Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rekonstituering af cellecyklus svingninger i Microemulsions af celle-fri Xenopus æg uddrag

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Vi præsenterer en metode for generation af in vitro- selvbærende mitotiske svingninger på én celle niveau af indkapsling æg ekstrakter af Xenopus laevis i vand-i-olie microemulsions.

Abstract

Real-time målinger af svingninger på én celle-niveau er vigtig at afdække mekanismer i biologiske ure. Selv om bulk ekstrakter forberedt fra Xenopus laevis æg har været magtfulde i dissekere biokemiske netværk bag cellecyklus progression, fører deres ensemble gennemsnit måling typisk til en dæmpet svingning, trods hver enkelte oscillator opretholdes. Dette er på grund af vanskeligheden ved perfekt synkronisering mellem individuelle oscillatorer i støjende biologiske systemer. For at hente den encellede dynamics af oscillatoren, udviklede vi en droplet-baserede kunstige celle system, der kan rekonstruere mitotiske cyklusser i celle-lignende rum indkapsling cykling cytoplasmatisk ekstrakter af Xenopus laevis æg. Disse enkle cytoplasmatisk-kun celler udviser vedvarende svingninger til over 30 cykler. For at bygge mere komplicerede celler med kerner, tilføjet vi demembranated sperm kromatin for at udløse kerner samlesæt i systemet. Vi observerede en periodisk progression af kromosom kondens/decondensation og kerner indhylle opdeling/reformation, ligesom i rigtige celler. Dette indikerer, at den mitotiske oscillator fungerer loyalt for at drive flere downstream mitotiske begivenheder. Vi spores samtidig dynamikken i den mitotiske oscillator og downstream processer i enkelte dråber ved hjælp af multi-kanal time-lapse Fluorescens mikroskopi. Kunstige cellecyklus system giver en høj overførselshastighed ramme for kvantitative manipulation og analyse af mitotiske svingninger med enkelt-celle opløsning, som sandsynligvis giver vigtig indsigt i de lovgivningsmæssige maskiner og funktioner i uret.

Introduction

Cytoplasmatisk ekstrakter forberedt fra Xenopus laevis æg repræsenterer en af de mest fremherskende modeller for biokemiske studier af celle cyklusser, givet den store mængde af oocytter, hurtig cellecyklus progression og evnen til at retablere mitotiske begivenheder in vitro-1,2. Dette system har tilladt første opdagelse og mekanistiske karakterisering af væsentlige cellecyklus lovgivere som fremme af modning faktor (MPF) samt downstream mitotiske processer herunder spindel forsamling og kromosom adskillelse1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus æg ekstrakter har også været brugt til detaljerede dissektion af de regulerende net af cellecyklus ur8,12,13,14 og for studier af DNA-skader /Replication checkpoint15 og mitotiske spindel forsamling checkpoint16,17,18.

Disse undersøgelser af celle cyklusser ved hjælp af Xenopus æg ekstrakter har primært været baseret på bulk målinger. Konventionelle bulk reaktion assays kan dog ikke efterligne virkelige celle adfærd, givet en større afvigelse i deres dimensioner og subcellulært rumlig opdeling af reaktion molekyler. Derudover er bulk målinger af mitotiske aktiviteter tilbøjelige til at give et begrænset antal cyklusser før hurtigt dæmpning8. Disse ulemper af bulk reaktioner har forhindret ekstrakt system for at give yderligere forståelse af komplekse ur dynamiske egenskaber og funktioner. Nylige undersøgelser har indkapslet celle-fri cytostatiske faktor-anholdt (CSF) Xenopus ekstrakter19,20 i størrelse-defineret celle-lignende rum, som har bidraget til at belyse hvordan spindel størrelse moduleres af den cytoplasmatisk volumen. Men denne i vitro system er anholdt på metafase af meiose II ved hjælp af cytostatiske faktor1, og et system i stand til at langsigtede vedvarende svingninger på én celle-plan er behov for yderligere undersøgelser af cellecyklus oscillator.

For at studere cellecyklus svingninger med enkelt-celle opløsning, har vi udviklet en celle-skala, høj overførselshastighed system til rekonstitution og samtidig måling af flere selvbærende mitotiske oscillerende processer i individuelle microemulsion dråber. I denne detaljerede video protokol viser vi skabelsen af kunstige mitotiske oscillation system af indkapsling cykling Xenopus laevis æg cytoplasma i microemulsions af størrelser spænder fra 10 til 300 µm. I dette system blev mitotiske svingninger herunder kromosom kondens og nedtrapning kondens, nukleare kuvert opdeling og reformationen, og nedbrydning og syntese af anaphase substrater (f.eks. securin mCherry i denne protokol) med held rekonstitueres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Michigan.

1. forberedelse af materialer til cellecyklus rekonstitution og påvisning

  1. Gibson forsamling kloning til plasmid DNA konstruktion og mRNA rensning af securin-mCherry
    1. Forberede tre DNA fragmenter herunder pMTB2 vektor rygraden, securin og mCherry gennem Polymerasekædereaktionen (PCR) og gel rensning21,22.
    2. Bestemmelse af koncentrationen af fragmenter ved hjælp af en fluorospectrometer. Kombinere 100 ng af rygbenet med securin og mCherry skær på en 1:1:1 molekylære forholdet og der tilsættes deioniseret vand for at justere det samlede volumen af reaktion på 5 µL.
    3. Forbered 6 mL af 5 x isotermisk forsamling reaktion buffer med 3 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 300 µL 1 M MgCl2, 600 µL af 10 mM dNTP, 300 µL 1 m DTT, 1,5 g PIND-8000 og 20 mg af NAD23.
    4. Tilføje de kombinerede fragmenter til en 15 µL 1 x isotermisk forsamling reaktion buffer alikvot. Inkuber reaktion i en PCR reaktion rør ved 50 ° C i 15 minutter.
    5. Gøre en 0,8% Agarosen gel og køre med en spænding på 10 V/cm til at kontrollere den udgloedning effektivitet af disse fragmenter.
    6. Rense den beregnede plasmid og elueres ved hjælp af 15 µL af RNase-fri vand. Omdanne 1 µL af den renset plasmid DNA til 50 µL af DH5α kompetente E. coli celler24 til fremtidig brug.
    7. Uddrag og rense plasmid DNA af securin-mCherry fra DH5α kompetente E. coli celler.
    8. Transskribere lineariseret securin-mCherry plasmid DNA ind i mRNA og rense mRNA. Brug et spektrofotometer til at kontrollere, at koncentrationen af mRNA er mere end 100 ng/µL og forholdet mellem absorbans på 260 nm og 280 nm er omkring 2,0.
  2. Forberedelse af demembranated Xenopus laevis sæd DNA
    Bemærk: Tilpasset fra Murray 19911.
    1. Aflive voksne mandlige Xenopus laevis25 og dissekere testiklerne fra fire mandlige frøer26,27.
    2. Placer testiklerne fra fire frøer i samme 100 mL petriskål. Skyl testiklerne tre gange i 50 mL koldt 1 x MMR løsning (0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl,2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0.1 mM EDTA).
    3. Fjerne overskydende blod og fedt fra testiklerne i en 100 mL petriskål og derefter vaskes to gange i kolde nukleare forberedelse buffer (NPB) (250 mM saccharose, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,5 mM spermidine trihydrochloride, 0,2 mM Spermin tetrahydrochloride).
    4. Fjern den nukleare forberedelse buffer (NPB) og skære testiklerne i stykker med længder mindre end 0,2 cm ved hjælp af skarpe dissekere saks i en 100 mL petriskål. Tilføje 8 mL koldt NPB til testiklerne for yderligere opdeling.
    5. Brug nylon mesh stof med en porestørrelse på 70 µm filter testiklerne og indsamle sædprøve i en 15 mL konisk slange. Spin ned de indsamlede sperms på 1,730 x g i 10 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten.
    6. Levere sædceller med 1 mL af NPB og 50 µL af 10 mg/mL lysolecithin og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min til demembranate sædceller.
    7. Vask demembranated sæd DNA med 10 mL koldt NPB med 3% BSA løsning tre gange.
    8. Måle tætheden af sæd DNA med en hemocytometer.
    9. Fryse sæd DNA i 5 µL delprøver i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C. Den optimale koncentration af sæd DNA er ca 105 kerner/µL.
  3. Protein oprensning af normal god landbrugspraksis-nukleare lokalisering Signal (normal god landbrugspraksis-NLS)
    1. Omdanne BL21 GST-tagged normal god landbrugspraksis-NLS plasmid (DE3) kompetente E. coli celler5.
    2. Inkuber celler uden antibiotika ved 37 ° C i 1 time og derefter spredes på en LB Agarosen plade med 100 µg/mL ampicillin.
    3. Inkuber plade ved 37 ° C i 14 til 18 timer at dyrke celler i enkelt kolonier. Pluk og podes enkelt kolonier til 4 mL af LB medier med 100 µg/mL ampicillin. Ryst celler ved 37 ° C i 12 timer.
    4. Forberede autoklaveres YT medierne (16 g af Bacto-trypton, 10 g af Bacto-gærekstrakt, 5 g NaCl) og varme YT medier til 37 ° C.
    5. Podes 1 mL overnight rugede celler i LB medier i 250 mL af forvarmet YT medier med 100 µg/mL ampicillin og omrystes i 2 timer til at øge celle tæthed.
    6. Måle celle optisk densitet (OD) hver 30 minutter, ved hjælp af en spektrofotometeret ved en bølgelængde på 600 nm. Tilføje 0.1 mM IPTG i celler til at fremkalde normal god landbrugspraksis-NLS protein udtryk når OD-værdi når 0,1.
    7. Ryst celler ved 18 ° C natten over til at reducere celle vækst og giver bedre protein udtryk og syntese.
    8. Spin ned celler på 34,524 x g ved 4 ° C i 5 minutter og Fjern supernatanten.
    9. Resuspend celle pellets i 40 mL PBS buffer (leveres med 800 µL af 50 mg/mL Lysozym, 100 µL af 0,2 M PMSF, 13.2 µL af en 10 mg/mL blanding af leupeptin, pepstatin og chymostatin og 8 µL af 0,5 M EDTA) og inkuberes ved 4 ° C i 20 minutter.
    10. Bryde ned celler ved hjælp af en sonikator ved en frekvens på 20 kHz til 4 x 30 s, med 30 s mellemrum mellem hver sonikering, at frigive udtrykt normal god landbrugspraksis-NLS protein.
    11. Spin på 20.000 x g i 35 minutter at fjerne de brudte celler.
    12. Bruge affinitet kromatografi til at udtrække og rense normal god landbrugspraksis-NLS protein.
    13. Vaske 1,5 mL perle gylle tre gange med 15 mL PBS buffer og Inkuber 250 mL af lysate med perler i 4 timer ved 4 ° C med inversion.
    14. Spin ned perler på 2000 x g i 5 min og tilsæt 10 mL vaskeopløsning (25 mM Tris base, pH 7,5, 500 mM NaCl, og 5 mM DTT) til perler. Inkuber perler i 700 µL af eluering buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM reduceret glutathion og 5 mM DTT) med rotation ved 4 ° C. Indsamle en alikvot af eluering med et volumen på 50 µL.
    15. Mål koncentrationen af indsamlede protein ved at køre en Coomassie blå gel28.
    16. Elueres proteiner ved hjælp af PD-10 kolonner med 3 mL af opbevaring buffer (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glycerol, pH 7.7) gennem buffer exchange.

2. forberedelse af cykling Xenopus ekstrakter

Bemærk: Den generelle procedure i forbindelse med udarbejdelse af uddrag er illustreret i figur 1A. Tilpasset fra Murray 19911.

  1. Injicere tre ældre kvindelige Xenopus laevis med 66 IU gravide mare serum gonadotropin (PMSG) 10 dage før lægge æg.
  2. Injicere disse Xenopus frøer med 500 IU af humant choriongonadotropin (HCG) til at fremkalde æglægning 18 timer før udarbejdelsen af cykling ekstrakter.
  3. Kassér lagt æg natten over. Baseret på eksperimenter (data ikke vist), generere ekstrakter fremstillet af friskpresset æggene længerevarende aktiviteter end ekstrakter fremstillet af lagt æg fra den samme kvindelige frø. Klemme æg af hver kvindelige frø i 100 mm petriskåle, der indeholder 10 mL 0,2 x MMR buffer og inspicere under et stereo mikroskop.
  4. Kassér partier af æg, der har uklare grænser mellem dyr og vegetal polakker eller har uregelmæssige hvide pletter på toppen af dyret polakker.
  5. Vælg parti af æg fra en kvindelig frøen præsentere en homogen population af æg med klart differentierede dyr og vegetal polakker og overføre æggene i et 600 mL bægerglas.
  6. Hæld overskydende 0,2 x MMR buffer og forsigtigt tilføje 250 mL af 2 g pr. 100 mL ekstrakt cystein (pH 7.7) i 1 x buffer (100 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50 mM saccharose, pH 7.7) til æg.
  7. Ryst æggene kraftigt i hånden og fjerne jelly frakker af æg over tre vasker med en samlet maengde paa 800 mL af cystein buffer i 3 minutter eller indtil æggene samlede og bosætte sig i bunden af bægerglasset, der indikerer at jelly frakke fjernelse er vellykket.
  8. Vask æg med 1 L af 0,2 x MMR løsning over fire gange.
  9. Samle og skille sig af æg, der bliver hvide ved hjælp af et glas overførsel pipette.
  10. Udøse MFR buffer og levere æg med 200 mL af 0,1 µg/mL calcium ionophor A23187 løsning i 0,2 x MMR buffer for aktivering.
  11. Brug bred åbning side af glas pipette til rør æggene forsigtigt, indtil æggene er aktiveret og fjerner calcium ionophor løsning.
  12. Kontrollere, om aktivering effektive efter æg slå sig ned i bunden af bægerglasset. Godt aktiveret æg har ca. 25% af dyr pole og 75% af vegetal pole.
  13. Vask de aktiverede æg to gange med 50 mL af 1 x ekstrakt buffer suppleret med proteasehæmmere (10 µg/mL hver leupeptin, pepstatin og chymostatin).
  14. Omhyggeligt overføre æg til en 0,4 mL snap-cap microtube og derefter pakke æg gennem centrifugering ved 200 x g i 60 sekunder, og derefter 600 x g i 30 sekunder.
  15. Fjerne ekstra buffer på toppen af æg ved hjælp af et glas Pasteur pipette til at reducere fortyndingen af ekstrakter.
  16. Knuse æg på 15.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
  17. Skære rør med et barberblad at adskille tre lag af knust æg og holde den rå cytoplasma i det midterste lag.
  18. Overføre de rå cytoplasma til nye ultracentrifuge rør, og supplere med proteasehæmmere og cytochalasin B på 10 µg/mL hver.
  19. Der centrifugeres rå cytoplasmaet igen på 15.000 x g ved 4° C i 5 minutter til yderligere rense cytoplasma ved at fjerne overskydende lipid og æggeblomme.
  20. Holde frisklavede uddrag på is.

3. droplet Generation

  1. 2D glas kammer forberedelse
    Bemærk: Rektangel glasrør tjene som kamre, der begrænser dråber i en enkelt 2-dimensional plan, giver mulighed for lettere observation og dataindsamling.
    1. Skær rektangel glasrør med en indre dimension af 2 mm x 100 µm i 4 mm lange stykker. Bruge den skarpe kant af en whetstone, markere de ønskede grænser på den ydre overflade af glasrør med lys raderinger, så forsigtigt lægge pres på begge sider af raderinger at bryde off stykker glasrør.
    2. Pre varme tørre bad inkubator til 95 ° C. Tag den varme blok og læg det i en polycarbonat vakuum ekssikkator.
    3. Placere en 1,5 mL microcentrifuge tube indeholder 30 µL af trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan i varme blok. Lægge skåret glasrør inde i vakuum ekssikkator på ca 5 cm til den varme blok.
    4. Tilslut ekssikkatoren til en vakuumpumpe. Drej på pumpen i 1 minut til at nå den ønskede vakuum, så luk den 3-vejs ventil til at forsegle ekssikkatoren og lad trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan vapor pels den indre væg af glasrør. Dette vil skabe en hydrofobe miljø for stabiliserende dråber.
    5. Forlade glasrør indeni ekssikkator til natten belægning. Rør vil være klar til brug næste dag.
  2. Droplet generation og billedbehandling
    Bemærk: Generere dråber og imaging procedurer er illustreret i tal 1B og 1C.
    1. Levere ekstrakter forberedt i trin 2 med 10 ng/µL securin mCherry mRNA for simple cytoplasmatisk-kun cellecyklus eksperimenter. Alternativt, levering ekstrakter med demembranated sperm kromatin (250 pr. µL af ekstrakt), 10 µM normal god landbrugspraksis-NLS protein og 10 ng/µL securin mCherry mRNA at oprette droplets udstiller periodiske kerner morfologi ændres.
    2. I en 1,5 mL microcentrifuge rør leveres mix 20 µL af ekstrakt med rekombinant protein eller mRNA med 200 µL af 2% produktion-polyethylen glycol (PFPE-PIND) fluorosurfactant i HFE7500 fluorholdige olie.
    3. Oprette droplets bruger en vortex-mixer. Rækken af droplet størrelser kan moduleres af vortex hastighed og varighed. For at oprette droplets med radier spænder fra 50 til 200 µm, indstille vortex hastighed på 56 x g (3.200 rpm med en radius på 4,9 mm) og blidt tryk microcentrifuge tube indeholder ekstrakt og overfladeaktivt stof blanding på mixeren for 3,5 sekunder. Inspicér visuelt hvis dråber er ensartede i størrelse.
    4. Bruge en 20 µL pipette til at overføre droplets flyder på toppen og en tilsvarende mængde PFPE-PIND overfladeaktivt stof ind i en PCR rør. Dyp glasrør forberedt fra trin til laget droplet i 1,5 mL microcentrifuge tube og vent, indtil dråberne har fyldt ca. 75% af røret, så skub røret ned i laget overfladeaktivt stof indtil røret er helt fyldt. Dette vil sænke droplet tæthed og tillade droplets til at danne en enkelt lag inde i salen uden overlappende eller figur konkurrenceforvridning forårsaget af overbefolkning.
    5. Fyld et glas bund fad med en diameter på 40 mm med mineralsk olie. Fordyb droplet-fyldt rør i olie ved forsigtigt at skubbe dem ned ved hjælp af fine pincet.
    6. Efter læsning alle prøver, brug et glas afpipetteres for at fjerne synlige snavs eller rende dråber. Tilføje mere mineralsk olie, hvis rørene ikke eller vil ikke være helt nedsænket i billedprocessen.
    7. Gennemføre billeddannelse af dråber på et epifluorescensmikroskop, udstyret med en motoriseret XY fase (Se Tabel af materialer). Bruge en 4 X luft mål for alle billedbehandling. Fluorescens imaging, bruge en 130 W kviksølv damp kort arc lamp som fluorescens lyskilde til belysning og en normal god landbrugspraksis filter angivet (excitation 482/35 nm og emission 514/LP nm) og et mCherry filter angivet (excitation 562/40 nm og emission 641/75 nm) til billedbehandling Normal god landbrugspraksis-NLS og securin mCherry signaler.
    8. Optage time-lapse videoer i feltet lyse og flere fluorescens kanaler hver 6 til 9 minutter indtil dråberne mister deres aktivitet.

4. billede behandling og analyse af Data

  1. Segmentering og sporing af dråber
    1. Importere registrerede data format for ".tif" eller ".oif" i billed analyse software (Se Tabel af materialer).
    2. Segmentere enkelt droplets bruger lysfelt kanal. Det lyse felt billede vil vise dråber som lyse cirkler med mørke grænser. Anvende tærskel på billedet. Tilføje en tracking overflade til hver dråbe af tuning tærskel mellem mørke og lyse pixels, så at hver overflade dækker hele området med den tilsvarende slipværktøj.
    3. Automatisk spore segmenterne mellem tilstødende rammer ved hjælp af den autoregressive bevægelse algoritme. Tune den acceptable maksimale rejse afstand af et slipværktøj mellem to tilstødende rammer skal være mindre end radiussen af de fleste dråber til spore nøjagtigt små dråber.
    4. Visuelt kontrollere alle spor på tværs af hele videoen til at opdage forkert segmenter dette segment det tomme rum mellem dråber i stedet for faktiske dråber. Manuelt slette forkerte spor.
    5. Segment og spor baggrundsområdet uden nogen dråber at få baggrunden fluorescens intensitet. For at forbedre signal-støj, subtrahere baggrund intensitet fra fluorescens-intensiteten af dråber på hver tidsramme.
    6. Eksportere målte parametre for hvert spor over tid, herunder middelværdi og standardafvigelse af fluorescens-intensiteten og slipværktøjet areal i ".csv" filer.
  2. Dataanalyse af droplet størrelse og svingning periode
    1. Indlæse filerne ".csv" i R at oprette afbildninger af fluorescens intensitet over tid for hver dråbe. Optag droplet-ID til en ".csv"-fil.
    2. Importere filerne ".csv" eksporteret fra analyse software og ".csv"-fil med en liste af droplet-ID i Matlab og opspare nemlig ".mat" filer for yderligere dataanalyse.
    3. Beregne omfanget af en komprimeret droplet baseret på eksporterede slipværktøjet areal information efter segmentering og højden af glas afdeling19. Bruge lydstyrke til at beregne radiussen af droplet som en kugle.
    4. Uddrag tidspunkter af toppe og dale ved hjælp af peak/trug opdagelse algoritme. Udføre manuelle rettelser på placeringen af toppe og dale til at sikre, at de registreres nøjagtigt.
    5. For at beregne perioden celle-cyklus, beregne tidsinterval mellem to tilstødende toppe. Tage gennemsnittet af alle intervaller for hver dråbe som sin cellecyklus periode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I figur 2viser vi, at denne protokol producerer mitotiske svingninger i både enkle, atomfrit celler samt kompliceret celler med kerner, hvor oscillatoren drev cyklisk skiftevis kerner dannelse og deformation. Fri for kerner dråber generere mitotiske svingninger op til 30 undamped cykler over tidsrum 92 timer, som fremgår af de periodiske syntese og nedbrydning af et fluorescens reporter securin-mCherry (figur 2A). Securin er et substrat i anaphase fremme komplekse APC/C. Forringelse af securin-mCherry under anaphase således angiver aktivitet af APC/C.

For at undersøge den mitotiske oscillator evne til at drive downstream mitotiske begivenheder, leveret vi desuden demembranated sperm kromatin, renset grøn fluorescerende proteiner-nukleare lokalisering signal (normal god landbrugspraksis-NLS) og Hoechst 33342 farvestoffer til den cytoplasmatisk ekstrakter. Figur 2B viser den autonome vekslen mellem forskellige cellecyklus faser, interphase (blå søjler) og mitose (røde søjler), hvorunder ændringerne af nukleare morfologi er drevet af den selvbærende mitotiske oscillator. Alle mitotiske begivenheder, dvs, kromosom decondensation og kondens rapporteret af Hoechst 33342 (figur 2B, første række), den nukleare dannelse og nukleare kuvert opdeling af normal god landbrugspraksis-NLS (figur 2B, anden række) og aktivitet cellecyklus oscillator af syntese og nedbrydning af securin-mCherry (figur 2B, tredje række), faldt sammen med hinanden. Billeder blev indsamlet ved hjælp af time-lapse multi-kanal fluorescens mikroskop. Vores eksperimentelle resultater viser, at det rekonstruerede cellecyklus system er i stand til at rekonstruere en mitotiske oscillator Cdk1 og APC/C, som kan køre en række downstream arrangementer herunder nukleare kuvert opdeling og reformationen, og kromosom morfologi ændring.

Figur 3 viser svingninger fremgår af gennemsnitlig fluorescens-intensiteten af securin mCherry før og efter fjernelse af støj. Tinder og dale blev mere udtalt efter at fjerne baggrundsstøj, især for de to første svingninger, der angiver, at støj fjernelse kan hjælpe med at forbedre signal til støj for yderligere analyse.

Figure 1
Figur 1. Eksperimentel procedure til at generere droplet-baserede mitotiske celler. A. cytoplasmatisk ekstrakter er indsamlet via ultra-centrifugering. B. uddrag leveres med flere komponenter med henblik på at retablere og rapportering mitotiske svingninger. Bruger en vortexing metode, blandes ekstrakter og overfladeaktivt stof olie til at generere dråber. C. dråber er indlæst i et trichlor (1 H, 1 H, 2 H, 2 H-perfluorooctyl) silan-beklædt rør og derefter afbildet gennem en epi-fluorescens mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Påvisning af cellecyklus dynamics ved hjælp af fluorescerende reportere. A. tid kurset af gennemsnitlige securin-mCherry fluorescens intensiteten af den valgte slipværktøj, der angiver 30 undamped svingninger over et kursus af 92 timer. Indsæt figur viser fluorescens billedet med den valgte droplet indrammet af hvide stiplede cirkel. Skalalinjen er 100 µm. B. Tidsserier af øjebliksbilleder af en dråbe i fluorescens kanaler (top tre rækker) og lyse felt (den sidste række). Den cykliske progression af cellecyklus ur og sin downstream mitotiske processer spores samtidigt af flere fluorescerende journalister. Anaphase substrat securin-mCherry angiver aktivitet af ur regulator APC/C, Hoescht pletten angiver kromosomale morfologi ændringer, og normal god landbrugspraksis-NLS angiver nukleare kuvert opdelinger og p.g.a. Nuklear konvolutter (fremhævet af hvide pile) er også påvises i lysfelt billeder, matchende lokalisering af normal god landbrugspraksis-NLS angivet kerner. Skalalinjen er 50 µm. Interphase og mitotiske fase er henholdsvis angivet med den blå bjælker og røde bjælker over billederne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Baggrund subtraktion for gennemsnitlige fluorescens-intensiteten af securin mCherry. A. svingning tidsforløb før baggrund støj fjernelse. B. svingning tidsforløb efter fjernelse af støj. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har forelagt en roman metode til at udvikle en høj overførselshastighed kunstige celle system, der gør det muligt for in vitro rekonstitution og langsigtede sporing af selvbærende cellecyklus svingninger på én celle-niveau. Der er flere kritiske trin, der gør denne metode lykkes. Første, friskpresset Xenopus æg med en god kvalitet, sammenlignet med lagt æg, tendens til at producere ekstrakter med længerevarende svingning aktivitet. Andet, indkapsling af ekstrakter inden for de overfladeaktive stof-stabiliseret microenvironments er afgørende for at bevare svingning aktiviteten. Tredje, inkubation af små dråber olie i en tynd slange begrænser dråber i et enkelt lag, hvilket gør det lettere for billedbehandling og langsigtet opfølgning. For det fjerde hjælper belægning rør indre væg med trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan som en anti-klæbende til at sænke den overfladeenergi bevare ekstrakt aktivitet. Femte, tætning af rør med olie ville forhindre slipværktøj flow. Metoden olie-forsegling kan også forhindre fordampning og yderligere bevare ekstrakt aktivitet. Disse forbedre sammen succesraten for in vitro- genopbygning af robust svingninger i dråber og nøjagtigheden af segmentering og sporing af disse dråber i en langsigtet.

For at generere microemulsion dråber, har vi ansat både en simpel vortexing metode, svarende til et par andre studier29,30,31, såvel som de mere almindeligt brugte mikrofluidik teknikker19, 20 (data ikke vist). Begge metoder var købedygtig med held generere microemulsions på en måde, høj overførselshastighed. En begrænsning forbundet med metoden vortexing er, at Dråbestørrelse ikke er ensartet reguleret. For undersøgelser, der kræver en veldefineret størrelse med minimeret størrelse variation, bør mikrofluidik teknikker bruges til bedre kontrol af droplet størrelser. Her, har vi valgt metoden vortexing over mikrofluid metoden af to grunde. Først, den har enkel og let at følge procedurer, som gør det muligt labs uden adgang til mikrofluid teknikker eller nanofabrication faciliteter til at tilpasse denne metode let. Andet, vortexing metode er mere effektiv og økonomisk for at undersøge størrelsen-afhængige adfærd af oscillatoren. Det kan generere en bred distribution af droplet størrelser med radier varierer fra flere mikrometer op til 300 mikron, mens mikrofluid teknik kan kun generere en smal distribution centreret på en foruddefineret størrelse. Rækken af droplet størrelser genereret med denne metode svarer til den brede vifte af cellestørrelser som følge af de karakteristiske reduktiv celledelinger i kavalergang fase af tidlige embryoner som Xenopus og zebrafisk.

Den nuværende metode er blevet væsentligt forbedret bæredygtighed af svingninger og gennemløb af analysere komplekse ur dynamics, sammenlignet med eksisterende metoder til erstatningsgodtgørelse biologiske oscillatorer i godt blandet bulk løsning8, 32, som har tendens til at producere hurtigt dæmpede svingninger. Vi har vist, at denne metode er blevet væsentligt forbedret levetiden for svingninger fra et par cykler i bulk reaktion8 til over 30 cykler i mikromiljø dråber (figur 2A). Derudover bulk reaktioner mangler ligheden til de faktiske celle dimensioner og kan ikke sammenfatte den rumlige organisation opnåede af funktionelle opdelingen i rigtige celler. Efter at have overvundet disse begrænsninger af bulk reaktioner, giver vores kunstige celle system en afgørende platform for at undersøge udfordrende spørgsmål såsom den cellulære heterogenitet og stochasticity af oscillatorer, som ellers er umuligt at udforske.

Desuden, denne metode giver fleksibilitet i graden af kompleksitet som celler kan bygges. For at undgå enhver indblanding fra komplicerede nukleare dynamik, kan vi rekonstruere en minimal, cytoplasmatisk-only cellecyklus system, der indeholder ingen kerner. Denne enkle og cytoplasmatisk-kun oscillator udstiller selvbærende svingninger betydeligt bedre end nogle eksisterende syntetisk oscillatorer. Ved at levere sædcellerne kromatin, kan vi også rekonstruere mere komplekse celler med kerner, der veksler mellem samlesæt på interfasen og nukleare deformation på den mitotiske fase i en rytmisk måde. Aktiviteten af den mitotiske oscillator samt de downstream nukleare hændelser kan være samtidige målt af multi-kanal fluorescens imaging og encellede tracking.

Metoden giver også mulighed for en høj grad af manipulation i droplet størrelse og cellecyklus hastighed. Vortexing teknik giver mulighed for generation af dråber med radier i en bred vifte, som vil gavne studiet af Cellestørrelse afhængige adfærd af celle cyklusser. Derudover kan cellecyklus hastighed gradueres ved at levere forskellige koncentrationer af cyclin B1 mRNAs33, som gør det muligt for os at studere funktionen tunability i celle-cyklus uret.

Med disse fordele, vil i vitro rekonstrueret cellecyklus platformen, gør det muligt for visualisering, manipulation og analyse af encellede dynamics, sandsynligvis bane vejen for nye indsigter i de mere komplicerede stokastiske adfærd af cellen cyklus ur. Metoden kan også være et generaliserbart til in vitro- undersøgelser af andre oscillatorer, der traditionelt er afhængige af bulk reaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at videregive.

Acknowledgments

Vi takker Madeleine Lu til at konstruere securin mCherry plasmid, Lap mand Lee, Kenneth Ho og Allen P Liu for diskussioner om droplet generation, Jeremy B. Chang og James E. Ferrell Jr nemlig sørger for normal god landbrugspraksis-NLS konstruere. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (tidlig karriere Grant #1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688), og en Sloan Research Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
  4. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  5. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  6. Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
  7. Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
  8. Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
  9. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
  10. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
  11. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
  12. Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
  13. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  14. Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  15. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
  16. Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
  17. Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
  18. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
  19. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
  20. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
  21. Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
  22. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
  23. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
  25. Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).
  27. Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  28. Wilson, C. M. Methods in Enzymology. 91, Academic Press. 236-247 (1983).
  29. Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
  30. Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
  31. Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
  32. Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
  33. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).

Tags

Biokemi sag 139 mitotiske cellecyklus vedvarende selvstændige svingninger Xenopus laevis cykling celle-gratis uddrag time-lapse Fluorescens mikroskopi in vitro- enkelt-celle analyse kunstige celler microemulsion
Rekonstituering af cellecyklus svingninger i Microemulsions af celle-fri <em>Xenopus</em> æg uddrag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., … More

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter