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Biochemistry

Reconstituição das oscilações do ciclo celular em microemulsões dos extratos de ovo sem célula Xenopus

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Nós apresentamos um método para a geração de em vitro auto-sustentado mitótica oscilações no nível de célula única encapsulando extratos de ovos de Xenopus laevis em microemulsões de água em óleo.

Abstract

Medição em tempo real das oscilações no nível de célula única é importante para desvendar os mecanismos de relógios biológicos. Apesar de extratos em massa preparados a partir de ovos de Xenopus laevis foram poderosos em dissecando redes bioquímicas subjacentes a progressão do ciclo celular, sua medida média ensemble normalmente leva a uma oscilação amortecida, apesar de cada um oscilador individual sendo sustentada. Isto é devido à dificuldade de sincronização perfeita entre os osciladores individuais em sistemas biológicos barulhentos. Para recuperar a dinâmica de célula única do oscilador, desenvolvemos um sistema de célula artificial baseada em gotículas que pode reconstituir ciclos mitóticos em compartimentos de célula, como encapsular ciclismo citoplasmáticos extratos de ovos de Xenopus laevis . Essas células somente citoplasmática simples apresentam oscilações sustentadas por mais de 30 ciclos. Para construir mais complicadas células com núcleos, nós adicionamos demembranated cromatina de espermatozoides para acionar núcleos auto-montagem no sistema. Observamos uma progressão periódica de cromossomo condensação/ocorre descondensação e núcleos envolvem avaria/reforma, como nas células reais. Isso indica que o oscilador mitótico fielmente as funções para conduzir vários eventos mitóticos a jusante. Seguimos simultaneamente a dinâmica do oscilador mitótico e processos a jusante em gotículas individuais usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo de multi-canal. O sistema de ciclo celular artificial fornece uma estrutura de alto rendimento para manipulação quantitativa e análise das oscilações mitóticas com resolução de célula única, que provavelmente fornece insights importantes sobre as máquinas reguladoras e funções de o relógio.

Introduction

Citoplasmáticos extratos preparados a partir de ovos de Xenopus laevis representam um dos modelos mais predominantes para o estudo bioquímico da célula ciclos, dado o grande volume de oócitos, a progressão do ciclo celular rápido e a capacidade de reconstituir eventos mitótica em vitro1,2. Este sistema permitiu a descoberta inicial e caracterização mecanicista dos reguladores do ciclo celular essencial como fator de promoção da maturação (MPF), bem como a jusante processos mitóticos incluindo eixo montagem e cromossomo segregação1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Os extratos de ovos de Xenopus também têm sido utilizados para dissecação pormenorizada das redes reguladoras do ciclo celular relógio8,12,13,14 e para estudos sobre os danos do DNA /Replication posto15 e o fuso mitótico montagem de ponto de verificação16,17,18.

Estes estudos dos ciclos de célula usando os extratos de ovos de Xenopus foram baseados principalmente em medições de volume. No entanto, os ensaios de reação em massa convencional não podem imitar comportamentos de célula real, dados uma grande discrepância em suas dimensões e subcellular compartimentalização espacial das moléculas de reação. Além disso, medições de volume de actividade mitótica são propensas a dar um número limitado de ciclos antes rapidamente de amortecimento8. Estas desvantagens de reações em massa impediram que o sistema de extrato para fornecer mais compreensão do complexo relógio dinâmico Propriedades e funções. Estudos recentes têm encapsulado sem célula citostáticos (CSF) de fator-preso Xenopus extrai19,20 em compartimentos celulares, como definido pelo tamanho, que ajudaram a elucidar como o tamanho do eixo é modulado pelo volume citoplasmático. No entanto, este sistema em vitro é preso em metáfase da meiose II pela ação do fator citostáticos1, e é necessário um sistema capaz de oscilações sustentadas a longo prazo a nível de célula única para posterior investigação do ciclo celular oscilador.

