Vi præsenterer en metode for generation af in vitro- selvbærende mitotiske svingninger på én celle niveau af indkapsling æg ekstrakter af Xenopus laevis i vand-i-olie microemulsions.
Real-time målinger af svingninger på én celle-niveau er vigtig at afdække mekanismer i biologiske ure. Selv om bulk ekstrakter forberedt fra Xenopus laevis æg har været magtfulde i dissekere biokemiske netværk bag cellecyklus progression, fører deres ensemble gennemsnit måling typisk til en dæmpet svingning, trods hver enkelte oscillator opretholdes. Dette er på grund af vanskeligheden ved perfekt synkronisering mellem individuelle oscillatorer i støjende biologiske systemer. For at hente den encellede dynamics af oscillatoren, udviklede vi en droplet-baserede kunstige celle system, der kan rekonstruere mitotiske cyklusser i celle-lignende rum indkapsling cykling cytoplasmatisk ekstrakter af Xenopus laevis æg. Disse enkle cytoplasmatisk-kun celler udviser vedvarende svingninger til over 30 cykler. For at bygge mere komplicerede celler med kerner, tilføjet vi demembranated sperm kromatin for at udløse kerner samlesæt i systemet. Vi observerede en periodisk progression af kromosom kondens/decondensation og kerner indhylle opdeling/reformation, ligesom i rigtige celler. Dette indikerer, at den mitotiske oscillator fungerer loyalt for at drive flere downstream mitotiske begivenheder. Vi spores samtidig dynamikken i den mitotiske oscillator og downstream processer i enkelte dråber ved hjælp af multi-kanal time-lapse Fluorescens mikroskopi. Kunstige cellecyklus system giver en høj overførselshastighed ramme for kvantitative manipulation og analyse af mitotiske svingninger med enkelt-celle opløsning, som sandsynligvis giver vigtig indsigt i de lovgivningsmæssige maskiner og funktioner i uret.
Cytoplasmatisk ekstrakter forberedt fra Xenopus laevis æg repræsenterer en af de mest fremherskende modeller for biokemiske studier af celle cyklusser, givet den store mængde af oocytter, hurtig cellecyklus progression og evnen til at retablere mitotiske begivenheder in vitro-1,2. Dette system har tilladt første opdagelse og mekanistiske karakterisering af væsentlige cellecyklus lovgivere som fremme af modning faktor (MPF) samt downstream mitotiske processer herunder spindel forsamling og kromosom adskillelse1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus æg ekstrakter har også været brugt til detaljerede dissektion af de regulerende net af cellecyklus ur8,12,13,14 og for studier af DNA-skader /Replication checkpoint15 og mitotiske spindel forsamling checkpoint16,17,18.
Disse undersøgelser af celle cyklusser ved hjælp af Xenopus æg ekstrakter har primært været baseret på bulk målinger. Konventionelle bulk reaktion assays kan dog ikke efterligne virkelige celle adfærd, givet en større afvigelse i deres dimensioner og subcellulært rumlig opdeling af reaktion molekyler. Derudover er bulk målinger af mitotiske aktiviteter tilbøjelige til at give et begrænset antal cyklusser før hurtigt dæmpning8. Disse ulemper af bulk reaktioner har forhindret ekstrakt system for at give yderligere forståelse af komplekse ur dynamiske egenskaber og funktioner. Nylige undersøgelser har indkapslet celle-fri cytostatiske faktor-anholdt (CSF) Xenopus ekstrakter19,20 i størrelse-defineret celle-lignende rum, som har bidraget til at belyse hvordan spindel størrelse moduleres af den cytoplasmatisk volumen. Men denne i vitro system er anholdt på metafase af meiose II ved hjælp af cytostatiske faktor1, og et system i stand til at langsigtede vedvarende svingninger på én celle-plan er behov for yderligere undersøgelser af cellecyklus oscillator.
For at studere cellecyklus svingninger med enkelt-celle opløsning, har vi udviklet en celle-skala, høj overførselshastighed system til rekonstitution og samtidig måling af flere selvbærende mitotiske oscillerende processer i individuelle microemulsion dråber. I denne detaljerede video protokol viser vi skabelsen af kunstige mitotiske oscillation system af indkapsling cykling Xenopus laevis æg cytoplasma i microemulsions af størrelser spænder fra 10 til 300 µm. I dette system blev mitotiske svingninger herunder kromosom kondens og nedtrapning kondens, nukleare kuvert opdeling og reformationen, og nedbrydning og syntese af anaphase substrater (f.eks. securin mCherry i denne protokol) med held rekonstitueres.
Vi har forelagt en roman metode til at udvikle en høj overførselshastighed kunstige celle system, der gør det muligt for in vitro rekonstitution og langsigtede sporing af selvbærende cellecyklus svingninger på én celle-niveau. Der er flere kritiske trin, der gør denne metode lykkes. Første, friskpresset Xenopus æg med en god kvalitet, sammenlignet med lagt æg, tendens til at producere ekstrakter med længerevarende svingning aktivitet. Andet, indkapsling af ekstrakter inden for de overfladeakt…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Madeleine Lu til at konstruere securin mCherry plasmid, Lap mand Lee, Kenneth Ho og Allen P Liu for diskussioner om droplet generation, Jeremy B. Chang og James E. Ferrell Jr nemlig sørger for normal god landbrugspraksis-NLS konstruere. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (tidlig karriere Grant #1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688), og en Sloan Research Fellowship.
Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher(Ambion) | 12183018A | |
Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |