Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte
Summary
Wir präsentieren eine Methode zur Erzeugung von in-vitro- autarken mitotischen Schwingungen auf der Ebene der einzelnen Zelle durch Verkapselung Ei Extrakte von Xenopus Laevis in Wasser-in-Öl-Mikroemulsionen.
Abstract
Echtzeit-Messung von Schwingungen auf die einzelne Zelle Ebene ist wichtig, die Mechanismen der biologischen Uhren entdecken. Obwohl Bulk Extrakte aus Xenopus Laevis Eier zubereitet mächtig in biochemischen Netzwerken zugrunde liegt die Zellzyklus Progression seziert wurden, führt deren Ensemble durchschnittliche Messung typischerweise zu einer gedämpften Schwingung, trotz jeder einzelnen Oszillator wird aufrechterhalten. Dies ist aufgrund der Schwierigkeiten der perfekte Synchronisation zwischen einzelnen Oszillatoren in laut biologischer Systeme. Die einzelligen Dynamik des Oszillators abzurufen, entwickelten wir ein Droplet-basierten künstlichen Zellsystem, die mitotische Zyklen in zellähnliche Fächer Verkapselung Radsport zytoplasmatischen Extrakte von Xenopus Laevis Eier rekonstruieren kann. Diese einfachen nur cytoplasmatische Zellen weisen nachhaltige Schwingungen für über 30 Zyklen. Um kompliziertere Zellen mit Kernen zu bauen, haben wir Demembranated Spermien Chromatin Kerne Selbstmontage im System ausgelöst. Wir beobachteten eine periodische Abfolge von Chromosom Kondensation/enttauung und Kerne umhüllen Aufschlüsselung/Reformation wie in realen Zellen. Dies bedeutet, dass der mitotische Oszillator treu dient dazu um mehrere nachgeschaltete mitotischen Ereignisse zu fahren. Wir haben gleichzeitig die Dynamik der mitotischen Oszillator und nachgelagerte Prozesse in einzelnen Tröpfchen mit Multi-Channel-time-lapse-Fluoreszenz-Mikroskopie. Das künstliche Zellzyklus-System bietet einen Hochdurchsatz-Rahmen für quantitative Manipulation und Analyse der mitotischen Schwingungen mit einzelligen Entschließung, die wahrscheinlich wichtige Erkenntnisse über die regulatorischen Maschinen und Funktionen des liefert die Uhr.
Introduction
Zytoplasmatischen Extrakte aus Xenopus Laevis Eier zubereitet repräsentieren eines der vorherrschenden Modelle für die biochemische Untersuchung der Zelle Zyklen, angesichts der großen Anzahl der Eizellen, die schnelle Zellzyklus Progression und die Fähigkeit der Neuaufbau mitotische Veranstaltungen in-vitro-1,2. Dieses System ermöglichte die erste Entdeckung und mechanistischen Charakterisierung der wesentlichen Zellzyklus Regulierungsbehörden wie Förderung der Reifung Faktor (MPF) sowie nachgelagerte mitotische Prozesse einschließlich Montage und Chromosom Segregation1 Spindel ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus -Ei-Extrakte haben auch verwendet worden, für detaillierte Dissektion der regulationsnetzwerke des Zellzyklus Uhr8,12,13,14 und Studien von DNA-Schäden /Replication Checkpoint15 und der mitotischen Spindel Baugruppe Checkpoint16,17,18.
Diese Studien der Zelle Zyklen mit Xenopus -Ei-Extrakte haben hauptsächlich basiert auf Masse Messungen. Jedoch können konventionelle Masse Reaktion Assays nicht echte Zelle Verhalten, gegeben eine große Diskrepanz in ihren Dimensionen und subzelluläre räumliche Abschottung der Reaktion Moleküle imitieren. Darüber hinaus sind lose Messungen der mitotischen Aktivitäten anfällig für eine begrenzte Anzahl von Zyklen vor der Dämpfung schnell8geben. Diese Nachteile der Masse Reaktionen verhindert haben das Extrakt System um weitere Verständnis der komplexen Uhr dynamische Eigenschaften und Funktionen bereitzustellen. Jüngste Studien haben gekapselt zellfreie Zytostatika Faktor verhaftet (CSF) Xenopus extrahiert19,20 in Größe definiert zellähnliche Fächer, die dazu beigetragen haben, aufzuklären, wie Spindel Größe durch moduliert wird die zytoplasmatischen Volumen. Jedoch dieses in-vitro- System ist durch die Wirkung der Zytostatika Faktor1in Metaphase der Meiose II verhaftet, und ein System in der Lage, langfristige nachhaltige Schwingungen auf der Ebene der einzelnen Zelle zur weiteren Untersuchung des Zellzyklus erforderlich Oszillator.
Zellzyklus Schwingungen mit einzelligen Auflösung studieren, entwickelten wir eine Zelle-Skala, Hochdurchsatz-System zur Rekonstitution und gleichzeitige Messung mehrerer selbsttragenden mitotischen oszillierende Prozesse in einzelnen Mikroemulsion Tröpfchen. In diesem ausführlichen video Protokoll zeigen wir die Schaffung eines künstlichen mitotischen Schwingung durch Kapselung von Radsport Xenopus Laevis Ei Zytoplasma in Mikroemulsionen Größen von 10 bis 300 µm. In diesem System wurden mitotische Schwingungen einschließlich Chromosom Kondensation und de-Kondensation, Kernhülle Aufschlüsselung und Reformation, und der Abbau und Synthese von Anaphase Substrate (z. B. securin-mCherry in diesem Protokoll) erfolgreich wieder hergestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben einer neuartigen Methode zur Entwicklung eines künstlichen Zelle Hochdurchsatz-Systems, ermöglicht in Vitro Rekonstitution und langfristige Verfolgung von selbsttragenden Zellzyklus Schwingungen auf der Ebene der einzelligen vorgelegt. Es gibt mehrere wichtige Schritte, mit denen diese Methode erfolgreich. Erste, frisch gepresste Xenopus Eiern mit einer guten Qualität verglichen mit gelegten Eier, tendenziell Extrakte mit länger anhaltende Schwingung Aktivität zu produzieren. Zweitens ist…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Madeleine Lu für den Bau von securin mCherry Plasmid, Runde Mann Lee, Kenneth Ho und Allen P Liu für Diskussionen über Tröpfchen-Generation, Jeremy B. Chang und James E. Ferrell Jr für die Bereitstellung, GFP-NLS zu konstruieren. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation unterstützt (frühe Karriere Grant #1553031), die National Institutes of Health (MIRA #GM119688) und ein Forschungsstipendium Sloan.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
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