JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Rekonstituering af cellecyklus svingninger i Microemulsions af celle-fri Xenopus æg uddrag

Published: September 27, 2018
doi:
10.3791/58240
, , , ,
1Department of Biophysics,University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry,University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science,Wayne State University, 4Department of Physics,University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Vi præsenterer en metode for generation af in vitro- selvbærende mitotiske svingninger på én celle niveau af indkapsling æg ekstrakter af Xenopus laevis i vand-i-olie microemulsions.

Abstract

Real-time målinger af svingninger på én celle-niveau er vigtig at afdække mekanismer i biologiske ure. Selv om bulk ekstrakter forberedt fra Xenopus laevis æg har været magtfulde i dissekere biokemiske netværk bag cellecyklus progression, fører deres ensemble gennemsnit måling typisk til en dæmpet svingning, trods hver enkelte oscillator opretholdes. Dette er på grund af vanskeligheden ved perfekt synkronisering mellem individuelle oscillatorer i støjende biologiske systemer. For at hente den encellede dynamics af oscillatoren, udviklede vi en droplet-baserede kunstige celle system, der kan rekonstruere mitotiske cyklusser i celle-lignende rum indkapsling cykling cytoplasmatisk ekstrakter af Xenopus laevis æg. Disse enkle cytoplasmatisk-kun celler udviser vedvarende svingninger til over 30 cykler. For at bygge mere komplicerede celler med kerner, tilføjet vi demembranated sperm kromatin for at udløse kerner samlesæt i systemet. Vi observerede en periodisk progression af kromosom kondens/decondensation og kerner indhylle opdeling/reformation, ligesom i rigtige celler. Dette indikerer, at den mitotiske oscillator fungerer loyalt for at drive flere downstream mitotiske begivenheder. Vi spores samtidig dynamikken i den mitotiske oscillator og downstream processer i enkelte dråber ved hjælp af multi-kanal time-lapse Fluorescens mikroskopi. Kunstige cellecyklus system giver en høj overførselshastighed ramme for kvantitative manipulation og analyse af mitotiske svingninger med enkelt-celle opløsning, som sandsynligvis giver vigtig indsigt i de lovgivningsmæssige maskiner og funktioner i uret.

Introduction

Cytoplasmatisk ekstrakter forberedt fra Xenopus laevis æg repræsenterer en af de mest fremherskende modeller for biokemiske studier af celle cyklusser, givet den store mængde af oocytter, hurtig cellecyklus progression og evnen til at retablere mitotiske begivenheder in vitro-1,2. Dette system har tilladt første opdagelse og mekanistiske karakterisering af væsentlige cellecyklus lovgivere som fremme af modning faktor (MPF) samt downstream mitotiske processer herunder spindel forsamling og kromosom adskillelse1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus æg ekstrakter har også været brugt til detaljerede dissektion af de regulerende net af cellecyklus ur8,12,13,14 og for studier af DNA-skader /Replication checkpoint15 og mitotiske spindel forsamling checkpoint16,17,18.

Disse undersøgelser af celle cyklusser ved hjælp af Xenopus æg ekstrakter har primært været baseret på bulk målinger. Konventionelle bulk reaktion assays kan dog ikke efterligne virkelige celle adfærd, givet en større afvigelse i deres dimensioner og subcellulært rumlig opdeling af reaktion molekyler. Derudover er bulk målinger af mitotiske aktiviteter tilbøjelige til at give et begrænset antal cyklusser før hurtigt dæmpning8. Disse ulemper af bulk reaktioner har forhindret ekstrakt system for at give yderligere forståelse af komplekse ur dynamiske egenskaber og funktioner. Nylige undersøgelser har indkapslet celle-fri cytostatiske faktor-anholdt (CSF) Xenopus ekstrakter19,20 i størrelse-defineret celle-lignende rum, som har bidraget til at belyse hvordan spindel størrelse moduleres af den cytoplasmatisk volumen. Men denne i vitro system er anholdt på metafase af meiose II ved hjælp af cytostatiske faktor1, og et system i stand til at langsigtede vedvarende svingninger på én celle-plan er behov for yderligere undersøgelser af cellecyklus oscillator.

For at studere cellecyklus svingninger med enkelt-celle opløsning, har vi udviklet en celle-skala, høj overførselshastighed system til rekonstitution og samtidig måling af flere selvbærende mitotiske oscillerende processer i individuelle microemulsion dråber. I denne detaljerede video protokol viser vi skabelsen af kunstige mitotiske oscillation system af indkapsling cykling Xenopus laevis æg cytoplasma i microemulsions af størrelser spænder fra 10 til 300 µm. I dette system blev mitotiske svingninger herunder kromosom kondens og nedtrapning kondens, nukleare kuvert opdeling og reformationen, og nedbrydning og syntese af anaphase substrater (f.eks. securin mCherry i denne protokol) med held rekonstitueres.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Michigan. 1. forberedelse af materialer til cellecyklus rekonstitution og påvisning Gibson forsamling kloning til plasmid DNA konstruktion og mRNA rensning af securin-mCherry Forberede tre DNA fragmenter herunder pMTB2 vektor rygraden, securin og mCherry gennem Polymerasekædereaktionen (PCR) og gel rensning21,…

Representative Results

I figur 2viser vi, at denne protokol producerer mitotiske svingninger i både enkle, atomfrit celler samt kompliceret celler med kerner, hvor oscillatoren drev cyklisk skiftevis kerner dannelse og deformation. Fri for kerner dråber generere mitotiske svingninger op til 30 undamped cykler over tidsrum 92 timer, som fremgår af de periodiske syntese og nedbrydning af et fluorescens reporter securin-mCherry (figur 2A). Securin er e…

Discussion

Vi har forelagt en roman metode til at udvikle en høj overførselshastighed kunstige celle system, der gør det muligt for in vitro rekonstitution og langsigtede sporing af selvbærende cellecyklus svingninger på én celle-niveau. Der er flere kritiske trin, der gør denne metode lykkes. Første, friskpresset Xenopus æg med en god kvalitet, sammenlignet med lagt æg, tendens til at producere ekstrakter med længerevarende svingning aktivitet. Andet, indkapsling af ekstrakter inden for de overfladeakt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Madeleine Lu til at konstruere securin mCherry plasmid, Lap mand Lee, Kenneth Ho og Allen P Liu for diskussioner om droplet generation, Jeremy B. Chang og James E. Ferrell Jr nemlig sørger for normal god landbrugspraksis-NLS konstruere. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (tidlig karriere Grant #1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688), og en Sloan Research Fellowship.

Materials

Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
 PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher（Ambion） 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
  4. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  5. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  6. Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
  7. Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
  8. Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
  9. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
  10. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
  11. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
  12. Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
  13. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  14. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  15. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
  16. Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
  17. Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
  18. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
  19. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
  20. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
  21. Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
  22. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
  23. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
  25. Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).
  27. Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  28. Wilson, C. M. . Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).
  29. Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
  30. Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
  31. Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
  32. Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
  33. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).

Tags

Cell-cycle OscillationsXenopus Egg ExtractsMicroemulsionsCell-free SystemMitotic NetworkCell Cycle ClockHigh-throughputQuantitative ManipulationCell ActivationCell LysisCell Extract Preparation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image