Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije Xenopus ei extracten

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Door encapsulating ei extracten van Xenopus laevis in water-in-olie micro presenteren we een methode voor het genereren van in vitro zichzelf onderhoudende mitotische oscillaties op het niveau van eencellige.

Abstract

Real-time meting van trillingen op de eencellige niveau is belangrijk om te ontdekken de mechanismen van biologische klokken. Hoewel bulk extracten, bereid uit Xenopus laevis eieren krachtig geweest in de ontrafeling van biochemische netwerken ten grondslag liggen aan de celcyclus, leidt hun gemiddelde meting van ensemble meestal tot een gedempte trilling, ondanks elk individuele oscillator wordt opgelopen. Dit is te wijten aan de moeilijkheid van perfecte synchronisatie tussen individuele oscillatoren in lawaaierige biologische systemen. Om op te halen de eencellige dynamiek van de oscillator, ontwikkelden we een kunstmatige cel druppel-gebaseerd systeem dat mitotische cycli in cel-achtige compartimenten encapsulating fietsen cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis eieren kan reconstrueren. Deze eenvoudige cytoplasmatische-alleen cellen vertonen aanhoudende trillingen voor meer dan 30 cycli. Wij toegevoegd om te bouwen ingewikkelder cellen met kernen, demembranated sperma chromatine te activeren de kernen zelf-assemblage in het systeem. We hebben vastgesteld dat een periodieke progressie van chromosoom condensatie/decondensation en kernen omhullen verdeling/Reformatie, zoals in echte cellen. Dit geeft aan dat de mitotische oscillator getrouw functioneert om meerdere downstream mitotische gebeurtenissen. We tegelijk de dynamiek van de mitotische oscillator en downstream processen in afzonderlijke druppels met meerkanaals time-lapse fluorescentie microscopie bijgehouden. Het kunstmatige celcyclus-systeem biedt een high-throughput kader voor kwantitatieve manipulatie en analyse van de mitotische oscillaties met eencellige resolutie, die waarschijnlijk belangrijke inzichten in de regelgevende machines en functies van biedt de klok.

Introduction

Cytoplasmatische extracten, bereid uit Xenopus laevis eieren vertegenwoordigen een van de meest overheersende modellen voor de biochemische studie van cel cycli, gezien de grote hoeveelheid van de eicellen, de snelle celcyclus en het vermogen van de bijenpopulatie mitotische gebeurtenissen in vitro1,2. Dit systeem heeft toegestaan de eerste ontdekking en de mechanistische karakterisering van essentiële celcyclus regelgevers zoals rijping-bevorderende factor (MPF) evenals downstream mitotische processen, met inbegrip van spindel vergadering en chromosoom segregatie1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. De Xenopus ei extracten zijn ook gebruikt voor gedetailleerde dissectie van de regulerende netwerken van de celcyclus klok8,12,13,14 en voor studies van de DNA-schade /Replication checkpoint15 en de mitotische spindel vergadering checkpoint16,17,18.

Deze studies van cel cycli met gebruik van de ei-extracten van Xenopus zijn voornamelijk gebaseerd op metingen van de bulk. Conventionele bulk reactie testen kunnen echter geen echte cel gedrag, krijgen van een belangrijke discrepantie in hun afmetingen en subcellular ruimtelijke opdeling van reactie moleculen nabootsen. Bovendien, bulk metingen van mitotische activiteiten zijn gevoelig voor een beperkt aantal cycli voor snel demping8geven. Deze nadelen van bulk reacties hebben verhinderd het uittreksel systeem om verder inzicht in de complexe klok dynamische eigenschappen en functies. Recente studies hebben ingekapseld cel-vrije cytostatic factor-gearresteerd (CSF) Xenopus 19,20 in grootte gedefinieerde cel-achtige compartimenten, die hebben bijgedragen toelichten hoe de grootte van de spindel wordt gemoduleerd extracten door de cytoplasmatische volume. Echter, dit systeem in vitro is gearresteerd in de metafase van meiose II door de werking van cytostatica factor1, en een systeem dat kan op lange termijn aanhoudende trillingen op het niveau van eencellige nodig is voor verder onderzoek van de celcyclus oscillator.

Studeren celcyclus oscillaties met eencellige resolutie, hebben we ontwikkeld, een cel-schaal, hoge-doorvoer systeem voor reconstitutie en gelijktijdige meting van meerdere zichzelf onderhoudende mitotische oscillerende processen in individuele microemulsion druppels. In dit gedetailleerde video protocol tonen we de oprichting van de kunstmatige mitotische oscillatie systeem door encapsulating fietsen Xenopus laevis ei cytoplasma in Micro van grootte variërend van 10 tot 300 µm. In dit systeem waren de mitotische oscillaties met inbegrip van chromosoom condensatie en ambtshalve condensatie, nucleaire envelop verdeling en Reformatie en de afbraak en synthese van anafase ondergronden (bijvoorbeeld securin-mCherry in dit protocol) met succes aangemaakt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.

1. bereiding van materialen voor celcyclus reconstitutie en detectie

  1. Gibson vergadering klonen van de plasmide DNA bouw en mRNA zuivering van securin-mCherry
    1. Bereiden van drie DNA-fragmenten met inbegrip van een pMTB2 vector ruggengraat, securin en mCherry via de Kettingreactie van de polymerase (PCR) en gel zuivering21,22.
    2. Het meten van de concentraties van fragmenten met behulp van een fluorospectrometer. Combineren 100 ng van backbones met securin en mCherry inzetstukken op een 1:1:1-verhouding, moleculaire en Voeg gedeïoniseerd water om het totale volume van de reactie op 5 µL aanpassen.
    3. Bereiden van 6 mL 5 x isothermische vergadering reactie buffer met 3 mL 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 300 µL van 1 M MgCl2, 600 µL van 10 mM dNTP 300 µL van 1 M DTT, 1.5 g van PEG-8000 en 20 mg NAD23.
    4. De gecombineerde fragmenten aan een 15 µL van 1 x isothermische vergadering reactie buffer aliquoot toevoegen. Incubeer de reactie in een PCR reactiebuis bij 50 ° C gedurende 15 minuten.
    5. Maak een 0,8% agarose gel en uitgevoerd met een spanning van 10 V/cm om te controleren of de onthardende efficiëntie van deze fragmenten.
    6. Zuiveren van de geconstrueerde plasmide en elueer met 15 µL RNase-gratis water. 1 µL van het gezuiverde plasmide DNA transformeren in 50 µL van DH5α bevoegde E. coli cellen24 voor toekomstig gebruik.
    7. Extraheren en te zuiveren van de plasmide DNA van securin-mCherry uit de DH5α bevoegde E. coli cellen.
    8. Transcriberen van het gelineariseerde securin-mCherry-plasmide DNA in mRNA en te zuiveren van de mRNA. Een spectrofotometer gebruiken om te verifiëren dat de concentratie van mRNA meer dan 100 ng/µL en de verhouding van de absorptie bij 260 is nm en 280 nm is ongeveer 2.0.
  2. Voorbereiding van demembranated Xenopus laevis sperma DNA
    Opmerking: Aangepast van Murray 19911.
    1. Volwassen mannelijke Xenopus laeviseuthanaseren25 en testes van vier mannelijke kikkers26,27te ontleden.
    2. Plaats de testes van vier kikkers in de dezelfde 100 mL petrischaal. Spoel de teelballen driemaal in 50 mL koude 1 x MMR-oplossing (2 mM KCl, 0,1 M NaCl, 1 mM van MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0.1 mM EDTA).
    3. Verwijder overtollige bloed en vet van de teelballen in een petrischaal 100 mL en daarna wassen tweemaal in koude nucleaire voorbereiding buffer (NPB) (250 mM sacharose, 15 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.5 mM spermidine trihydrochloride, 0,2 mM spermine tetrahydrochloride).
    4. Verwijderen van de nucleaire voorbereiding buffer (NPB) en teelballen snij in stukjes met een lengte kleiner dan 0,2 cm met behulp van scherpe ontleden schaar in een 100 mL petrischaal. 8 mL koude NPB aan de teelballen voor verdere uitsplitsing toevoegen.
    5. Gebruik nylon mesh stoffen met een poriegrootte van 70 µm te filteren van de teelballen en spermastaaltje te verzamelen in een conische tube van 15 mL. Spin down de verzamelde zaadcellen bij 1,730 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
    6. De zaadcellen met 1 mL van de NPB en 50 µL van 10 mg/mL lysolecithin leveren en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten aan demembranate zaadcellen.
    7. Spoel de demembranated sperma DNA met 10 mL koude NPB met 3% BSA oplossing driemaal.
    8. Meet de dichtheid van sperma DNA met een hemocytometer.
    9. Het sperma DNA in 5 µL aliquots bevriezen in vloeibare stikstof en opslaan bij-80 ° C. De optimale concentratie van sperma DNA is ongeveer 105 kernen/µL.
  3. Eiwitreiniging van GFP-nucleaire localisatie signaal (GFP-NLS)
    1. Het GST-gelabeld GFP-NLS plasmide transformeren in BL21 (DE3) bevoegde E. coli cellen5.
    2. Incubeer de cellen zonder antibiotica bij 37 ° C gedurende 1 uur en vervolgens verspreiden op een LB agarose plaat met 100 µg/mL ampicilline.
    3. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 14 tot 18 uur de cellen uitgroeien tot enkele kolonies. Kies en enkele kolonies in 4 mL van LB-media met 100 µg/mL ampicilline beënten. Schud de cellen bij 37 ° C gedurende 12 uur.
    4. Voorbereiden van de gesteriliseerde met autoclaaf YT media (16 g Bacto trypton, 10 g Bacto gistextract, 5 g NaCl) en warmte van de YT media tot 37 ° C.
    5. 1 mL van de overnachting bebroede cellen in LB-media in voorverwarmde YT media met 100 µg/mL ampicilline 250 mL beënten en schud gedurende 2 uur te verhogen van de celdichtheid.
    6. Cel optische dichtheid (OD) elke 30 minuten meten met een spectrofotometer bij een golflengte van 600 nm. Toevoegen van 0.1 mM IPTG in cellen voor het opwekken van GFP-NLS eiwituitdrukking zodra de OD-waarde 0.1 bereikt.
    7. Schud de cellen bij 18 ° C's nachts te verminderen cel groei en betere eiwit expressie en synthese.
    8. Spin down de cellen bij 34,524 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende vloeistof.
    9. Resuspendeer de cel pellets in 40 mL PBS buffer (meegeleverd met 800 µL van 50 mg/mL lysozym, 100 µL van 0,2 M PMSF 13.2 µL van een 10 mg/mL mix van leupeptin, pepstatin en chymostatin en 8 µL van het EDTA 0.5 M) en Incubeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
    10. Break down cellen met behulp van een ultrasoonapparaat met een frequentie van 20 kHz voor 4 x 30 s, met 30 s intervallen tussen elke ultrasoonapparaat, vrij te geven uitgedrukt GFP-NLS eiwit.
    11. Draaien op 20.000 x g gedurende 35 minuten om te verwijderen van de gebroken cellen.
    12. Gebruik de chromatografie van de affiniteit te extraheren en te zuiveren van GFP-NLS eiwit.
    13. Was de 1,5 mL kraal drijfmest driemaal met PBS buffer 15 mL en 250 mL lysate met kralen Incubeer gedurende 4 uur bij 4 ° C met inversie.
    14. Spin down de kralen bij 2000 x g gedurende 5 minuten en voeg 10 mL van oplossing (25 mM Tris basis, pH 7.5, 500 mM NaCl, en 5 mM DTT) van de wassen aan kralen. Incubeer kralen in 700 µL van elutie buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM gereduceerd glutathion en 5 mM DTT) met rotatie bij 4 ° C. Een aliquoot gedeelte van de elutie met een volume van 50 µL verzamelen.
    15. Het meten van de concentratie van verzamelde eiwit door het uitvoeren van een Coomassie blue gel28.
    16. Elueer de eiwitten PD-10 kolommen met 3 mL opslag buffer (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glycerol, pH 7.7) door middel van uitwisseling van de buffer.

2. voorbereiding van de fietsen van Xenopus extracten

Opmerking: De algemene procedure voor de bereiding van de extracten wordt geïllustreerd in figuur 1A. Aangepast van Murray 19911.

  1. Injecteren van drie volwassen vrouwelijke Xenopus laevis met 66 IU zwangere merrie serum gonadotrofinen (PMSG) 10 dagen vóór het leggen van eieren.
  2. Injecteer deze Xenopus kikkers met 500 IU van humaan choriongonadotrofine (HCG) voor het opwekken van ei tot 18 uur voor de bereiding van extracten fietsen.
  3. Discard legde eieren 's nachts. Op basis van experimenten (gegevens niet worden weergegeven), extracten, bereid uit de versgeperste eieren genereren langduriger activiteiten dan extracten, bereid uit vastgestelde eieren uit de dezelfde vrouwelijke kikker. Knijp de eieren elke vrouwelijke kikker in 100 mm petrischalen met 10 mL 0,2 x MMR buffer en inspecteren onder een stereomicroscoop.
  4. Gooi de batches van eieren die onduidelijke grenzen tussen dier en vegetal Polen of onregelmatige witte vlekken op de top van dier Polen hebben.
  5. Kies de batch van eieren van een vrouwelijke frog presenteren een homogene populatie van eieren met duidelijk gedifferentieerde dier en vegetal palen en breng de eieren in een bekerglas van 600 mL.
  6. Uitstorten van overtollige 0.2 x MMR buffer en zachtjes Voeg 250 mL 2 g per 100 mL cysteïne (pH 7.7) in 1 x extract buffer (100 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50 mM sacharose, pH 7.7) op eieren.
  7. De eieren met de hand schudden en verwijder de gelei jassen van eieren over drie wast met een totaal volume van 800 mL van cysteïne buffer gedurende 3 minuten of totdat de eieren statistische en vestigen op de bodem van het bekerglas, die aangeeft dat de gelei jas verwijdering succesvol is.
  8. Het wassen van eieren met 1 L van 0.2 x MMR oplossing meer dan vier keer.
  9. Kies en negeren van eieren, die wit zijn met behulp van een precisiepipet glas overdracht.
  10. De BMR-buffer uitstorten en leveren van eieren met 200 mL 0,1 µg/mL calcium ionophore A23187 oplossing in 0.2 x MMR buffer voor activering.
  11. Gebruik de zijkant van de brede opening van een glazen pipet aan het roer de eieren voorzichtig totdat de eieren worden geactiveerd en calcium ionophore oplossing verwijderen.
  12. Controleer de activering efficiëntie nadat eieren op de bodem van het bekerglas settelen. Goed geactiveerd eieren hebben ongeveer 25% van het dier pole en 75% van de vegetal paal.
  13. Wassen van de geactiveerde eieren tweemaal met 50 mL 1 x extract buffer aangevuld met proteaseinhibitors (10 µg/mL elke leupeptin, pepstatin en chymostatin).
  14. Eieren zorgvuldig overbrengen in een 0.4 mL module-cap microtube en vervolgens pak eieren door middel van centrifugeren op 200 x g gedurende 60 seconden en dan 600 x g gedurende 30 seconden.
  15. Verwijder extra buffer op de bovenkant van eieren met behulp van een glazen pipet van Pasteur om de verdunning van de extracten.
  16. Crush eieren bij 15.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  17. Knip de buisjes met een scheermesje te scheiden van de drie lagen van geplette eieren en het ruwe cytoplasma in de middelste laag houden.
  18. Het ruwe cytoplasma overboeken naar nieuwe ultracentrifuge buizen, en aan te vullen met proteaseinhibitors en cytochalasin B 10 µg/ml elke.
  19. Centrifugeer het ruwe cytoplasma weer bij 15.000 x g bij 4° C gedurende 5 minuten naar het cytoplasma verder te zuiveren door het verwijderen van overtollige lipide en eidooier.
  20. Houden van vers bereide extracten op ijs.

3. droplet generatie

  1. 2D glas kamer voorbereiding
    Opmerking: De rechthoek glazen buizen dienen als kamers die de druppels in een één 2-dimensionale vlak beperken, waardoor gemakkelijker observatie en gegevensverzameling.
    1. Snijd rechthoek glazen buizen met een innerlijke dimensie 2 mm x 100 µm in 4 mm lange stukken. Gebruik van de scherpe rand van een whetstone, Markeer de gewenste grenzen aan de buitenkant van de glazen buis met lichte etsen, dan zachtjes druk uitoefenen op beide zijden van de etsen af stukken van glazen buizen te breken.
    2. Verwarm een droge Bad incubator tot 95 ° C. Neem het blok van de verwarming en plaats het in een vacuüm exsiccator van polycarbonaat.
    3. Plaats een microcentrifuge 1,5 mL tube met 30 µL van trichloor (1H 1U, 2U, 2H-perfluorooctyl) silane in het blok van de verwarming. Leg de cut glazen buizen binnen de vacuüm exsiccator op ongeveer 5 cm aan het blok van de verwarming.
    4. De exsiccator verbinden met een vacuümpomp. Inschakelen van de pomp voor 1 minuut om de gewenste vacuüm niveau te bereiken, dan sluit de 3-wegkraan om verzegelen de exsiccator en laat de trichloor (1H 1U, 2U, 2H-perfluorooctyl) silane damp jas van de binnenwand van de glazen buizen. Hierdoor ontstaat een hydrofobe omgeving voor het stabiliseren van de druppels.
    5. Laat de glazen buizen in de exsiccator voor overnachting coating. De buizen zullen klaar zijn voor gebruik de volgende dag.
  2. Druppel generatie en beeldvorming
    Opmerking: De procedures van het genereren van druppels en imaging worden geïllustreerd in cijfers 1B en 1 c
    1. Aanbod uittreksels bereid in stap 2 met 10 ng/µL securin-mCherry mRNA voor de eenvoudige cytoplasmatische alleen-celcyclus experimenten. U kunt ook levering extracten met demembranated sperma chromatine (250 per µL van extract), 10 µM GFP-NLS eiwit en 10 ng/µL securin-mCherry mRNA druppels exposeren periodieke kernen morfologie maken verandert.
    2. In een 1,5 mL microcentrifuge buis voorzien mix 20 µL van extract met recombinant eiwit of mRNA 200 µL van 2% Perfluorpolyether-polyethyleenglycol (PFPE-PEG) fluorosurfactant in HFE7500 gefluoreerde olie.
    3. Genereren van druppels met behulp van een vortex-mixer. Het bereik van druppel grootte kan worden gedifferentieerd door vortex snelheid en duur. U maakt druppels met stralen, variërend van 50 tot 200 µm, de snelheid van de vortex 56 x g (3200 rpm met een straal van 4,9 mm) instellen en zachtjes druk op de microcentrifuge buis met het extract en oppervlakteactieve stof mengsel op de mixer 3,5 seconden. Inspecteer visueel of als de druppels uniform in grootte zijn.
    4. Pipetteer 20 µL gebruiken om de druppels drijvend op de boven- en een gelijk volume PFPE-PEG oppervlakteactieve stof in een PCR-buis. Dompel de glazen buis bereid uit stap in de laag van de druppel in 1,5 mL microcentrifuge buis en wachten tot druppels hebben ingevuld ongeveer 75% van de buis, dan duw de buis naar beneden in de laag van de oppervlakteactieve stof, totdat de buis wordt volledig gevuld. Dit zal verlagen van de dichtheid van de druppel en laat de druppels te vormen van een single layer binnen de kamer zonder overlappende of shape vervorming veroorzaakt door overbevolking.
    5. Vul een glazen bodem schotel met een diameter van 40 mm met minerale olie. Dompel de druppel gevulde buizen in olie door zachtjes het duwen van hen naar beneden met behulp van een fijne pincet.
    6. Na het laden alle monsters, gebruik een glas Pipetteer Schakel eventuele zichtbaar vuil of druppels gelekt. Voeg meer minerale olie als de buizen niet of niet volledig zal worden ondergedompeld in de procedure.
    7. Voeren van beeldvorming van druppels op een epifluorescence Microscoop uitgerust met een gemotoriseerde x-y-stadium (Zie Tabel van materialen). Gebruik een 4 X lucht doelstelling voor alle afbeeldingen. Voor fluorescentie imaging, gebruikt u een 130 W kwik damp korte booglamp zoals fluorescentie lichtbron voor verlichting, en een GFP-filter ingesteld (excitatie 482/35 nm en emissie 514/LP nm) en een mCherry filter (excitatie 562/40 nm en emissie 641/75 nm) voor imaging GFP-NLS en securin-mCherry-signalen.
    8. Time-lapse-video's opnemen op het lichte gebied en meerdere fluorescentie kanalen elke 6 tot en met 9 minuten totdat de druppels verliezen hun activiteit.

4. beeld Processing en Data-analyse

  1. Segmentatie en het bijhouden van druppeltjes
    1. Opgenomen gegevens in de indeling van ".tif" of ".oif" in de software van de analyse van de afbeelding importeren (Zie Tabel van materialen).
    2. Enkele druppels met behulp van de lichte veld kanaal segment. Het beeld helder veld verschijnt druppels als heldere cirkels met donkere grenzen. Drempelmethode toepassen op de afbeelding. Een tracking-oppervlak aan elke druppel toevoegen door het afstemmen van de drempel tussen donkere en lichte pixels, zodat elk oppervlak het gehele gebied van de bijbehorende druppel bestrijkt.
    3. Automatisch bijhouden van de segmenten tussen aangrenzende frames met behulp van het algoritme van de motie autoregressieve. Tune de aanvaardbare reizende afstand van maximaal een druppel tussen twee aangrenzende frames worden kleiner is dan de straal van de meeste druppels kleine druppeltjes nauwgezet kan bijhouden.
    4. Visueel controleren alle tracks in de hele video te detecteren onjuiste segmentaties dat segment de lege ruimte tussen druppeltjes in plaats van de werkelijke druppels. Onjuiste nummers handmatig te verwijderen.
    5. Segment en track achtergrondgebied zonder enige druppels te verkrijgen van de intensiteit van de fluorescentie achtergrond. Aftrekken te verbeteren signaal aan lawaai, achtergrond intensiteit van de intensiteit van de fluorescentie van druppels op elk moment frame.
    6. Gemeten parameters voor elke track na verloop van tijd, met inbegrip van het gemiddelde en de standaarddeviatie van de intensiteit van de fluorescentie en het gebied van de druppel in "CSV"-bestanden exporteren.
  2. Data-analyse van druppel grootte en trilling periode
    1. De ".csv" bestanden laden naar R percelen van de intensiteit van de fluorescentie na verloop van tijd voor elke druppel maken. De ID van de record druppel in een "CSV"-bestand.
    2. De ".csv" bestanden geëxporteerd vanuit de analysesoftware en het "CSV"-bestand met een lijst van druppel ID in Matlab importeren en opslaan als ".mat" bestanden voor verdere gegevensanalyse.
    3. Bereken het volume van een gecomprimeerde droplet op basis van de geëxporteerde druppel gebied informatie nadat segmentatie en de hoogte van de glazen kamer19. Het volume gebruiken voor het berekenen van de straal van de druppel als een bol.
    4. Pak de tijdstippen van pieken en dalen met behulp van piek/dal detectie algoritme. Het uitvoeren van handmatige correcties betreffende de positie van de pieken en dalen om ervoor te zorgen dat ze correct worden gedetecteerd.
    5. Voor het berekenen van de celcyclus periode, de intervaltijd tussen twee aangrenzende toppen te berekenen. Neem het gemiddelde van alle intervallen voor elke druppel als de celcyclus periode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In Figuur 2, laten we zien dat dit protocol mitotische oscillaties in zowel eenvoudige, nucleair-vrije cellen als ingewikkeld cellen met kernen produceert, waar de oscillator de cyclische afwisseling van kernen vorming en vervorming rijdt. De kernen-vrije druppels genereren mitotische oscillaties omhoog aan 30 ongedempte cycli in de tijdsspanne van 92 uur, zoals aangegeven door de periodieke synthese en degradatie van een fluorescentie verslaggever securin-mCherry (figuur 2A). Securin is een substraat van de anafase bevordering van complexe APC/C. De afbraak van securin-mCherry tijdens de anafase geeft dus aan de activiteit van APC/C.

Onderzoek naar het vermogen van de mitotische oscillator rijden downstream mitotische gebeurtenissen, kopen we bovendien demembranated sperma chromatine, gezuiverde groen fluorescent proteïne-nucleaire localisatie signaal (GFP-NLS) en Hoechst 33342 kleurstoffen aan de cytoplasmatische extracten. Figuur 2B toont de autonome afwisseling van verschillende celcyclus fasen, interfase (blauwe staven) en mitose (rode balken), waarin de veranderingen van nucleaire morfologie worden gedreven door de zichzelf onderhoudende mitotische oscillator. Mitotische Afin, dat wil zeggen, het chromosoom decondensation en condensatie gerapporteerd door Hoechst 33342 (figuur 2B, eerste rij), de nucleaire vorming en nucleaire envelop verdeling door GFP-NLS (figuur 2B, tweede rij), en de activiteit van de celcyclus oscillator door de synthese en de aantasting van de securin-mCherry (figuur 2B, derde rij), viel samen met elkaar. Beelden werden verzameld met behulp van time-lapse meerkanaals fluorescentie Microscoop. Onze experimentele resultaten tonen aan dat de gereconstrueerde celcyclus-systeem geschikt is voor een mitotische oscillator van Cdk1 en APC/C, die een reeks downstream gebeurtenissen met inbegrip van de nucleaire envelop verdeling en Reformatie rijden kan, wederopbouw en de wijziging van de morfologie van chromosoom.

Figuur 3 toont de aangegeven door de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie van securin-mCherry voor en na Ruisverwijdering oscillaties. Pieken en dalen werd meer uitgesproken na het verwijderen van het achtergrond lawaai, met name voor de eerste twee oscillaties, die aangeeft dat de Ruisverwijdering kan helpen verbeteren van signaal aan lawaai voor verdere analyse.

Figure 1
Figuur 1. Experimentele procedure voor het genereren van de mitotische cellen druppel gebaseerde. A. cytoplasmatische extracten worden verzameld door middel van ultra-centrifugeren. B. de extracten worden geleverd met meerdere onderdelen ten behoeve van de bijenpopulatie en rapportage mitotische oscillaties. Met behulp van een vortexing methode, zijn de extracten en oppervlakteactieve stof olie voor het genereren van druppels gemengd. C. druppels zijn in een trichloor (1 H 1U, 2U, 2 H-perfluorooctyl) silane-gecoate buis geladen en vervolgens beeld door een epi-fluorescentie Microscoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. De detectie van de celcyclus dynamiek met behulp van fluorescerende verslaggevers. A. het tijdsverloop van de intensiteit van de fluorescentie gemiddelde securin-mCherry van de geselecteerde druppel, die 30 ongedempte trillingen in een loop van 92 uur aangeeft. De figuur invoegen toont de fluorescentie-afbeelding met de geselecteerde druppel omlijst door de witte gestippelde cirkel. De bar van de schaal is 100 µm. B. Tijdreeksen van momentopnamen van een droplet op heldere gebied (de laatste rij) en fluorescentie kanalen (top drie rijen). De cyclische voortgang van de celcyclus klok en de stroomafwaartse mitotische processen gelijktijdig door meerdere TL verslaggevers bijgehouden. De anafase substraat securin-mCherry geeft aan dat de activiteit van de klok regulator APC/C, de Hoescht vlek duidt chromosomale morfologie wijzigingen en het GFP-NLS duidt nucleaire envelop storingen en hervormingen. Nucleaire enveloppen (gemarkeerd met witte pijlen) zijn ook aantoonbaar in de heldere veld beelden, overeenkomen met de lokalisatie van GFP-NLS aangegeven kernen. De bar van de schaal is 50 µm. interfase en mitotische fase worden respectievelijk aangeduid door het blauwe staven en een rode balken boven de afbeeldingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Achtergrond aftrekken voor de gemiddelde fluorescentie intensiteit van securin-mCherry. A. de oscillatie tijdsverloop voordat achtergrond ruis verwijderen. B. de oscillatie tijdsverloop na Ruisverwijdering. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dat maakt het mogelijk in vitro reconstitutie en op lange termijn tracking van zichzelf onderhoudende celcyclus-oscillaties op het niveau van eencellige, hebben wij een nieuwe methode voor het ontwikkelen van een systeem met hoge gegevensdoorvoer kunstmatige cel gepresenteerd. Er zijn verschillende kritische stappen die deze methode succesvol te maken. Eerste, versgeperste Xenopus eieren met een goede kwaliteit, in vergelijking met de vastgestelde eieren, de neiging om extracten te produceren met langduriger trilling activiteit. Ten tweede, inkapseling van extracten binnen de oppervlakteactieve stof-gestabiliseerde microenvironments is cruciaal voor het behoud van de trilling-activiteit. Derde, incubatie van de olie-druppels in een dunne buis grenzen de druppels binnen één laag, waardoor het makkelijker voor beeldverwerking en op lange termijn volgen. Ten vierde, de binnenwand van de buis met trichloor (1H 1U, 2U, 2H-perfluorooctyl) silane coating als een anti-kleeflaag te verlagen van de oppervlakte-energie helpt behouden de extract-activiteit. Ten vijfde, de buizen met olie afdichting zou voorkomen dat druppel stroom. De olie-afdichting-methode kan ook voorkomen dat verdamping en verder behouden de extract-activiteit. Deze verbeteren samen het succestarief van in vitro wederopbouw van robuuste oscillaties in druppeltjes en de nauwkeurigheid van segmentatie en het bijhouden van deze druppels op een lange termijn.

Voor het genereren van microemulsion druppels, hebben we gebruikt zowel een eenvoudig vortexing methode, vergelijkbaar met een paar andere studies29,30,31, evenals de meer algemeen gebruikte microfluidics technieken19, 20 (gegevens niet worden weergegeven). Beide methoden konden genereren met succes micro zodanig hoge gegevensdoorvoer. Een beperking die zijn gekoppeld aan de vortexing-methode is dat de grootte van de druppel niet uniform wordt beheerst. Voor studies die een goed gedefinieerde grootte met geminimaliseerde grootte variatie vereisen, moeten microfluidics technieken worden gebruikt voor een betere controle van de maten van de druppel. Wij hebben hier, de vortexing-methode gekozen over de microfluidic-methode om twee redenen. Ten eerste heeft het eenvoudig en gemakkelijk te volgen procedures, waardoor de labs zonder toegang tot microfluidic technieken of nanofabrication voorzieningen aan te passen deze methode eenvoudig. Ten tweede, de vortexing-methode is meer efficiënt en economisch voor het onderzoeken van grootte afhankelijk gedrag van de oscillator. Het kan een brede verspreiding van druppel grootte genereren met stralen, variërend van enkele micrometers tot 300 micrometers, terwijl de microfluidic techniek kan alleen het genereren van een smalle distributie gecentreerd op een vooraf gedefinieerde grootte. Het bereik van druppel grootte gegenereerd met deze methode komt overeen met het brede scala van cel maten die voortvloeien uit de karakteristieke reductieve celdelingen in het stadium van de splijting van vroege embryo's zoals Xenopus en zebravissen.

De huidige methode is aanzienlijk verbeterd de duurzaamheid van oscillaties en de doorvoer van het analyseren van de dynamiek van de complexe klok, in vergelijking met bestaande methoden voor de bereiding van biologische oscillatoren in goed gemengde bulk oplossing8, 32, die de neiging om snel te produceren gedempt oscillaties. We hebben aangetoond dat deze methode de levensduur van de trillingen van een paar cycli in bulk reactie8 tot meer dan 30 cycli in de communicatie van druppels (figuur 2A) aanzienlijk is verbeterd. Bovendien, bulk reacties gebrek aan de gelijkenis met de daadwerkelijke cel afmetingen en kunnen niet recapituleren de ruimtelijke organisatie bereikt door functionele brandcompartimentering in echte cellen. Deze beperkingen van bulk reacties overwonnen, biedt onze kunstmatige cel-systeem een essentiële platform voor het onderzoeken van uitdagende vragen zoals de cellulaire heterogeniteit en de onzekerheden van oscillatoren, die anders onmogelijk te zijn verkennen.

Bovendien, deze methode biedt flexibiliteit in de mate van complexiteit die cellen kunnen worden gebouwd. Om te voorkomen dat elke inmenging van de ingewikkelde nucleaire dynamiek, kunnen we een minimale, cytoplasmatische alleen-cel-cyclus systeem dat geen kernen bevat reconstrueren. Deze eenvoudige en cytoplasmatische alleen-oscillator vertoont zichzelf onderhoudende oscillaties beduidend beter dan sommige bestaande synthetische oscillatoren. Door het leveren van sperma chromatine, kunnen we ook meer complexe cellen met kernen die afwisselend zelf-assemblage op de interfase en nucleaire vervorming in de mitotische fase op een ritmische wijze reconstrueren. De activiteit van de mitotische oscillator, alsmede de stroomafwaartse nucleaire gebeurtenissen kunnen gelijktijdig gemeten door meerkanaals fluorescentie beeldvorming en eencellige bijhouden.

De methode kan ook een hoge mate van manipulatie in druppel grootte en celcyclus snelheid. De vortexing techniek laat toe voor de generatie van druppels met stralen in een breed scala, die van de studie van de grootte van de cel afhankelijk gedrag van cel cycli profiteren zullen. Daarnaast kan de celcyclus snelheid worden gedifferentieerd door te leveren verschillende concentraties van cycline B1 mRNAs33, waardoor ons te bestuderen van de tunability functie van de celcyclus klok.

Met deze voordelen, de in vitro gereconstrueerd celcyclus platform, waarmee visualisatie, manipulatie en analyse van de dynamiek van de eencellige, zal waarschijnlijk de weg vrijmaken voor nieuwe inzichten in de ingewikkelder stochastisch gedrag van de cel cyclus klok. De methode kan ook worden gegeneraliseerd naar de in vitro studies van andere oscillatoren die traditioneel afhankelijk zijn van bulk reacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Wij hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Madeleine Lu voor de bouw van securin-mCherry plasmide, schoot Man Lee, Kenneth Ho en Allen P Liu voor discussies over druppel generatie, Jeremy B. Chang en James E. Ferrell Jr voor het verstrekken van DAT GFP-NLS construeren. Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (vroege carrière Grant #1553031), de National Institutes of Health (MIRA #GM119688), en een Sloan Research Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
  4. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  5. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  6. Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
  7. Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
  8. Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
  9. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
  10. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
  11. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
  12. Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
  13. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  14. Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  15. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
  16. Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
  17. Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
  18. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
  19. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
  20. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
  21. Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
  22. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
  23. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
  25. Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).
  27. Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  28. Wilson, C. M. Methods in Enzymology. 91, Academic Press. 236-247 (1983).
  29. Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
  30. Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
  31. Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
  32. Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
  33. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).

Tags

Biochemie kwestie 139 mitotische celcyclus onderhoudende zichzelf oscillaties Xenopus laevis Fietsen cel-vrije extracten time-lapse fluorescentie microscopie in vitro eencellige analyse kunstmatige cellen microemulsion
Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije <em>Xenopus</em> ei extracten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., … More

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter