (PMSG) 10 giorni prima di deporre le uova.
  2. Iniettare queste rane Xenopus con 500 UI di gonadotropina corionica umana (HCG) per indurre 18 ore prima della preparazione del ciclismo estratti la deposizione delle uova.
  3. Scartare le uova deposte durante la notte. Basato su esperimenti (dati non mostrati), gli estratti preparati con le uova appena spremute di generano attività di più lunga durata rispetto gli estratti preparati da uova deposte dalla stessa femmina rana. Spremere le uova di ogni rana femmina in mm 100 capsule di Petri contenente 10 mL di buffer di x MMR 0,2 ed esaminare sotto un microscopio stereo.
  4. Scartare i lotti di uova che hanno poco chiari confini fra l'animale e vegetale poli o avere macchie bianche irregolari in cima a pali di animale.
  5. Scegliere il lotto di uova da una rana femmina che presenta una popolazione omogenea di uova con poli vegetale e animale chiaramente differenziate e trasferire le uova in un becher da 600 mL.
  6. Versare il tampone x MMR 0,2 in eccesso e delicatamente aggiungere 250 mL di 2 g / 100 mL cisteina (pH 7,7) in 1 x estrarre buffer (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 1mm MgCl2, 10 mM HEPES, saccarosio 50 mM, pH 7,7) alle uova.
  7. Agitare vigorosamente le uova e rimuovere gli strati di gelatina di uova oltre tre lavaggi con un volume totale di 800 mL di cisteina nel buffer per 3 minuti o fino a quando le uova aggregazione e depositano sul fondo del becher, che indica che la gelatina cappotto rimozione è riuscito.
  8. Lavare le uova con 1 L di soluzione di x MMR 0,2 oltre quattro volte.
  9. Scegliere e scartare le uova che diventano bianche usando una pipetta di vetro.
  10. Versare il buffer di MMR e uova con 200 mL di 0,1 µ g/mL calcio ionoforo A23187 soluzione del 0,2 x MMR per l'attivazione di alimentazione.
  11. Utilizzare il lato di apertura di una pipetta di vetro per mescolare le uova delicatamente fino a quando le uova sono attivate e si rimuove la soluzione ionoforo del calcio.
  12. Verificare l'efficienza di attivazione dopo uova stabilirsi nella parte inferiore del bicchiere. Uova ben attivate hanno circa il 25% del polo animale e 75% del palo vegetal.
  13. Lavare le uova attivate due volte con 50 mL di tampone Estratto completati con inibitori della proteasi (10 µ g/mL ciascuno di leupeptina e pepstatina chymostatin) 1x.
  14. Trasferire con cautela le uova ad una microprovetta salvapercussore 0,4 mL e poi pack uova attraverso centrifugazione a 200 x g per 60 secondi e poi 600 x g per 30 secondi.
  15. Rimuovere il tampone extra sulla cima di uova usando un pipetta Pasteur di vetro per ridurre la diluizione degli estratti.
  16. Schiacciare le uova a 15.000 x g per 10 minuti a 4 ° C.
  17. Tagliare i tubi con una lama di rasoio per separare tre strati di uova tritate e tenere il citoplasma grezzo nello strato intermedio.
  18. Trasferire il citoplasma grezzo in nuove provette di ultracentrifuga e completare con inibitori della proteasi e citocalasina B a 10 µ g/mL.
  19. Centrifugare il citoplasma greggio nuovamente a 15.000 x g a 4° C per 5 minuti per purificare ulteriormente il citoplasma rimuovendo il tuorlo d'uovo e dei lipidi in eccesso.
  20. Tenere gli estratti preparati sul ghiaccio.

3. gocciolina generazione

  1. Preparazione di alloggiamento vetro 2D
    Nota: I tubi di vetro rettangolo servono come alloggiamenti che limitare le goccioline in un unico piano 2-dimensionale, consentendo una più facile osservazione e raccolta dei dati.
    1. Tagliare tubi di vetro di rettangolo con una dimensione interiore di 2 mm x 100 µm in mm 4 pezzi lunghi. Usa il bordo affilato di una pietra per affilare, segnano i confini desiderati sulla superficie esterna del tubo di vetro con incisioni di luce, quindi applicare una leggera pressione su entrambi i lati delle incisioni di rompere i pezzi di tubi di vetro.
    2. Pre-riscaldare un'incubatrice di bagno secco a 95 ° C. Estrarre il blocco riscaldante e posizionarlo in un essiccatore sotto vuoto in policarbonato.
    3. Posizionare una microcentrifuga da 1,5 mL contenente 30 µ l di silano di tricloro (1h, 1h, 2H, 2h-perfluottani) nel blocco riscaldante. Posare i tubi di vetro tagliato all'interno di un essiccatore sotto vuoto a circa 5 cm al blocco riscaldante.
    4. Collegare un essiccatore a una pompa a vuoto. Accendere la pompa per un minuto raggiungere il livello di vuoto desiderato, quindi chiudere la valvola a 3 vie per sigillare un essiccatore e lasciare che il vapore di silano tricloro (1h, 1h, 2H, 2h-perfluottani) ricoprire la parete interna dei tubi di vetro. Questo creerà un ambiente idrofobico per stabilizzare le goccioline.
    5. Lasciare le provette di vetro all'interno di un essiccatore per rivestimento durante la notte. I tubi saranno pronti per l'uso il giorno successivo.
  2. Imaging e generazione di goccia
    Nota: Le procedure di generazione di goccioline e di imaging sono illustrate nelle figure 1B e 1C.
    1. Fornire gli estratti preparati nel passaggio 2 con 10 ng / µ l securin-mCherry mRNA per gli esperimenti di ciclo cellulare semplice solo citoplasmatici. In alternativa, fornitura estratti con cromatina di demembranated sperma (250 a µ l di estratto), proteina di GFP-NLS 10 µM e 10 ng / µ l securin-mCherry mRNA per creare goccioline espositrici morfologia periodica nuclei cambia.
    2. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, mix 20 µ l di Estratto fornito con proteina ricombinante o mRNA con 200 µ l di 2% perfluoropolieteri-polietilenglicole (PFPE-PEG) fluorotensioattivo in HFE7500 fluorurato ad olio.
    3. Generare goccioline utilizzando un miscelatore vortex. La gamma di formati di goccia può essere modulata dalla durata e dalla velocità di vortice. Per creare le goccioline con raggi che vanno da 50 a 200 µm, impostare la velocità di vortice a 56 x g (3.200 giri/min con un raggio di 4,9 mm) e premere delicatamente il tubo del microcentrifuge contenenti l'estratto e la miscela di tensioattivi sul mixer per 3,5 secondi. Controllare visivamente se le gocce sono di dimensioni uniformi.
    4. Utilizzare una pipetta 20 µ l per trasferire le goccioline galleggiano sulla parte superiore e un volume uguale di tensioattivo PFPE-PEG in una provetta PCR. Immergere il tubo di vetro preparato dal passaggio nello strato gocciolina in provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e aspettare fino a quando le goccioline hanno riempito circa il 75% del tubo, quindi spingono il tubo verso il basso nello strato tensioattivo fino a quando il tubo è riempito completamente. Consente di abbassare la densità delle gocce e consentire le goccioline a formare uno strato singolo all'interno della camera senza sovrapposizioni o forma distorsione causata dal sovraffollamento.
    5. Riempire un piatto fondo di vetro con un diametro di 40 mm con olio minerale. Immergere le provette piene di goccia in olio spingendo delicatamente verso il basso utilizzando una pinzetta bene.
    6. Dopo il caricamento tutti i campioni, uso un bicchiere pipettare per rimuovere eventuali detriti visibili o trapelate di goccioline. Se i tubi non sono o non saranno completamente immersi nel processo di imaging, aggiungere altro olio minerale.
    7. Condurre la formazione immagine di goccioline su un microscopio a epifluorescenza dotato di un palco di x-y motorizzati (Vedi Tabella materiali). Utilizzare un obiettivo 4x aria per tutte le immagini. Per l'imaging di fluorescenza, utilizzare un 130 W mercurio vapor breve lampada ad arco come sorgente di luce di fluorescenza per illuminazione e di un filtro GFP impostata (eccitazione 482/35 nm ed emissione 514/LP nm) e un filtro di mCherry impostata (eccitazione 562/40 nm ed emissione 641/75 nm) per l'imaging GFP-NLS e securin-mCherry segnali.
    8. Registrare video time-lapse nel campo luminoso e più canali di fluorescenza ogni 6-9 minuti fino a quando le goccioline perdono la loro attività.

4. elaborazione e analisi dei dati di immagine

  1. Segmentazione e tracking delle goccioline
    1. Importare i dati registrati nel formato "TIF" o ".oif" nel software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali).
    2. Segmento singole goccioline utilizzando il canale di campo luminoso. L'immagine di campo luminoso vi mostrerà le goccioline come cerchi luminosi con contorni scuri. Applicare la soglia per l'immagine. Aggiungere una superficie di rilevamento ogni gocciolina sintonizzando la soglia tra i pixel scuri e luminosi, affinché ogni superficie copre l'intera area della goccia corrispondente.
    3. Automaticamente traccia i segmenti tra fotogrammi adiacenti utilizzando l'algoritmo autoregressivo del movimento. Ottimizzare la distanza di viaggio massima accettabile di una goccia tra due fotogrammi adiacenti per essere più piccolo del raggio della maggior parte delle goccioline per monitorare con precisione piccole goccioline.
    4. Controllare visivamente che tutti i brani attraverso l'intero video per rilevare segmentazioni errati quel segmento di spazio vuoto tra gocce invece di goccioline effettive. Eliminare manualmente le tracce non corrette.
    5. Segmento e traccia area di sfondo senza eventuali gocce per ottenere l'intensità di fluorescenza di fondo. Per migliorare il segnale al rumore, sottrarre intensità di sfondo dall'intensità della fluorescenza delle goccioline a ogni intervallo di tempo.
    6. Esportare parametri misurati per ciascuna traccia nel tempo, compresi i media e la deviazione standard dell'intensità di fluorescenza e la zona di goccia in file ". csv".
  2. Analisi dei dati del periodo di dimensione e oscillazione della gocciolina
    1. Caricare i file ". csv" nella R per creare trame di intensità di fluorescenza nel tempo per ogni goccia. Gocciolina record ID in un file ". csv".
    2. Importare i file ". csv" esportati dal software di analisi e il file ". csv" con un elenco di ID di gocciolina di Matlab e salvare come file "Mat" per ulteriore analisi di dati.
    3. Calcolare il volume di una goccia compresso in base alle informazioni di zona gocciolina esportato dopo la segmentazione e l'altezza del vetro camera19. Utilizzare il volume per calcolare il raggio della gocciolina come una sfera.
    4. Estrarre i punti di tempo di picchi e le depressioni utilizzando l'algoritmo di rilevamento di picco/valle. Eseguire correzioni manuali sulla posizione di picchi e le depressioni per garantire che vengono rilevati con precisione.
    5. Per calcolare il periodo di ciclo cellulare, calcolare l'intervallo di tempo tra due picchi adiacenti. Prendere la media di tutti gli intervalli per ogni goccia come il periodo del ciclo cellulare.

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Representative Results

In Figura 2, indichiamo che questo protocollo produce oscillazioni mitotiche in cellule semplici, senza nucleare così come complicate cellule con i nuclei, dove l'oscillatore spinge l'alternanza ciclica di formazione di nuclei e deformazione. Le goccioline privo di nuclei generano oscillazioni mitotiche fino a 30 cicli undamped nell'arco di tempo di 92 ore, come indicato dal periodico sintesi e degradazione di una fluorescenza reporter securin-mCherry (Figura 2A). Securin è un substrato di anaphase promuovere complesso APC/C. La degradazione di securin-mCherry durante l'anafase indica così l'attività di APC/C.

Per esaminare la capacità dell'oscillatore mitotic di guidare eventi mitotici a valle, abbiamo inoltre fornita della cromatina di sperma demembranated, segnale di localizzazione nucleare della proteina fluorescente verde purificato (GFP-NLS) e coloranti di Hoechst 33342 il citoplasmico estratti. Figura 2B Mostra autonoma alternanza di fasi di ciclo cellulare distinti, interfase (barre blu) e mitosi (barre rosse), durante il quale i cambiamenti della morfologia nucleare sono guidati dall'oscillatore mitotica autosostenuto. Tutti gli eventi mitotici, vale a dire, la decondensazione cromosoma e condensazione segnalato da Hoechst 33342 (Figura 2B, prima fila), la formazione nucleare e ripartizione di busta nucleare di GFP-NLS (Figura 2B, seconda fila) e l'attività di l'oscillatore del ciclo cellulare dalla sintesi e la degradazione di securin-mCherry (Figura 2B, terza fila), ha coinciso con l'altro. Immagini sono state raccolte utilizzando il microscopio a fluorescenza multicanale time-lapse. I nostri risultati sperimentali dimostrano che il sistema di ciclo cellulare ricostruita è capace di ricostruire un oscillatore mitotic di Cdk1 e APC/C, che può guidare una serie di eventi a valle tra cui ripartizione busta nucleare e riforma, e cambiamento di morfologia del cromosoma.

La figura 3 Mostra le oscillazioni indicate dall'intensità media di fluorescenza di securin-mCherry prima e dopo la rimozione del rumore. Picchi e le depressioni divennero più pronunciati dopo la rimozione del rumore di fondo, soprattutto per le prime due oscillazioni, che indica che rimozione del rumore può aiutare a migliorare il segnale al rumore per ulteriori analisi.

Figure 1
Figura 1. Procedura sperimentale per la generazione di cellule mitotiche basati su gocciolina. R. gli estratti citoplasmatici sono raccolti attraverso ultra-centrifugazione. B. gli estratti vengono forniti con più componenti ai fini della ricostituzione e reporting mitotiche oscillazioni. Utilizzando un metodo di Vortex, gli estratti e l'olio di tensioattivo sono mescolati per generare goccioline. C. le goccioline sono caricate in un tubo di silano-rivestito di tricloro (1h, 1h, 2 H, 2h-perfluottani) e quindi ripreso attraverso un microscopio a epifluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. La rilevazione delle dinamiche del ciclo cellulare utilizzando reporter fluorescenti. R. il corso di tempo dell'intensità di fluorescenza media securin-mCherry della goccia selezionata, che indica 30 undamped oscillazioni sopra un corso di 92 ore. Inserire figura mostra l'immagine di fluorescenza con la gocciolina selezionata incorniciata da bianco cerchio tratteggiato. La barra della scala è 100 µm. B. Serie di istantanee di una gocciolina in fluorescenza canali (le prime tre righe) e campo luminoso (ultima riga). La progressione ciclica dell'orologio del ciclo cellulare e dei suoi processi mitotici a valle vengono registrate simultaneamente dal reporter fluorescenti più. L'anafase substrato securin-mCherry indica l'attività del regolatore dell'orologio APC/C, la macchia di Hoescht indica i cambiamenti di morfologia cromosomica e la GFP-NLS indica riforme e involucro nucleare guasti. Buste di nucleare (evidenziati da frecce bianche) sono anche rilevabili nelle immagini campo luminoso, la localizzazione di GFP-NLS di corrispondenza indicato i nuclei. La barra della scala è 50 µm. interfase e fase mitotica sono indicati rispettivamente dalle barre blu e barre rosse sopra le immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Sfondo di sottrazione per l'intensità media di fluorescenza di securin-mCherry. R. il corso di tempo di oscillazione prima di rimozione del rumore di fondo. B. il corso di tempo di oscillazione dopo rimozione del rumore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo presentato un nuovo metodo per lo sviluppo di un sistema di alto-rendimento cellula artificiale che consente in vitro ricostituzione e il monitoraggio a lungo termine delle oscillazioni di ciclo cellulare auto-sostenuta a livello di singola cellula. Ci sono diversi passaggi critici che rendono questo metodo successo. Uova di Xenopus in primo luogo, appena spremute con una buona qualità, rispetto alle uova deposte, tendono a produrre estratti con attività di più lunga durata di oscillazione. In secondo luogo, incapsulamento degli estratti all'interno i microambienti tensioattivo-stabilizzato è fondamentale per preservare l'attività di oscillazione. Terzo, incubazione delle goccioline di olio in un tubo sottile confini le goccioline all'interno di un singolo strato, rendendo più facile per elaborazione di immagini e monitoraggio a lungo termine. In quarto luogo, rivestimento parete interna del tubo con tricloro (1h, 1h, 2H, 2h-perfluottani) silano come anti-adesivo per abbassare l'energia superficiale aiuta a preservare l'attività di estratto. In quinto luogo, la sigillatura dei tubi con olio impedirebbe flusso goccia. Il metodo di sigillatura-olio può anche prevenire l'evaporazione e preservare ulteriormente l'attività di estratto. Questi insieme migliorare il tasso di successo della ricostruzione in vitro di robuste oscillazioni nelle goccioline e la precisione di segmentazione e rilevamento di queste gocce in un lungo termine.

Per generare goccioline microemulsione, abbiamo impiegato sia un metodo di semplice uso del Vortex, simile a pochi altri studi29,30,31, così come il più comunemente usato microfluidica tecniche19, 20 (dati non mostrati). Entrambi i metodi sono stati in grado di generare correttamente microemulsioni in un modo ad alta velocità. Una limitazione associata al metodo Vortex è che la dimensione delle gocce non è controllata in modo uniforme. Per gli studi che richiedono una dimensione ben definita con variazione di dimensione ridotta a icona, microfluidica tecniche devono essere utilizzate per un migliore controllo delle dimensioni delle gocce. Qui, abbiamo scelto il metodo di Vortex sopra il metodo di microfluidica per due motivi. In primo luogo, ha procedure semplici e facili da seguire, che consentirebbero laboratori senza avere accesso alle tecniche di microfluidica o nanofabbricazione di adattare questo metodo facilmente. In secondo luogo, il metodo Vortex è più efficiente ed economico per indagare i comportamenti dipendente dalla dimensione dell'oscillatore. Può generare una vasta distribuzione delle dimensioni delle gocce con raggi variabili da parecchi micrometri fino a 300 micrometri, mentre la tecnica di microfluidica può generare solo una stretta distribuzione centrata su una dimensione predefinita. L'intervallo di dimensioni gocciolina generato con questo metodo corrisponde l'ampia gamma di formati di cella risultanti dalle divisioni caratteristiche riduttive delle cellule in fase di clivaggio di embrioni in anticipo come Xenopus e zebrafish.

Il presente metodo ha migliorato significativamente la sostenibilità delle oscillazioni e la velocità effettiva di analizzare le dinamiche complesse orologio, confrontato con i metodi esistenti di ricostituire oscillatori biologici in massa amalgamata soluzione8, 32, che tendono a produrre rapidamente smorzato le oscillazioni. Abbiamo dimostrato che questo metodo ha migliorato significativamente la durata della vita delle oscillazioni da pochi cicli in massa reazione8 a oltre 30 cicli nel microambiente di goccioline (Figura 2A). Inoltre, le reazioni alla rinfusa mancano la somiglianza con le dimensioni di cella effettivo e non possono ricapitolare l'organizzazione spaziale raggiunto di compartimentalizzazione funzionali in cellule vere. Dopo aver superato queste limitazioni delle reazioni di massa, il nostro sistema di cellula artificiale fornisce una piattaforma essenziale per indagare domande impegnative quali l'eterogeneità cellulare e la variabilità stocastica di oscillatori, che sono altrimenti impossibili da Esplorate.

Inoltre, questo metodo fornisce la flessibilità nel grado di complessità a cui le cellule possono essere costruite. Per evitare qualsiasi interferenza dalle complicate dinamiche nucleare, noi possiamo ricostituire un sistema minimale, solo citoplasmatica delle cellule-ciclo che non contiene nuclei. Questo oscillatore semplice e sola citoplasmico esibisce autosostenute oscillazioni significativamente migliore di alcuni oscillatori sintetiche esistenti. Fornendo della cromatina degli spermatozoi, noi possiamo anche ricostituire cellule più complesse con i nuclei che si alternano tra auto-assemblaggio presso interfase e deformazione nucleare nella fase mitotica in modo ritmico. L'attività di mitotic oscillatore, nonché gli eventi nucleari a valle può essere simultanea misurata dalla fluorescenza multicanale e rilevamento delle singole cellule.

Il metodo consente inoltre un elevato grado di manipolazione in velocità di gocciolina dimensioni e ciclo cellulare. La tecnica di Vortex permette per la generazione di goccioline con raggi in una vasta gamma, che saranno apprezzati lo studio della dimensione della cella dipendente da comportamenti dei cicli cellulari. Inoltre, la velocità di ciclo cellulare può essere modulata fornendo diverse concentrazioni di cyclin B1 mRNAs33, che ci permetterebbe di studiare la funzione accordabilità dell'orologio ciclo cellulare.

Con questi vantaggi, la in vitro ricostruito ciclo cellulare piattaforma, consentendo la visualizzazione, la manipolazione e analisi delle dinamiche di singola cellula, probabilmente spianerà la strada per nuove intuizioni riguardanti i comportamenti stocastici più complicati della cella ciclo di clock. Il metodo può anche essere generalizzabile agli studi in vitro di altri oscillatori che tradizionalmente si basano sulle reazioni di massa.

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Disclosures

Non abbiamo nulla di divulgare.

Acknowledgments

Ringraziamo Madeleine Lu per la costruzione del plasmide securin-mCherry, Lap Man Lee, Kenneth Ho e Allen P Liu per una discussione sulla generazione della gocciolina, Jeremy B. Chang e James E. Ferrell Jr per la fornitura di CHE GFP-NLS costruire. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (inizio carriera Grant n. 1553031), il National Institutes of Health (MIRA #GM119688) e un assegno di ricerca di Sloan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

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References

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