Summary

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマル ジョンにおける細胞周期振動の再構成

Published: September 27, 2018
doi:

Summary

油中水マイクロエマル ジョンのアフリカツメガエルの卵抽出液をカプセル化して単一細胞レベルでの細胞分裂自律振動体外の生成法を提案します。

Abstract

単一細胞レベルの振動の実時間測定は、生物時計のメカニズムを明らかにすることが重要です。アフリカツメガエル卵から調製した一括抽出物は、細胞周期の進行を基になる生化学的なネットワークを切り裂くことに強力なされているが、彼らのアンサンブル平均測定が通常にもかかわらずそれぞれの減衰振動につながる個々 の発振器は支えられています。これは騒々しい生物システムで個々 の発振器の間で完全に同期の難しさのためです。発振器の単一細胞ダイナミクスを取得、アフリカツメガエル卵の細胞質抽出物サイクリングをカプセル化細胞のようなコンパートメントで分裂サイクルを再構築できる液滴を利用した人工細胞システムを開発しました。これらの単純型細胞質だけの細胞は、以上 30 サイクルの持続的な振動を展示します。複雑な細胞核を構築するには、我々 は自己組織システムの核をトリガーする鞭毛精子クロマチンを追加しました。私たちは染色体凝縮/decondensation の定期的な進行を観察し、核が実際の細胞のような内訳/改革を包みます。これは細胞分裂の発振器に複数のダウン ストリーム分裂イベントを駆動する忠実に機能することを示します。我々 は同時に分裂の発振器とマルチ チャネル タイムラプス蛍光顕微鏡を用いた個々 のしぶきの下流プロセスのダイナミクスを追跡しました。人工細胞周期システム定量的操作と単一セルの解像度、おそらく規制機械との機能に重要な洞察を提供する分裂振動解析の高スループット フレームワークを提供します。クロック。

Introduction

アフリカツメガエル卵から調製した細胞質のエキスを表す大量の卵母細胞、急速な細胞周期進行および再構成の機能を与え、細胞周期に関する生化学的研究の最も支配的なモデルの一つ分裂イベント体外1,2。初期検索と本質的な細胞周期調節因子の性質を含む下流の分裂プロセスと同様に成熟促進因子 (MPF) 紡錘アセンブリおよび染色体分離1 のようにこのシステムを許可しています。 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10 11アフリカツメガエル卵抽出液は、細胞周期クロック8,12,13,14の調節ネットワークの詳細な解剖、DNA 損傷の研究にも使用されています。/replication チェックポイント15と紡錘アセンブリ チェックポイント16,17,18

アフリカツメガエル卵抽出液を用いた細胞周期のこれらの研究は、一括測定を主にに基づいています。しかし、従来のバルク反応アッセイは寸法、反応分子の細胞内空間区画の大きな矛盾を与えられた本当のセル動作をまねるかもしれない。また、分裂活動の一括測定は8をすばやく減衰する前にサイクルの限られた数を与えることになりやすいです。バルク反応のこれらの欠点は、さらに複雑なクロックの動的プロパティは、関数の理解を提供する抽出システムを妨げています。最近の研究を無細胞 cytostatic 要因逮捕 (CSF)アフリカツメガエルサイズ定義セルのような区画は、によってスピンドルのサイズを調整する方法の解明に貢献しているに19,20を抽出しカプセル化、細胞質の体積。しかし、この生体外でシステムは1は細胞増殖抑制因子との作用により減数分裂 II の中期で逮捕され、単一細胞レベルで長期的な持続的な振動の対応システムが細胞周期の研究の必要発振器。

単一セルの解像度と細胞周期振動の研究、細胞規模、再構成と複数の自律的な核分裂振動プロセスは個々 のマイクロエマル ジョンの同時測定のための高スループット システムを開発しました。水滴。この詳細なビデオ プロトコルでサイクリングアフリカツメガエル卵細胞質に至る 10 300 μ m サイズのマイクロエマル ジョンをカプセル化して人工細胞分裂振動システムの作成を示しています。このシステムは、染色体凝縮と解消凝縮、核膜崩壊と改革と合成と分解の後期基板 (例えば、 securin-mCherry このプロトコルで) を含む分裂の振動だった正常に再構成。

Protocol

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ミシガン大学によって承認されています。 1. 細胞周期の再構成と検出のための材料の準備 ギブソン アセンブリ プラスミド DNA 構築と securin mCherry の mRNA 精製のクローニング PMTB2 ベクター バックボーン、securin、およびポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を mCherry を含む 3 つ?…

Representative Results

図 2でこのプロトコルが複雑な細胞核、発振器が核形成と変形の繰返しの交替をドライブと同様、両方のシンプルで無料の核細胞における有糸分裂振動を生成することを示します。核無料液滴生成細胞分裂の振動を 30 不減衰サイクルに 92 時間の時間にわたって定期的な合成と、蛍光レポーター securin-mCherry (図 2 a) の劣化に…

Discussion

有効の試験管内再構成、単一細胞レベルで自律的な細胞周期振動の長期的な追跡高スループット人工細胞システムを開発するための手法を提案しました。このメソッドが成功するいくつかの重要な手順があります。良い品質で最初、絞りたてのアフリカツメガエル卵は卵と比較して、長く持続振動活動とエキスを生産する傾向があります。第二に、界面活性剤安定化微小内抽出?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

マドレーヌ Lu にありがとう GFP NLS を構築提供するためジェームス e. フェレル ジェレミー B. チャンと液滴生成に関する議論のためのアレン P 劉ケネス Ho ラップ男李 securin mCherry プラスミドを構築します。この作品は全米科学財団によって支えられた (早いキャリア助成金 #1553031)、健康の国民の協会 (ミラ #GM119688) とスローン研究員。

Materials

Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
 PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher(Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

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Cite This Article
Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

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