Beredning av cellcykeln svängningar i mikroemulsioner av cellfria Xenopus ägg extrakt
Summary
Vi presenterar en metod för generering av in vitro- självbärande mitotiska svängningar på enskild cell nivå genom att kapsla in ägg extrakt av Xenopus laevis i vatten-i-olja mikroemulsioner.
Abstract
Realtid mätning av svängningar på enskild cell nivå är viktigt att avslöja mekanismerna av biologiska klockor. Även bulk extrakt beredd från Xenopus laevis ägg varit kraftfull i dissekera biokemiska nätverk bakom Cellcykelprogression, leder deras ensemble genomsnittliga mätning vanligtvis till en dämpad svängning, trots alla enskilda oscillator är ihållande. Detta beror på svårigheten att perfekt synkronisering bland enskilda oscillatorer i bullriga biologiska system. För att hämta encelliga dynamiken i oscillatorn, utvecklat vi ett droplet-baserade konstgjorda cellsystem som kan rekonstruera mitotiska cykler i cell-liknande fack encapsulating cykling cytoplasmiska extrakt av Xenopus laevis ägg. Dessa enkla endast cytoplasmiska celler uppvisar ihållande svängningar för över 30 cykler. För att bygga mer komplicerade celler med kärnor, vi lagt till demembranated spermier kromatin för att utlösa atomkärnor självmontering i systemet. Vi observerade en periodisk progression av kromosom kondens/decondensation och atomkärnor omsluta uppdelning/reformationen, som i riktiga celler. Detta indikerar att den mitotiska oscillatorn fungerar troget för att driva flera nedströms mitotiska händelser. Vi spårade samtidigt dynamiken i den mitotiska oscillator och nedströmsprocesser i enskilda droppar med flerkanaligt time-lapse fluorescensmikroskopi. Konstgjorda cellcykeln-systemet ger en hög genomströmning ram för kvantitativa manipulation och analys av mitotiska svängningar med encelliga upplösning, vilket sannolikt ger viktiga insikter i de föreskrivande maskiner och funktioner av klockan.
Introduction
Cytoplasmiska extrakt beredd från Xenopus laevis ägg representerar en av de mest dominerande modellerna för biokemiska studier av cell cykler, med tanke på den stora volymen av oocyter, den snabba Cellcykelprogression och förmåga beredning mitotiska händelser in vitro-1,2. Detta system har tillåtit första upptäckten och mekanistiska karakterisering av väsentliga cellcykeln-regulatorer som mognad-främjande faktor (MPF) samt nedströms mitotiska processer inklusive spindel montering och kromosom segregation1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus ägg extrakt har också använts för detaljerad dissektion av de regulatoriska nätverk av cellcykeln klockan8,12,13,14 och för studier av de DNA-skadan /Replication checkpoint15 och den mitotiska spindel montering checkpoint16,17,18.
Dessa studier av cell cykler med Xenopus ägg extrakt har främst baserats på bulk mätningar. Konventionella bulk reaktion analyser kan dock inte efterlikna verkliga cellen beteenden, ges en större diskrepans i sina mått och subcellulär rumslig uppdelning av reaktion molekyler. Dessutom är bulk mätningar av mitotiska aktiviteter benägna att ge ett begränsat antal cykler innan snabbt dämpning8. Dessa nackdelar av bulk reaktioner har förhindrat extrakt systemet för att ge ytterligare förståelse av komplexa klocka dynamiska egenskaper och funktioner. Nyligen genomförda studier har inkapslade cellfria cytostatika faktor-greps (CSF) Xenopus extrakt19,20 i storlek-definierad cell-liknande fack, vilket har bidragit till att belysa hur spindeln storlek moduleras av den cytoplasmiska volym. Men detta in vitro -system anhålls på metafas av meios II av cytostatika faktor1och behövs ett system som är kapabel av långsiktigt hållbar svängningar på enskild cell nivå för vidare utredning av cellcykeln oscillator.
För att studera cellcykeln svängningar med encelliga upplösning, har vi utvecklat en cell-skala, hög genomströmning system för beredning och samtidig mätning av flera självbärande mitotiska oscillerande processer i enskilda mikroemulsion droppar. I detta detaljerad video protokoll visar vi skapandet av konstgjorda mitotiska svängning systemet genom att kapsla in cykling Xenopus laevis ägg cytoplasman i mikroemulsioner i storlekar från 10 till 300 µm. I det här systemet var mitotiska svängningar inklusive kromosom kondens och avinstallation kondens, nuclear envelope uppdelning och reformationen, och nedbrytning och syntes av Anaphasen substrat (t.ex. securin-mCherry i detta protokoll) framgångsrikt ombildade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har lagt fram en roman metod för att utveckla en hög genomströmning konstgjorda cellsystem som möjliggör in vitro beredning och långsiktiga spårning av självunderhållande cell-cykel svängningar på enskild cell nivå. I området i närheten finns det flera kritiska steg som gör denna metod framgångsrika. Första, färskpressad Xenopus ägg med en god kvalitet, jämfört med lagda ägg, tenderar att producera extrakt med längre svängning aktivitet. Andra är inkapsling av extrakter inom …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Madeleine Lu för att konstruera securin-mCherry plasmid, varv Man Lee, Kenneth Ho och Allen P Liu för diskussioner om droplet generation, Jeremy B. Chang och James E. Ferrell Jr för att tillhandahålla GFP-NLS konstruera. Detta arbete stöds av National Science Foundation (tidiga karriär Grant nr 1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688) och en Sloan Research Fellowship.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
References
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
- Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
- Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
- Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
- Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
- Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
- Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
- Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
- Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
- Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Wilson, C. M. . Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).
- Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
- Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
- Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
- Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).
