सेल-प्रकोष्ठ के Microemulsions में चक्र दोलनों का पुनर्गठन-मुक्त Xenopus Egg अर्क
Summary
हम इन विट्रो में स्व-निरंतर mitotic दोलनों की पीढ़ी के लिए एक विधि वर्तमान में Xenopus laevis के अंडे के अर्क encapsulating द्वारा पानी में तेल microemulsions ।
Abstract
एकल-कक्ष स्तर पर दोलनों का वास्तविक समय मापन जैविक घड़ियों के तंत्र को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि थोक अर्क Xenopus laevis अंडे से तैयार कोशिका चक्र की प्रगति अंतर्निहित जैव रासायनिक नेटवर्क विदारक में शक्तिशाली किया गया है, उनके पहनावा औसत माप आम तौर पर एक नम दोलन करने के लिए सुराग, प्रत्येक के बावजूद व्यक्तिगत थरथरानवाला लगातार किया जा रहा है । यह शोर जैविक प्रणालियों में व्यक्तिगत oscillators के बीच सही तुल्यकालन की कठिनाई के कारण है. थरथरानवाला के एकल सेल गतिशीलता को पुनः प्राप्त करने के लिए, हम एक छोटी बूंद-आधारित कृत्रिम सेल प्रणाली है कि सेल की तरह डिब्बों में mitotic चक्र का पुनर्गठन कर सकते है विकसित Xenopus laevis अंडे की साइकिल चालन cytoplasmic निष्कर्षों encapsulating । इन सरल cytoplasmic केवल कोशिकाओं पर 30 से अधिक चक्र के लिए निरंतर दोलनों का प्रदर्शन । नाभिक के साथ और अधिक जटिल कोशिकाओं का निर्माण करने के लिए, हम demembranated शुक्राणु क्रोमेटिन प्रणाली में नाभिक स्वयं विधानसभा ट्रिगर करने के लिए कहा । हम वास्तविक कोशिकाओं में की तरह गुणसूत्र संघनित्र//विरूपण और नाभिक ढंक टूट/सुधार की आवधिक प्रगति मनाया । यह इंगित करता है कि mitotic थरथरानवाला कार्यों ईमानदारी से कई बहाव mitotic घटनाओं ड्राइव करने के लिए । हम एक साथ बहु चैनल समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर व्यक्तिगत बूंदों में mitotic थरथरानवाला और बहाव की प्रक्रियाओं की गतिशीलता पर नज़र रखी । कृत्रिम कोशिका चक्र प्रणाली मात्रात्मक हेरफेर और एकल सेल संकल्प के साथ mitotic दोलनों के विश्लेषण के लिए एक उच्च प्रवाह ढांचा प्रदान करता है, जो की संभावना नियामक मशीनरी और कार्यों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है घड़ी ।
Introduction
Xenopus laevis अंडे से तैयार Cytoplasmic अर्क कोशिका चक्र के जैव रासायनिक अध्ययन के लिए सबसे प्रमुख मॉडलों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं, अंडाणुओं की बड़ी मात्रा को देखते हुए, तेजी से कोशिका चक्र प्रगति, और पुनर्गठन की क्षमता इन विट्रो मेंmitotic घटनाओं1,2. इस प्रणाली प्रारंभिक खोज और आवश्यक सेल के यंत्रवत लक्षण वर्णन की अनुमति दी है-परिपक्वता को बढ़ावा देने के कारक की तरह चक्र नियामकों (MPF) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बहाव mitotic धुरी विधानसभा और गुणसूत्र अलगाव 1 सहित प्रक्रियाओं ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus egg अर्क भी सेल चक्र घड़ी8,12,13,14 के विनियामक नेटवर्क के विस्तृत विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया गया है और डीएनए क्षति के अध्ययन के लिए /replication चौकी15 और mitotic धुरी विधानसभा चौकी16,17,18।
कोशिका चक्र के इन अध्ययनों Xenopus अंडे के अर्क का उपयोग मुख्य रूप से थोक माप के आधार पर किया गया है । हालांकि, पारंपरिक थोक प्रतिक्रिया परख असली सेल व्यवहार की नकल नहीं कर सकते हैं, उनके आयामों और प्रतिक्रिया अणुओं के उपसेलुलर स्थानिक compartmentalization में एक प्रमुख विसंगति दी । इसके अलावा, mitotic गतिविधियों के थोक माप जल्दी से8भिगोने से पहले चक्र की एक सीमित संख्या देने के लिए प्रवण हैं । बल्क प्रतिक्रियाओं का ये नुकसान जटिल घड़ी गतिशील गुणों और कार्यों के आगे की समझ प्रदान करने के लिए निकालने प्रणाली को रोका है । हाल के अध्ययनों से सेल-मुक्त cytostatic फैक्टर encapsulated है-गिरफ्तार (सीएसएफ) Xenopus अर्क19,20 आकार में परिभाषित सेल-डिब्बों की तरह है, जो मदद की है स्पष्ट कैसे धुरी आकार द्वारा संग्राहक है cytoplasmic मात्रा । हालांकि, इस में इन विट्रो सिस्टम cytostatic फैक्टर1की कार्रवाई द्वारा अर्धसूत्रीविभाजन द्वितीय के metaphase में गिरफ्तार किया है, और एक लंबे समय तक निरंतर दोलनों में सक्षम एक प्रणाली सेल के स्तर पर आगे की जांच के लिए सेल चक्र की जरूरत है थरथरानवाला.
एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ सेल चक्र दोलनों का अध्ययन करने के लिए, हमने एक सेल-स्केल, उच्च-प्रवाह प्रणाली को पुनर्गठन के लिए विकसित किया है और व्यक्तिगत microemulsion में कई स्वयं-निरंतर mitotic थरथरानवाला प्रक्रियाओं का एक साथ माप बूंदों. इस विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल में, हम 10 से ३०० microemulsions को लेकर आकारों के µm में साइकलिंग Xenopus laevis एग कोशिका द्रव्य encapsulating द्वारा कृत्रिम mitotic दोलन प्रणाली के निर्माण का प्रदर्शन करते हैं । इस प्रणाली में, mitotic दोलनों गुणसूत्र संघनित्र और de-संघनित्र, परमाणु लिफाफा टूटने और सुधार, और anaphase सब्सट्रेट (जैसे, securin-mCherry के इस प्रोटोकॉल में) की गिरावट और संश्लेषण शामिल थे सफलतापूर्वक पुनर्गठन किया गया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक उच्च प्रवाह कृत्रिम कोशिका प्रणाली के विकास के लिए एक उपंयास विधि प्रस्तुत किया है कि इन विट्रो में सक्षम बनाता है पुनर्गठन और दीर्घकालिक ट्रैकिंग स्वयं की-निरंतर सेल-चक्र दोलनों पर एकल-कक्ष …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Madeleine लू के निर्माण के लिए धंयवाद securin-mCherry प्लाज्मिड, गोद आदमी ली, केनेथ हो और एलन पी लियू छोटी बूंद पीढ़ी के बारे में विचार विमर्श के लिए, जेरेमी बी चांग और जेंस ई. Ferrell GFP प्रदान करने के लिए जूनियर-एनएलएस का निर्माण । इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अर्ली करियर ग्रांट #1553031), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (मीरा #GM119688), और एक Sloan रिसर्च फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया ।
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
References
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
- Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
- Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
- Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
- Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
- Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
- Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
- Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
- Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
- Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Wilson, C. M. . Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).
- Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
- Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
- Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
- Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).