Para estudar as oscilações do ciclo celular com resolução de célula única, nós desenvolvemos um sistema de alta produtividade para reconstituição e medição simultânea de vários processos mitóticos auto-sustentado oscilatórios em microemulsão individual, célula-escala gotas. Neste protocolo vídeo detalhado, demonstramos a criação do sistema de oscilação mitótica artificial encapsulando ciclismo Xenopus laevis citoplasma de ovo em microemulsões de tamanhos que variam de 10 a 300 µm. Neste sistema, foram mitóticas oscilações incluindo condensação cromossomo e de condensação, colapso do envelope nuclear e reforma e a degradação e síntese de substratos anáfase (por exemplo, securin-mCherry neste protocolo) reconstituído com êxito.

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Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Michigan e institucional Cuidado Animal.

1. preparação de materiais para reconstituição do ciclo celular e detecção

  1. Montagem de Gibson clonagem para a construção de DNA do plasmídeo e purificação de mRNA da securin-mCherry
    1. Preparar três fragmentos de DNA, incluindo uma espinha dorsal de vetor de pMTB2, securin e mCherry através da reação em cadeia da polimerase (PCR) e gel purificação21,22.
    2. Medir as concentrações de fragmentos usando um fluorospectrometer. Combinam 100 ng de backbones com inserções de securin e mCherry em um 1:1:1 relação molecular e adicionar água desionizada para ajustar o volume total de reação a 5 µ l.
    3. Prepare-se 6 mL de 5x do amortecedor da reação isotérmica montagem com 3 mL de 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 300 µ l de 1m MgCl2, 600 µ l de 10mm dNTP, 300 µ l de 1 M DTT, 1,5 g de PEG-8000 e 20 mg de NAD23.
    4. Adicione os fragmentos combinados a uma 15 µ l 1 x Assembleia isotérmico reação do buffer de alíquota. Incube a reação em um tubo de reação de PCR a 50 ° C por 15 minutos.
    5. Fazer um agarose 0,8% do gel e correr com uma tensão de 10 V/cm para verificar a eficiência de recozimento destes fragmentos.
    6. Purificar o plasmídeo construído e eluir usando 15 µ l de água livre de RNase. Transformar 1 µ l do ADN do plasmídeo purificado em 50 µ l de DH5α competente Escherichia coli células24 para uso futuro.
    7. Extrair e purificar o plasmídeo de securin-mCherry do competente DH5α Escherichia coli células.
    8. Transcrever o plasmídeo linear securin-mCherry DNA em mRNA e purificar o mRNA. Use um espectrofotômetro para verificar se a concentração de mRNA é mais do que 100 ng / µ l e a relação da absorvência em 260 nm e 280 nm é de cerca de 2.0.
  2. Preparação de demembranated esperma Xenopus laevis DNA
    Nota: Adaptado de Murray 19911.
    1. Eutanásia adulto masculino Xenopus laevis25 e dissecar os testículos de quatro rãs macho26,27.
    2. Coloque os testículos de quatro rãs na mesma placa de Petri de 100 mL. Lave os testículos três vezes em 50 mL de solução de x MMR 1 frio (0.1 M de NaCl, 2 mM KCl, 1 mM de MgCl2, 2mm CaCl2, 5mm HEPES, EDTA 0,1 mM).
    3. Remover o excesso de sangue e gordura de testículos em um prato de petri de 100 mL e depois lavar duas vezes em tampão frio preparação nuclear (NPB) (250 mM sacarose, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.5 mM espermidina trihydrochloride, tetrahydrochloride de espermina 0,2 mM).
    4. Retire o tampão de preparação nuclear (NPB) e corte os testículos em pedaços com comprimentos menores que 0,2 cm, usando tesouras afiadas dissecação em uma placa de Petri de 100 mL. Adicione 8 mL de NPB frio para os testículos para mais avaria.
    5. Uso de nylon malha tecidos com um tamanho de poro de 70 µm para filtrar os testículos e coletar a amostra de esperma em um tubo cônico de 15 mL. Spin para baixo as espermas coletadas a 1.730 x g durante 10 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante.
    6. Alimentam as células de esperma com 1 mL de NPB e 50 µ l de lysolecithin 10 mg/mL e incubar a temperatura ambiente por 5 min para demembranate células de esperma.
    7. Lave o esperma de demembranated DNA com 10 mL de NPB frio com solução de 3% BSA três vezes.
    8. Medir a densidade do esperma de DNA com um hemocytometer.
    9. Congelar o esperma de DNA em 5 alíquotas µ l em nitrogênio líquido e armazenar a-80 ° C. A concentração ideal de esperma DNA é aproximadamente 105 núcleos / µ l.
  3. Purificação de proteínas do sinal de localização Nuclear-GFP (GFP-NLS)
    1. Transformar o plasmídeo GST-tag GFP-NLS BL21 (DE3) competente Escherichia coli células5.
    2. Incubar as células sem antibióticos a 37 ° C por 1h e depois se espalhou em um prato de agarose LB com ampicilina 100 de µ g/mL.
    3. Incube a placa a 37 ° C por 14 a 18 horas crescer as células em colónias única. Escolher e inocular colônias única em 4 mL de mídia LB com ampicilina 100 de µ g/mL. Agite as células a 37 ° C durante 12 horas.
    4. Preparar a mídia de YT autoclavada (16 g de Bacto triptona, 10 g de extrato de levedura da Difco, 5 g de NaCl) e aqueça a mídia YT 37 ° c.
    5. Inocular 1 mL das células incubadas durante a noite em LB mídia em 250 mL de mídia de YT pré-aquecido com ampicilina 100 de µ g/mL e agitar durante 2 horas para aumentar a densidade de células.
    6. Medir a densidade óptica da célula (OD) a cada 30 minutos, utilizando um espectrofotômetro no comprimento de onda de 600 nm. Adicione 0,1 mM IPTG em células para induzir a expressão de proteína GFP-NLS, que o valor de OD alcança 0,1.
    7. Agite as células a 18 ° C durante a noite para reduzir a taxa de crescimento de célula e permitir a síntese e a melhor expressão da proteína.
    8. Gire para baixo as células a 34.524 x g a 4 ° C por 5 minutos e retirar o sobrenadante.
    9. Resuspenda as pelotas de célula em 40 mL de tampão PBS (fornecido com 800 µ l de lisozima 50mg/mL, 100 µ l de PMSF 0,2 M, 13.2 µ l de uma mistura de 10 mg/mL de leupeptin, pepstatin e chymostatin e 8 µ l de EDTA 0,5 M) e incube a 4 ° C por 20 minutos.
    10. Quebrar para baixo de células usando um sonicador em uma frequência de 20 kHz para 4 x 30 s, com intervalos de 30 s entre cada sonication, para liberar expressa a proteína GFP-NLS.
    11. Girar a 20.000 x g, durante 35 minutos remover as células danificadas.
    12. Use a cromatografia de afinidade para extrair e purificar a proteína GFP-NLS.
    13. Lave o chorume de grânulo de 1,5 mL três vezes com 15 mL de tampão PBS e incubar 250ml de lisado com grânulos durante 4 horas a 4 ° C, com inversão.
    14. Spin para baixo os grânulos a 2000 x g por 5 min e adicionar 10 mL de solução de lavagem (25 mM Tris base, pH 7,5, NaCl, a 500 mM e 5 mM DTT) talões. Incubar os grânulos em 700 µ l de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 20mm reduzido de glutationa e 5 mM DTT) com rotação a 4 ° C. Recolha uma alíquota da eluição com um volume de 50 µ l.
    15. Medir a concentração de proteína coletada executando um gel azul de Coomassie28.
    16. Eluir as proteínas usando PD-10 colunas com 3 mL de tampão de armazenamento (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% de glicerol, pH 7,7) através da troca de amortecedor.

2. preparação do ciclismo Xenopus extratos

Nota: O procedimento geral de preparação dos extratos é ilustrado na figura 1A. Adaptado de Murray 19911.

  1. Injete feminino maduro três Xenopus laevis com gonadotrofinas de soro de égua grávida de 66 IU (PMSG) 10 dias antes da postura dos ovos.
  2. Injete essas rãs Xenopus com 500 UI de gonadotrofina coriônica humana (HCG) para induzir a 18 horas antes a preparação de extratos de ciclismo de postura de ovos.
  3. Descarte ovos durante a noite. Com base em experiências (dados não mostrados), extratos preparados a partir os ovos espremidos geram atividades mais duradouros do que os extratos preparados a partir de ovos descontraídos da mesma rã fêmea. Espremer os ovos de cada rã fêmea em 100 mm placas de Petri contendo 10 mL de tampão de x MMR 0.2 e inspecionar sob um microscópio estéreo.
  4. Descarte os lotes de ovos que tenham fronteiras claras entre polos de vegetal e animal ou tem manchas brancas irregulares em cima de postes de animal.
  5. Escolher o lote de ovos de um sapo fêmea, apresentando uma população homogênea de ovos com polos de vegetal e animal claramente diferenciada e transferir os ovos para um copo de 600 mL.
  6. Derrama o excesso 0.2 x MMR tampão e suavemente Adicionar 250 mL de 2 g por 100 mL de cisteína (pH 7,7) em 1 x extrair buffer (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10mm HEPES, sacarose 50 mM, pH 7,7) para ovos.
  7. Agitar os ovos vigorosamente à mão e remova os brasões de geleia de ovos ao longo de três lavagens com um volume total de 800 mL de cisteína buffer por 3 minutos ou até os ovos agregados e acertar no fundo do copo, indicando que a remoção do revestimento de geleia é bem sucedida.
  8. Lave os ovos com 1 L de solução de x MMR 0.2 4 vezes.
  9. Escolher e descartar os ovos que ficam brancos usando uma pipeta de transferência do vidro.
  10. Deite fora o buffer MMR e fornecer ovos com 200 mL de ionóforo de cálcio 0,1 µ g/mL solução A23187 em 0.2 x MMR buffer para ativação.
  11. Use o lado de abertura ampla de uma pipeta de vidro para agitar os ovos lentamente até que os ovos são ativados e remover cálcio ionóforo solução.
  12. Verificar a eficiência de ativação depois de ovos assentar no fundo do copo. Bem ativados ovos têm cerca de 25% do polo animal e 75% do polo vegetal.
  13. Lave os ovos ativados duas vezes com 50 mL de tampão de extrato suplementado com inibidores de protease (10 µ g/mL cada de leupeptin, pepstatin e chymostatin) 1x.
  14. Transferir com cuidado os ovos para um microtubo de snap-cap de 0,4 mL e em seguida embalar ovos através de centrifugação a 200 x g durante 60 segundos e então 600 x g durante 30 segundos.
  15. Retire o tampão extra no topo usando um pipeta Pasteur de vidro para reduzir a diluição dos extratos de ovos.
  16. Esmagar os ovos a 15.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
  17. Corte os tubos com uma lâmina de barbear para separar três camadas de ovos esmagados e manter o citoplasma bruto na camada média.
  18. Transferir o citoplasma bruto para novos tubos de se e complementar com inibidores de protease e citocalasina B 10 µ g/ml cada.
  19. Centrifugue o citoplasma bruto novamente em 15.000 x g a 4° C por 5 minutos para purificar ainda mais o citoplasma removendo gema e lipídios em excesso.
  20. Manter os extratos preparados na hora no gelo.

3. gota geração

  1. Preparação de câmara de vidro 2D
    Nota: Os tubos de vidro retangular servem como câmaras que confinar as gotas em um avião 2-dimensional, permitindo mais fácil observação e coleta de dados.
    1. Corte de tubos de vidro retangular com uma dimensão interior de 2 mm x 100 µm em 4mm partes longas. Use a ponta afiada de uma pedra de amolar, marcar os limites desejados na superfície exterior do tubo de vidro com gravuras de luz e, em seguida, aplicar suavemente a pressão em ambos os lados das gravuras para quebrar pedaços de tubos de vidro.
    2. Pré-aquecer uma incubadora de banho seco para 95 ° C. Retire o bloco de aquecimento e coloque-o no exsicador de vácuo policarbonato.
    3. Coloque um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo 30 µ l de silano tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) no bloco de aquecimento. Colocar os tubos de vidro de corte dentro do dessecador a vácuo em cerca de 5 cm para o bloco de aquecimento.
    4. Conecte o dessecador para uma bomba de vácuo. Ligue a bomba durante 1 minuto alcançar o nível de vácuo desejado e, em seguida, feche a válvula de 3 vias para selar o dessecador e deixe o vapor de silano tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) revestir a parede interna dos tubos de vidro. Isso criará um ambiente hidrofóbico para estabilizar as gotas.
    5. Deixe os tubos de vidro dentro do dessecador para revestimento durante a noite. Os tubos estará prontos para uso no dia seguinte.
  2. Geração de imagens e geração de gotículas
    Nota: Os procedimentos de imagem e gerando gotículas são ilustrados nas figuras 1B e 1C.
    1. Fornecer extratos preparados na etapa 2 com 10 ng / µ l securin-mCherry mRNA para os experimentos de ciclo simples de celular somente citoplasmática. Alternativamente, fornecimento de extratos com cromatina de espermatozoides de demembranated (250 por µ l de extrato), proteína de GFP-NLS 10 µM e 10 ng / µ l securin-mCherry mRNA para criar gotículas exibindo morfologia núcleos periódica muda.
    2. Em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga, mistura, 20 µ l de extrato fornecido com proteína recombinante ou mRNA com 200 µ l de 2% perfluoropoliéter-polietileno glicol (PFPE-PEG) fluorosurfactante em óleo fluorado de HFE7500.
    3. Gere gotículas usando um misturador do vortex. A gama de tamanhos de gotículas pode ser modulada pela duração e velocidade de vórtice. Para criar as gotas com raios variando de 50 a 200 µm, definir a velocidade de vórtice a 56 x g (3.200 rpm com um raio de 4,9 mm) e pressione suavemente o tubo microcentrifuga contendo o extrato e mistura de surfactante na mesa de mixagem para 3,5 segundos. Verificar visualmente se as gotas são uniformes em tamanho.
    4. Utilize uma pipeta de 20 µ l para transferir as gotículas flutuando em cima e um volume igual de surfactante PFPE-PEG em um tubo PCR. Mergulhe o tubo de vidro preparado da etapa na camada da gota no tubo de 1,5 mL microcentrifuga e espere até gotículas encheram-se aproximadamente 75% do tubo e, em seguida, empurre o tubo para baixo da camada de surfactante até que o tubo é completamente preenchido. Isso vai diminuir a densidade da gota e permitir as gotas formar uma única camada no interior da câmara, sem sobreposição ou forma de distorção causada pela superlotação.
    5. Encha um prato fundo de vidro com um diâmetro de 40 mm com óleo mineral. Imergir os tubos cheias de gotículas de óleo, delicadamente, empurrando-os para baixo, usando uma pinça fina.
    6. Após o carregamento, todas as amostras, uso um copo Pipetar para remover qualquer sujidade visível ou vazaram gotículas. Adicione mais óleo mineral se os tubos não são ou não vão ser completamente imerso no processo de geração de imagens.
    7. Realizar imagens de gotas em um microscópio de epifluorescência equipado com um palco motorizado x-y (ver Tabela de materiais). Use um objectivo de ar 4 X para todas as imagens. Para a imagem latente de fluorescência, utilize um 130 W mercúrio curto arco lâmpada de vapor como fonte de luz de fluorescência para a iluminação e um filtro GFP definido (excitação 482/35 nm e emissão LP/514 nm) e um filtro de mCherry definido (excitação 562/40 nm e emissão 641/75 nm) para a imagem latente Sinais de GFP-NLS e securin-mCherry.
    8. Gravar vídeos de lapso de tempo no campo brilhante e múltiplos canais de fluorescência cada 6 a 9 minutos até as gotas perdem sua atividade.

4. processamento e análise de dados de imagem

  1. Segmentação e rastreamento de gotículas
    1. Importar dados gravados no formato "TIF" ou ".oif" para o software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais).
    2. Segmento de gotículas única usando o canal de campo brilhante. A imagem de campo brilhante mostrará as gotas como círculos luminosos com limites escuros. Limiarização aplica a imagem. Adicione uma superfície de controle para cada gotícula ajustando o limiar entre pixels escuros e brilhantes, para que cada superfície abrange toda a área da gota correspondente.
    3. Automaticamente controle os segmentos entre quadros adjacentes, usando o algoritmo de movimento de regressão automática. Ajuste a distância viajando máxima aceitável de um droplet entre dois quadros adjacentes para ser menor que o raio da maioria das gotículas para controlar com precisão pequenas gotículas.
    4. Verifique visualmente todas as pistas em todo o vídeo inteiro para detectar segmentações incorretas esse segmento o espaço vazio entre gotículas em vez de gotículas reais. Exclua manualmente faixas incorretas.
    5. Área de plano de fundo segmento e faixa sem qualquer gotas para obter a intensidade de fluorescência do fundo. Para melhorar o sinal para ruído, subtrai a intensidade do fundo da intensidade da fluorescência de gotas em cada período de tempo.
    6. Exporte parâmetros medidos para cada faixa ao longo do tempo, incluindo a média e o desvio padrão da intensidade de fluorescência e a área da gota em arquivos ". csv".
  2. Análise de dados do período de tamanho e oscilação da gota
    1. Carrega os arquivos ". csv" no R para criar lotes de intensidade de fluorescência ao longo do tempo para cada gota. ID de registro da gota em um arquivo "CSV".
    2. Importar os arquivos de "CSV" exportados do software de análise e o arquivo "CSV" com uma lista de ID de gotículas em Matlab e salve como "mat" arquivos para posterior análise de dados.
    3. Calcule o volume de uma gota compactado com base nas informações área exportado gota após19de câmara de segmentação e a altura do vidro. Use o volume para calcular o raio da gota como uma esfera.
    4. Extraia os pontos de tempo de altos e baixos, usando o algoritmo de deteção de pico/calha. Execute correções manuais sobre a posição dos altos e baixos para garantir que eles são detectados com precisão.
    5. Para calcular o período do ciclo celular, calcule o intervalo de tempo entre dois picos adjacentes. Tome a média de todos os intervalos para cada gota como seu período do ciclo celular.

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Representative Results

Na Figura 2, mostramos que o presente protocolo produz oscilações mitóticas em células simples, livre de armas nucleares bem como complicadas células com núcleos, onde o oscilador conduz a alternância cíclica de formação de núcleos e deformação. As gotas de núcleos livres geram oscilações mitóticas acima de 30 ciclos undamped ao longo tempo de 92 horas, conforme indicado pelo periódico síntese e degradação de uma fluorescência repórter securin-mCherry (Figura 2A). Securin é um substrato da anáfase promovendo complexo APC/C. A degradação da securin-mCherry durante a anáfase, portanto, indica a atividade do APC/C.

Para examinar a capacidade do oscilador mitótica de conduzir eventos mitóticos a jusante, além disso fornecemos a cromatina de espermatozoides demembranated, sinal de localização de proteínas nucleares purificada verde fluorescente (GFP-NLS) e Hoechst 33342 corantes para o citoplasma extratos. Figura 2B mostra autónoma alternância de fases distintas ciclo celular, interfase (barras azuis) e mitose (barras vermelhas), durante o qual as alterações da morfologia nuclear são conduzidas pelo oscilador mitótico auto-sustentado. Todos os eventos mitóticos, ou seja, a ocorre descondensação cromossomo e condensação relataram por Hoechst 33342 (Figura 2B, primeira linha), a formação nuclear e envelope nuclear repartição por GFP-NLS (Figura 2B, segunda linha) e a atividade de o oscilador de ciclo celular pela síntese e degradação de securin-mCherry (Figura 2B, terceira fileira), coincidiu com o outro. Imagens foram coletadas usando o microscópio de fluorescência de multi-canal do tempo-lapso. Nossos resultados experimentais demonstram que o sistema de ciclo celular reconstruído é capaz de reconstruir um oscilador mitótico de Cdk1 e APC/C, que pode conduzir a uma série de eventos a jusante, incluindo a desagregação do envoltório nuclear e reforma, e alteração de morfologia do cromossoma.

A Figura 3 mostra as oscilações indicadas pela intensidade média de fluorescência do securin-mCherry, antes e após a remoção de ruído. Altos e baixos, tornou-se mais acentuados depois de remover o ruído de fundo, especialmente para as duas primeiras oscilações, indicando que a remoção de ruído pode ajudar a melhorar o sinal de ruído para uma análise mais aprofundada.

Figure 1
Figura 1. Procedimento experimental para a geração de células mitóticas baseada em gotículas. R. extratos citoplasmáticos são coletados através de ultracentrifugação. B. os extratos são fornecidos com vários componentes com a finalidade de reconstituir e relatando as oscilações mitóticas. Usando um método de utilização do vortex, os extratos e óleo de surfactante são misturados para gerar gotículas. C. as gotas são carregadas em um tubo de silano-revestido de tricloro (1 H, 1 H, 2 H, 2 H-perfluorooctyl) e então fotografadas através de um microscópio de fluorescência-epi. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. A detecção de ciclo celular dinâmica usando repórteres fluorescentes. R. O curso do tempo da intensidade de fluorescência a média securin-mCherry de gota selecionada, indicando 30 oscilações undamped sobre um curso de 92 horas. Inserir figura mostra a imagem de fluorescência com a gota selecionada emoldurada por círculo pontilhado branco. Barra de escala é 100 µm. B. Séries temporais de instantâneos de uma gota em canais de fluorescência (linhas de três primeiros) e campo claro (a última linha). A progressão cíclica o relógio do ciclo celular e seus processos a jusante mitóticos são rastreadas simultaneamente por vários repórteres fluorescentes. A anáfase substrato securin-mCherry indica a atividade do regulador relógio APC/C, a mancha de Hoescht indica mudanças de morfologia cromossômica e o GFP-NLS indica remodelações e avarias do envelope nuclear. Envelopes nucleares (realçadas pelas setas brancas) também são detectáveis nas imagens de campo claro, combinando a localização do GFP-NLS indicado núcleos. Barra de escala é 50 µm. interfase e fase mitótica são denotadas respectivamente pelas grades azuis e barras vermelhas acima as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Fundo de subtração para a intensidade de fluorescência média de securin-mCherry. R. O oscilação tempo curso antes da remoção de ruído de fundo. B. O oscilação curso de tempo após a remoção de ruído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós apresentamos um novo método para o desenvolvimento de um sistema de célula artificial de alto rendimento que permite em vitro reconstituição e acompanhamento a longo prazo do ciclo celular auto-sustentado oscilações no nível de célula única. Existem várias etapas críticas que fazem este método bem sucedido. Ovos de Xenopus espremidos, primeiros com uma boa qualidade, em comparação com ovos estabelecidos, tendem a produzir extratos com atividade de oscilação mais longer-lasting. Em segundo lugar, encapsulamento de extratos no microambiente que surfactante estabilizada é fundamental para preservar a atividade de oscilação. Terceira, incubação das gotículas de óleo em um tubo fino de confins as gotas dentro de uma única camada, tornando mais fácil para o processamento de imagem e acompanhamento a longo prazo. Em quarto lugar, revestimento da parede interna do tubo com silano tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) como antiadesivo para abaixar a energia de superfície ajuda a preservar a atividade do extrato. Em quinto lugar, os tubos de vedação com óleo impediria fluxo da gota. O método de óleo de selagem pode também evitar a evaporação e preservar ainda mais a atividade do extrato. Estas juntas melhoram a taxa de sucesso de reconstrução em vitro de oscilações robustas em gotículas e a precisão da segmentação e rastreamento dessas gotículas em um longo prazo.

Para gerar gotículas de microemulsão, nós empregamos tanto um método de simples utilização do vortex, semelhante a alguns outros estudos29,30,31, bem como os mais comumente usados microfluídica técnicas19, 20 (dados não mostrados). Ambos os métodos foram capazes de gerar com êxito microemulsões em uma maneira de alta produtividade. Uma limitação associada com o método de utilização do Vortex é que o tamanho da gota não é uniformemente controlado. Para estudos que exigem um tamanho bem definido, com variação de tamanho minimizado, microfluídica técnicas devem ser usadas para um melhor controle de tamanhos de gotículas. Aqui, escolhemos o método de utilização do Vortex sobre o método microfluidic por duas razões. Primeiro, ele tem procedimentos simples e fácil de seguir, que permitiriam laboratórios sem acesso a técnicas de microfluidic ou instalações de nanofabricação adaptar esse método facilmente. Em segundo lugar, o método de utilização do Vortex é mais eficiente e econômico para investigar comportamentos dependentes do tamanho do oscilador. Pode gerar uma ampla distribuição de tamanhos de gotículas com raios variando de vários micrómetros até 300 micrômetros, enquanto a técnica microfluidic só pode gerar uma distribuição estreita centrada em um tamanho pré-definido. A gama de tamanhos de gotículas geradas com este método corresponde a ampla gama de tamanhos de células resultante das divisões celulares características redutoras na fase de clivagem de embriões adiantados como Xenopus e zebrafish.

O presente método melhorou significativamente a sustentabilidade das oscilações e o throughput de analisar a dinâmica complexa do relógio, em comparação com os métodos existentes de reconstituir osciladores biológicos em massa bem misturado solução8, 32, que tendem a produzir rapidamente amortecida oscilações. Mostramos que esse método melhorou significativamente a vida útil das oscilações de alguns ciclos em granel reação8 para mais de 30 ciclos no microambiente de gotas (Figura 2A). Além disso, reações em massa faltam a semelhança com as dimensões de célula real e não podem recapitular a organização espacial conseguida compartimentalização funcional em células reais. Tendo de superar essas limitações de reações em massa, nosso sistema de célula artificial fornece uma plataforma essencial para investigar perguntas desafiadoras, tais como a heterogeneidade celular e o crescimento de osciladores, que caso contrário são impossíveis de Explore.

Além disso, este método oferece flexibilidade em grau de complexidade para que as células podem ser construídas. Para evitar qualquer interferência da dinâmica nuclear complicada, nós pode reconstituir um sistema de ciclo celular mínima, somente citoplasmáticos que contém sem núcleos. Este oscilador simples e somente citoplasmática apresenta oscilações auto-sustentado significativamente melhores do que alguns osciladores sintéticos existentes. Fornecendo a cromatina de espermatozoides, nós também pode reconstituir células mais complexas com núcleos que se alternam entre Self-assembly em interfase e deformação nuclear na fase mitótica de forma rítmica. A atividade do oscilador mitótico, bem como os eventos nucleares a jusante pode ser simultânea medidos por imagens de fluorescência multi-canal e rastreamento de célula única.

O método também permite um alto grau de manipulação na velocidade da gota de tamanho e ciclo celular. A técnica de utilização do Vortex permite a geração de gotículas com raios em uma escala larga, que irá beneficiar o estudo da célula-tamanho comportamentos dependentes dos ciclos celulares. Além disso, a velocidade do ciclo celular pode ser modulada, fornecendo diferentes concentrações de cyclin B1 mRNAs33, que nos permitisse estudar a função pré-definido do pulso de disparo do ciclo celular.

Com estas vantagens, a plataforma ciclo celular em vitro reconstruída, permitindo a visualização, manipulação e análise da dinâmica de célula única, provavelmente irá pavimentar o caminho para novos insights sobre os comportamentos mais complicados estocásticos da célula ciclo de relógio. O método também pode ser generalizado para os estudos em vitro de outros osciladores que tradicionalmente dependem de reações em massa.

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Disclosures

Nós não temos nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos a Madeleine Lu para a construção do plasmídeo securin-mCherry, colo homem Lee, Kenneth Ho e Allen P Liu para discussões sobre a geração de gotículas, Jeremy B. Chang e James E. Ferrell Jr para a prestação de QUE GFP-NLS construir. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (início de carreira Grant #1553031), o National Institutes of Health (MIRA #GM119688) e uma bolsa de pesquisa do Sloan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

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References

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Bioquímica edição 139 ciclo celular mitótica auto sustentado oscilações Xenopus laevis andar de bicicleta sem célula extratos microscopia de fluorescência de lapso de tempo em vitro análise de célula única células artificiais microemulsão
Reconstituição das oscilações do ciclo celular em microemulsões dos extratos de ovo sem célula <em>Xenopus</em>
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Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

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