Rekonstituering i cellen syklus svingninger i mikroemulsjoner Cell-free Xenopus egg ekstrakter
Summary
Vi presenterer en metode for generering av i vitro selvbilde vedvarende mitotisk svingninger på encellede nivå ved å innkapsle egg ekstrakter av Xenopus laevis i vann-i-olje mikroemulsjoner.
Abstract
Sanntids måling av svingninger på encellede nivå er viktig å avdekke mekanismer for biologiske klokker. Selv om bulk ekstrakter forberedt Xenopus laevis egg har blitt kraftig i dissekere biokjemiske nettverk underliggende celle syklus progresjon, fører deres ensemble gjennomsnittlig målingen vanligvis til en dempet oscillation, til tross for hver individuelle oscillator blir vedvarende. Dette skyldes problemer med perfekt synkronisering mellom individuelle oscillatorer i støyende biologiske systemer. For å gjenerverve encellede dynamikken i oscillator, utviklet vi et slippverktøy-basert kunstig celle-system som kan gjeninnføre mitotisk sykluser i celle-lignende rom innkapsle sykling cytoplasmatiske ekstrakter av Xenopus laevis egg. Disse enkle bare cytoplasmatiske cellene utstilling vedvarende svingninger for over 30 sykluser. For å bygge mer komplisert celler med kjerner, lagt vi demembranated sperm chromatin utløse kjerner selvtillit forsamlingen i systemet. Vi observerte en periodisk progresjon av kromosom kondens/decondensation og kjerner innhylle sammenbrudd/reformasjonen, som i ekte celler. Dette indikerer at mitotisk oscillator fungerer trofast for å kjøre flere nedstrøms mitotisk hendelser. Vi spores samtidig dynamikken mitotisk oscillator og nedstrøms prosesser i individuelle dråper med flerkanals time-lapse fluorescens mikroskopi. Kunstig celle-syklusen systemet gir en høy gjennomstrømming ramme for kvantitative manipulasjon og analyse av mitotisk svingninger med encellede oppløsning, som sannsynlig gir viktig innsikt i regulatoriske maskiner og funksjoner klokken.
Introduction
Cytoplasmatiske ekstrakter forberedt Xenopus laevis egg representerer en av de mest dominerende modellene for biokjemiske studier av cellen sykluser, gitt det store volumet av oocytes, rask cellen syklus progresjon og evnen til å gjenoppbygge mitotisk hendelser i vitro1,2. Dette systemet har tillatt første oppdagelsen og mekanistisk karakteristikk av viktige cellen syklus regulatorer som modning-fremme faktor (MPF) samt nedstrøms mitotisk prosesser inkludert vri montering og kromosom raseskille1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus egg ekstrakter har også blitt brukt for detaljert Disseksjon av de regulatoriske nettverkene av13,14 for cellen syklus klokken8,–12,og studier av DNA skade /Replication kontrollpunkt15 og mitotisk spindelen montering checkpoint16,17,18.
Disse studiene av cellen sykluser med Xenopus egg ekstrakter har hovedsakelig vært basert på bulk målinger. Men kan konvensjonelle bulk reaksjon analyser ikke etterligne virkelige celle atferd, gitt et stort avvik i dimensjoner og subcellular romlige compartmentalization av reaksjon molekyler. Videre er bulk målinger av mitotisk aktiviteter liggende å ga et begrenset antall sykluser før raskt demping8. Disse ulempene av bulk reaksjoner ha forhindret ekstrakt systemet for å gi ytterligere forståelse av komplekse klokke dynamiske egenskaper og funksjoner. Nyere studier har innkapslet celle-fri cytostatic faktor-arrestert (CSF) Xenopus ekstrakter19,20 i størrelse brukerdefinert celle-lignende rom, som har bidratt til å belyse hvordan spindel størrelse modulert av den cytoplasmatiske volum. Men i vitro systemet er arrestert på metaphase av meiose II av cytostatic faktor1, og et system i stand til langsiktig vedvarende svingninger på encellede nivå er nødvendig for videre etterforskning av cellen syklus oscillator.
For å studere celle syklus svingninger med encellede oppløsning, har vi utviklet en celle skala, høy gjennomstrømming system for rekonstituering og samtidig måling av flere selvbilde vedvarende mitotisk oscillasjon prosesser i personlige microemulsion dråper. I denne detaljert video protokollen viser vi etableringen av kunstige mitotisk oscillation systemet ved å innkapsle sykling Xenopus laevis egg cytoplasma i mikroemulsjoner i størrelser fra 10 til 300 µm. I dette systemet var mitotisk svingninger inkludert kromosom kondens og de kondens, kjernefysiske konvolutten sammenbrudd og reformasjonen og fornedrelse og syntese av anaphase underlag (f.eks securin mCherry i denne protokollen) vellykket rekonstituert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har presentert en roman metode for å utvikle et høy gjennomstrømming kunstig celle-system som muliggjør i vitro rekonstituering og lang-frist oppsporer av selvbilde vedvarende cellen syklus svingninger på encellede nivå. Det er flere viktige trinn som gjør denne metoden vellykket. Første, nypresset Xenopus egg med god kvalitet, sammenlignet med avslappet egg, tendens til å lage ekstrakter med mer langvarig oscillation aktivitet. Andre er innkapsling av ekstrakter innen surfactant-stabilisert…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Madeleine Lu konstruere securin mCherry plasmider, fanget mann Lee, Kenneth Ho og Allen P Liu for diskusjoner om slippverktøy generasjon, Jeremy B. Chang og James E. Ferrell Jr for å gi GFP-NLS konstruere. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (tidlige karriere Grant #1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688) og en Sloan forskningsstipend.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
References
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
- Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
- Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
- Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
- Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
- Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
- Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
- Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
- Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
- Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Wilson, C. M. . Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).
- Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
- Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
- Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
- Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).
