Summary
本文提出了在油中微乳液中对爪蟾卵提取物进行单细胞水平的体外自持续有丝分裂振荡的生成方法。
Abstract
实时测量单细胞水平的振荡, 对于揭示生物钟的机理具有重要意义。虽然从爪蟾卵制备的大块提取物在细胞周期发展的基础上解剖生物化学网络中具有强大的功能, 但它们的整体平均测量通常会导致阻尼振荡, 尽管每个单个振荡器被持续。这是由于噪声生物系统中单个振荡器之间的完美同步的困难。为了检索振荡器的单细胞动力学, 我们开发了一个以液滴为基础的人工细胞系统, 它能在细胞状腔内重组爪蟾卵的循环细胞质提取物的有丝分裂周期。这些简单的胞浆细胞表现出30多个周期的持续振荡。为了构建更复杂的细胞核细胞, 我们添加了 demembranated 精子染色质, 以触发系统中的核自组装。我们观察到染色体凝结/decondensation 和细胞核包络破裂/改革的周期性进展, 就像在真实细胞中。这表明有丝分裂振荡器的功能忠实地推动多个下游有丝分裂事件。利用多通道时程荧光显微镜, 我们同时跟踪了单个液滴的有丝分裂振荡器和下游过程的动力学。人工细胞周期系统提供了一个高通量的框架, 用于定量操作和分析单细胞分辨率的有丝分裂振荡, 这可能提供了重要的洞察力的调节机制和功能时钟。
Introduction
由爪蟾卵制备的细胞质提取物是细胞周期生化研究中最主要的模型之一, 考虑到卵母细胞的体积大、细胞周期的快速发展以及重组的能力。体外有丝分裂事件1,2。该系统允许初步发现和机械特性的关键细胞周期调节器, 如成熟促进因子 (MPF) 以及下游有丝分裂过程, 包括主轴组装和染色体分离1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11。爪蟾卵提取物也被用来详细解剖细胞周期时钟8,12,13,14的调节网络和 DNA 损伤的研究/复制检查点15和有丝分裂主轴组件检查点 16、17、18。
这些研究的细胞周期使用爪蟾卵提取物主要是基于散装测量。然而, 常规的散装反应化验可能不会模仿真实的细胞行为, 因为它们的维度和亚细胞空间划分的反应分子的主要差异。此外, 在快速阻尼8之前, 对有丝分裂活动的大量测量往往会给出有限的周期数。大量反应的缺点使萃取系统无法进一步了解复杂时钟的动态特性和功能。最近的研究已经封装了无细胞 cytostatic 因子 (CSF)爪蟾提取物 19,20到大小定义的细胞样车厢, 这有助于阐明如何调整主轴尺寸细胞质容积。然而, 这种体外系统是在减数分裂的中期被逮捕的 cytostatic 因子1的作用, 一个能够长期持续振荡的单细胞水平, 以进一步调查细胞周期振荡 器。
为了研究细胞周期振荡的单细胞分辨率, 我们开发了一个细胞规模, 高通量系统的重建和同时测量多个自持续有丝分裂振荡过程中的个别微乳液液 滴。在详细的视频协议中, 我们演示了在10到300µm 的微乳液中封装循环爪蟾卵胞浆的人工有丝分裂振荡系统的建立。在该系统中, 有丝分裂振荡包括染色体凝结和脱凝、核包络击穿和改造, 以及后期基质的降解和合成 (如本协议中的 securin mCherry) 是成功重组。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了密歇根大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。
1. 细胞周期重建和检测材料的制备
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securin-mCherry 质粒 DNA 构建及 mRNA 纯化的吉布森组装克隆
- 通过聚合酶链反应 (PCR) 和凝胶纯化21,22, 制备三个 DNA 片段, 包括 pMTB2 向量主干、securin 和 mCherry。
- 使用 fluorospectrometer 测量碎片的浓度。将100吴骨干与 securin 和 mCherry 插入 1:1: 1 分子比, 加入去离子水, 将反应总容积调整为5µL。
- 准备6毫升的5x 等温组装反应缓冲器与3毫升1米三盐酸 (pH 7.5), 300 µL 1 米氯化镁2, 600 µL 10 毫米 dNTP, 300 µL 的1米, 1.5 克 PEG-8000, 20 毫克的 NAD23。
- 将组合片段添加到15µL 的1x 等温装配反应缓冲整除。在50摄氏度的 PCR 反应管中孵育反应15分钟。
- 制作0.8% 琼脂糖凝胶, 并以10伏/厘米的电压运行, 以验证这些碎片的退火效率。
- 用15µL 的无 RNase 水净化所构建的质粒和洗脱。将纯化质粒 DNA 的1µL 转化为50µL DH5α大肠杆菌细胞24 , 供将来使用。
- 从 DH5α大肠杆菌细胞中提取纯化 securin mCherry 质粒 DNA。
- 将线性化的 securin mCherry 质粒 DNA 转录成 mrna, 纯化 mrna。使用分光光度法验证 mRNA 浓度大于100µL, 吸收率在 260 nm 和 280 nm 之间的比值约为2.0。
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demembranated爪蟾精子 DNA 的制备
注: 自默里 19911改编。- 弄死成年雄性爪蟾25和解剖睾丸从四只雄性青蛙26,27。
- 放置睾丸从四只青蛙在同一100毫升培养皿。在50毫升的冷 1x MMR 溶液中漂洗睾丸三次 (0.1 米氯化钠, 2 毫米氯化钾, 1 毫米氯化镁2, 2 毫米 CaCl2, 5 毫米 HEPES, 0.1 毫米 EDTA)。
- 从睾丸的100毫升培养皿中取出多余的血液和脂肪, 然后在冷核制备缓冲器 (NPB) (250 毫米蔗糖, 15 毫米 HEPES, ph 7.4, 1 毫米 EDTA, ph 8.0, 0.5 毫米胺三盐酸盐, 0.2 毫米胺 tetrahydrochloride) 中清洗两次。
- 取出核准备缓冲器 (NPB), 并将睾丸切成小于0.2 厘米的小块, 用100毫升培养皿中的锋利解剖剪刀。在睾丸中加入8毫升的冷 NPB, 以进一步分解。
- 使用70µm 孔径的尼龙网眼织物过滤睾丸, 并将精子样本收集到15毫升圆锥管中。将收集到的精子在 1730 x g 处向下旋转10分钟, 4 摄氏度, 取出上清。
- 提供精子细胞与1毫升的 NPB 和50µL 10 毫克/毫升溶血磷脂制备和孵化在室温下5分钟 demembranate 精子细胞。
- 用10毫升冷 NPB 和 3% BSA 溶液清洗 demembranated 精子 DNA 三次。
- 用 hemocytometer 测量精子 DNA 的密度。
- 冷冻的精子 DNA 在5µL 整除数在液氮和存储在-80 摄氏度。精子 DNA 的最佳浓度约为105核/µL。
-
gfp 的蛋白质纯化-核定位信号 (gfp-NLS)
- 将 GST 标记的 GFP-NLS 质粒转化为 BL21 (DE3) 能力的大肠杆菌细胞5。
- 将无抗生素的细胞孵育为1小时, 然后在一个 LB 琼脂糖盘上µg 100 毫升氨苄西林。
- 将该板块孵育37摄氏度, 14 至18小时, 将细胞培养成单一的菌落。用100µg/毫升氨苄西林, 在4毫升的 LB 培养基中选择和接种单个菌落。将细胞以摄氏37度抖动12小时。
- 制备蒸压的 Bacto 介质 (16 克胰蛋白胨, 10 克 Bacto 酵母萃取物, 5 克氯化钠), 加热到37摄氏度。
- 将1毫升的隔夜孵化细胞接种到 LB 培养基中, 放入250毫升预热的 YT 培养基, 100 µg/毫升氨苄西林, 摇动2小时以增加细胞密度。
- 每30分钟测量细胞光学密度 (OD), 用 600 nm 波长的分光光度计。当 OD 值达到0.1 时, 在细胞中加入0.1 毫米 IPTG, 诱导 GFP-NLS 蛋白表达。
- 将细胞在18°c 过夜, 以降低细胞生长速率, 并允许更好的蛋白质表达和合成。
- 向下旋转 34524 x g 的细胞在4°c 5 分钟, 并删除上清。
- 并用重悬40毫升的 PBS 缓冲器中的细胞颗粒 (提供800µL 50 毫克/毫升溶菌酶, 100 µL 0.2 米 PMSF, 13.2 µL 10 毫克/毫升混合 leupeptin, pepstatin 和 chymostatin, 8 µL 0.5 米 EDTA) 和孵化在4°c 20 分钟。
- 使用 sonicator 在20赫的频率上分解细胞 4 x 三十年代, 每个超声波之间有三十年代间隔, 以释放表达的 GFP-NLS 蛋白。
- 旋转 2万 x g 35 分钟, 以消除破碎的细胞。
- 采用亲和层析法提取纯化 GFP-NLS 蛋白。
- 洗涤1.5 毫升珠浆三倍与15毫升 PBS 缓冲和孵化250毫升的裂解与珠4小时在4°c 与反演。
- 将珠子向下旋转 2000 x 克, 5 分钟, 并加入10毫升的洗涤液 (25 毫米三基, pH 7.5, 500 毫米氯化钠, 和5毫米的数字) 到珠子。孵化珠在700µL 洗脱缓冲 (50 毫米三 HCl, pH 8.8, 20 毫米减少谷胱甘肽和5毫米的, 以旋转为4°c)。收集整除的洗脱量, 体积为50µL。
- 通过运行考马斯蓝凝胶28测定收集蛋白质的浓度。
- 洗脱蛋白质使用 PD-10 柱与3毫升存储缓冲 (20 毫米 HEPES, 150 毫米氯化钾, 10% 甘油, pH 7.7) 通过缓冲交换。
2. 循环爪蟾提取物的制备
注: 制备提取物的总过程如图 1A所示。改编自默里 19911。
- 在产卵前10天注射三只成熟的雌性爪蟾与66的孕母马血清促性腺激素 (PMSG)。
- 注射这些爪哇青蛙与500的人类绒毛膜促性腺激素 (HCG), 以诱导产卵18小时之前, 准备循环提取物。
- 放弃产卵过夜。根据实验 (没有显示的数据), 从刚榨出来的卵中提取出来的萃取物比从同一只雌蛙产卵的提取物产生更持久的活性。将每只雌蛙的卵挤压成100毫米培养皿, 其中含有10毫升0.2x 的 MMR 缓冲液, 并在立体显微镜下进行检查。
- 丢弃在动物和植物两极之间有不明确界限的鸡蛋批次, 或者在动物两极顶端有不规则的白点。
- 从一只雌蛙中选择一组卵, 呈现出同质的卵, 有明显差异的动物和植物两极, 并将卵转移到600毫升烧杯中。
- 倒出过量的 0.2x MMR 缓冲器, 并轻轻地添加250毫升2克每100毫升半胱氨酸 (pH 7.7) 在1x 萃取缓冲 (100 毫米氯化钾, 0.1 毫米 CaCl2, 1 毫米氯化镁2, 10 毫米 HEPES, 50 毫米蔗糖, pH 7.7) 到鸡蛋。
- 用手用力摇动鸡蛋, 将鸡蛋的果冻大衣除去三洗净, 总容积为800毫升半胱氨酸缓冲液3分钟, 或直到鸡蛋聚集并沉淀在烧杯底部, 表明去除果冻大衣是成功的。
- 用1升0.2x 的 MMR 溶液洗蛋四次以上。
- 用玻璃转移吸管摘下白色的鸡蛋。
- 在0.2x 的 mmr 缓冲液中倒入200毫升0.1 µg 钙载体 A23187 溶液, 以激活 mmr 缓冲液并提供卵。
- 使用玻璃吸管的宽开口面, 轻轻搅拌鸡蛋, 直到鸡蛋被激活, 并去除钙载体溶液。
- 检查的活化效率后, 鸡蛋安顿下来的烧杯底部。良好活化的卵有大约25% 的动物极和75% 的植物极。
- 用50毫升的1x 萃取缓冲液, 用蛋白酶抑制剂 (每 leupeptin、pepstatin 和 chymostatin 的10µg/毫升) 清洗活化卵两次。
- 小心地将卵转移到一个0.4 毫升的微细, 然后用 200 x g 的离心时间将卵装入60秒, 然后 600 x g 30 秒。
- 使用玻璃巴斯德吸管去除鸡蛋顶部的额外缓冲器, 以减少提取物的稀释。
- 在4摄氏度的10分钟内压碎 1.5万 x g 的卵。
- 用刀片切开管子, 将三层破碎的卵分开, 并保持中间层的粗细胞质。
- 将粗细胞质转移到新的 ultracentrifuge 管中, 并补充蛋白酶抑制剂和细胞松弛素 B 在10µg/毫升。
- 在 4° C 1.5万 x g 处再离心再用5分钟, 去除多余的脂质和蛋黄, 进一步净化细胞质。
- 在冰上保存新鲜的提取物。
3. 水滴生成
-
2D 玻璃室准备
注: 矩形玻璃管作为室, 在一个单一的2维平面上限制水滴, 便于观察和数据收集。- 切割矩形玻璃管的内部尺寸为2毫米 x 100 µm 成4毫米长片。使用怀斯顿的锋利边缘, 用轻蚀刻标记玻璃管外表面所需的边界, 然后轻轻地在蚀刻的两边施加压力, 以打破玻璃管的碎片。
- 预热干燥浴孵化器到95°c。取出加热块, 放入聚碳酸酯真空干燥。
- 在加热块中放置1.5 毫升离心管, 其中含有30µL 的氯 (1 h、1 h、2 h、2 h perfluorooctyl) 硅烷。在真空干燥内放置切割玻璃管, 在大约5厘米至加热块处。
- 将干燥连接到真空泵。打开泵1分钟达到所需的真空水平, 然后关闭3路阀门密封干燥, 让氯 (1 小时, 1 小时, 2 h, 2 h perfluorooctyl) 硅烷蒸气涂层的玻璃管的内壁。这将为稳定水滴创造一个疏水环境。
- 将玻璃管留在干燥内过夜涂装。这些管子将在第二天准备好使用。
-
水滴生成和成像
注: 生成水滴和成像的过程如图1B 和1C 所示。- 在步骤2中, 以10µL securin-mCherry mRNA 为单纯胞浆细胞周期实验制备的供应提取物。另外, 供应提取物与 demembranated 精子染色质 (250 每µL 提取物), 10 µM GFP-NLS 蛋白, 10 ng/µL securin mCherry mRNA, 以创造液滴呈现周期性细胞核形态学变化。
- 在一个1.5 毫升的离心管, 混合20µL 提取物提供的重组蛋白或 mRNA 与200µL 2% perfluoropolyether 聚乙二醇 (PFPE PEG) fluorosurfactant 在 HFE7500 氟油。
- 使用涡旋混合器生成水滴。雾滴大小的范围可以通过涡速度和持续时间来调制。要创建半径范围从50到200µm 的水滴, 将涡流速度设为 56 x g (3200 rpm, 半径为4.9 毫米), 然后轻轻按下包含萃取剂和表面活性剂混合物的离心管3.5 秒。目视检查水滴是否大小一致。
- 使用20µL 吸管将漂浮在顶部的水滴和等量的 PFPE 表面活性剂转移到 PCR 管中。将玻璃管从一步进1.5 毫升离心管中的液滴层中浸出, 等到水滴填满大约75% 的管子, 然后将管子向下推入表面活性剂层, 直到管子完全填满为止。这将降低水滴密度, 并允许水滴形成一个单一的层内的房间内没有重叠或形状扭曲造成的过度拥挤。
- 用矿物油填充一个直径为40毫米的玻璃底盘。用细镊子将液滴填充的管子浸入油中。
- 装好所有样品后, 用玻璃吸管除去任何可见的碎片或泄漏的水滴。添加更多的矿物油, 如果管不是或不会完全沉浸在成像过程中。
- 在荧光显微镜上进行液滴成像 (见材料表)。为所有成像使用4X 空气目标。对于荧光成像, 使用 130 W 汞蒸气短弧灯作为荧光光源照明, 和 GFP 过滤器集 (励磁 482/35 nm 和发射 514/LP 纳米) 和一个 mCherry 过滤器集 (激发 562/40 nm 和发射 641/75 nm) 的成像GFP-NLS 和 securin-mCherry 信号。
- 记录在明亮的领域和多个荧光通道的时间推移视频每6到9分钟, 直到水滴失去他们的活动。
4. 图像处理和数据分析
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水滴的分割与跟踪
- 将记录的数据以 ". tif" 或 ". 法语国家" 的格式导入图像分析软件 (见材料表)。
- 用明亮的田野通道分割单滴。明亮的田野图像会显示水滴为明亮的圆圈与黑暗的边界。将阈值应用于图像。通过调整深色和明亮像素之间的阈值, 将跟踪曲面添加到每个水滴, 使每个曲面覆盖相应水滴的整个区域。
- 使用自回归运动算法自动跟踪相邻帧之间的线段。调整两个相邻帧之间的水滴可接受的最大行程距离, 使其小于大多数水滴的半径, 从而准确地跟踪小水滴。
- 通过视觉检查整个视频中的所有曲目, 以检测不正确的分割, 从而分割出水滴之间的空空间而不是实际的水滴。手动删除不正确的曲目。
- 分割和跟踪背景区域没有任何水滴获得背景荧光强度。为了提高信号的噪声, 减去背景强度的荧光强度的水滴在每个时间框架。
- 导出每条轨道的测量参数, 包括荧光强度和雾滴区域到 ". csv" 文件的平均值和标准偏差。
-
液滴尺寸和振荡周期的数据分析
- 将 ". csv" 文件加载到 R 中, 以创建每次水滴的荧光强度图。将水滴 ID 记录到 ". csv" 文件中。
- 将从分析软件和 ". csv" 文件导出的 ". csv" 文件导入到 Matlab 中, 并保存为 ". 垫" 文件以进行进一步的数据分析。
- 根据分段后出口的雾滴面积信息和玻璃腔19的高度计算压缩液滴的体积。使用体积计算水滴的半径作为球体。
- 利用峰/槽检测算法提取峰、槽的时间点。对峰和槽的位置进行手动校正, 以确保准确检测到它们。
- 计算单元周期, 计算两个相邻峰之间的间隔时间。取每个液滴的平均间隔为其细胞周期。
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Representative Results
在图 2中, 我们表明该协议在简单的无核细胞和复杂的细胞核中产生有丝分裂振荡, 振荡器驱动原子核形成和变形的循环交替。无核的水滴产生的有丝分裂振荡高达30无阻尼吸循环超过92小时的时间跨度, 这表明由周期性合成和退化的荧光记者 securin-mCherry (图 2A)。Securin 是后期促进复合 APC/C 的基底。securin-mCherry 在后期的降解从而表明 APC 的活性。
为了检验有丝分裂振荡器驱动下游有丝分裂事件的能力, 我们还提供了 demembranated 精子染色质, 纯化的绿色荧光蛋白-核定位信号 (GFP), 赫斯特33342染料的细胞质提取 物。图 2B显示了不同细胞周期相、界面 (蓝条) 和有丝分裂 (红条) 的自主交替, 核形态的变化由自持续有丝分裂振荡器驱动。所有有丝分裂事件,即赫斯特33342报告的染色体 decondensation 和冷凝 (图 2B, 第一排), 核形成和核包络击穿由 GFP-NLS (图 2B, 第二行) 和活动细胞周期振荡器的合成和降解 securin-mCherry (图 2B, 第三行), 彼此重合。利用时间推移多通道荧光显微镜采集图像。实验结果表明, 重建后的细胞周期系统能够重建 Cdk1 和 APC 的有丝分裂振荡器, 可以驱动一系列的下游事件, 包括核包络击穿和改造, 并染色体形态学改变。
图 3显示了噪声去除前后 securin-mCherry 的平均荧光强度所指示的振荡。在去除背景噪声后, 峰值和低谷变得更加明显, 特别是在前两个振荡中, 这表明去除噪声可以帮助提高信号的噪声, 进一步分析。
图1。生成滴基有丝分裂细胞的实验方法.细胞质提取物通过超离心收集。B.提取物提供多个成分, 以便重组和报告有丝分裂振荡。利用涡流方法, 提取物和表面活性剂油混合产生水滴。水滴被装入一个氯 (1 小时, 1 小时, 2 小时, 2 perfluorooctyl) 硅烷涂层管, 然后通过一个 epi 荧光显微镜成像。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。用荧光记者检测细胞周期动力学.a.所选液滴的平均 securin-mCherry 荧光强度的时间过程, 表明30无阻尼吸振荡在92小时的过程中。插入图显示的荧光图像与选定的水滴帧的白色虚线圆圈。刻度条为100µm. 在荧光通道 (前三行) 和明亮字段 (最后一行) 中滴的快照的时间序列。多个荧光记者同时跟踪细胞周期时钟及其下游有丝分裂过程的循环进展。后期基质 securin-mCherry 表明时钟调节器的活动, Hoescht 染色表明染色体形态学改变, GFP-NLS 表明核包络故障和改革。核信封 (由白色箭头突出显示) 也可在明亮的现场图像中检测到, 与 GFP-NLS 表示的细胞核的定位相匹配。刻度条为50µm. 在图像上方的蓝色条和红色条分别表示界面和有丝分裂阶段。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。securin-mCherry 平均荧光强度的背景减法.背景噪声去除前的振荡时间过程。B.噪声去除后的振荡时间过程。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
我们提出了一种新的方法来开发一个高通量人工细胞系统, 使体外重建和长期跟踪自我持续的细胞周期振荡的单细胞水平。有几个关键步骤使此方法成功。首先, 与下蛋相比, 新鲜挤压的爪蛋具有良好的品质, 往往会产生具有更持久振荡活性的萃取物。其次, 在表面活性剂稳定的微环境中, 萃取物的封装对于保持振荡活性至关重要。第三, 将油滴孵化成一根薄薄的管子, 将水滴限制在一层内, 使图像处理和长期跟踪更容易。第四、用氯 (1 h、1 h、2 h、2 perfluorooctyl) 硅烷作为防粘剂, 将管内壁涂敷, 以降低表面能量, 有助于保持萃取活性。第五、用油封管, 防止液滴流动。油封法还可以防止蒸发, 进一步保持萃取活性。这些方法共同提高了液滴鲁棒振荡的体外重建成功率, 并在长期内对这些液滴进行了分割和跟踪的准确性。
为了产生微乳液滴, 我们使用了一个简单的涡流方法, 类似于其他一些研究29,30,31, 以及更普遍使用的微流体技术19,20 (未显示数据)。这两种方法都能以高通量的方式成功地生成微乳液。与涡流方法相关的一个限制是, 液滴大小不是均匀控制的。对于需要定义尺寸大小与最小尺寸变化的研究, 微流体技术应用于更好地控制雾滴尺寸。在这里, 我们选择了涡流方法的微流控方法有两个原因。首先, 它有简单和易于遵循的程序, 这将允许实验室没有接触微流控技术或纳米加工设施, 以适应这种方法容易。其次, 涡流方法对于研究振荡器的尺寸依赖性行为具有更高的效率和经济性。它可以产生大的雾滴大小分布, 半径从几微米到300微米不等, 而微流控技术只能产生一个以预定大小为中心的窄分布。这种方法生成的雾滴大小的范围与早期胚胎如爪蟾和斑马鱼的卵裂阶段的特征还原细胞分裂所产生的细胞大小范围很大。
与现有的混合式散装液8中生物振荡器的重建方法相比, 本方法大大提高了振荡的可持续性和分析复杂时钟动力学的吞吐量, 32, 往往产生快速阻尼振荡。我们已经表明, 这种方法大大提高了振荡的寿命从几个周期的体积反应8到超过30周期的微环境的水滴 (图 2A)。此外, 大块反应缺乏与实际细胞维度的相似性, 不能重述实细胞功能划分所实现的空间组织。在克服了大量反应的这些局限性之后, 我们的人工细胞系统为研究诸如细胞异质性和振荡器的随机性等挑战性问题提供了必要的平台, 否则不可能探讨。
此外, 此方法提供了可在多大程度上构建单元格的灵活性。为了避免对复杂核动力学的任何干扰, 我们可以重建一个最小的胞质细胞周期系统, 其中不包含原子核。这种简单的和细胞质唯一的振荡器表现出自持续振荡明显优于一些现有的合成振荡器。通过提供精子染色质, 我们也可以重建更复杂的细胞与细胞核, 交替之间的自组装之间的相互关系, 在有丝分裂阶段的核形变, 以韵律的方式。通过多通道荧光成像和单细胞跟踪, 可以同时测量有丝分裂振荡器的活性以及下游核事件。
该方法还能使液滴大小和细胞周期速度的高度操作。涡流技术允许在大范围内产生半径的水滴, 这将有利于研究细胞周期的细胞大小依赖性行为。此外, 细胞周期速度可以通过提供不同浓度的周期蛋白 B1 基因33, 这将使我们研究细胞周期时钟的调谐功能。
有了这些优势,体外重建细胞周期平台, 使可视化, 操作, 和分析单细胞动力学, 可能会为新的洞察到更复杂的细胞随机行为铺平道路循环时钟。该方法也可以推广其他振荡器的体外研究, 传统上依赖于大体积反应。
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Disclosures
我们没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢玛德琳路建设 securin-mCherry 质粒, 圈人李, 肯尼斯和艾伦 P 刘讨论关于水滴生成, 杰里米 b. 张和詹姆斯 e. 费雷尔 Jr 提供 GFP-NLS 结构。这项工作得到了国家科学基金会 (早期职业补助金 #1553031)、国立卫生研究院 (米拉 #GM119688) 和斯隆研究金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher (Ambion) | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
References
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