Summary
Detta protokoll ger en metod för att fastställa humaniserade möss (hu-NSG) via intrahepatisk injektion av hematopoetiska stamceller i strålning-villkorade neonatal NSG möss. Hu-NSG musen är mottagliga för HIV-infektion och kombinatoriska antiretroviral kombinationsbehandling (cART) och fungerar som en lämplig patofysiologiska modell för HIV replikation och latens utredningar.
Abstract
Etiska regler och tekniska utmaningar för forskning i människans patologi, immunologi och terapeutisk utveckling har placerat små djurmodeller i hög efterfrågan. Med en nära genetiska och beteendemässiga likheter till människor är små djur som musen bra kandidater för mänskliga sjukdomsmodeller, genom vilka mänskliga-liknande symtom och svaren kan vara återgetts. Vidare kan den mus genetiska bakgrunden ändras för att tillgodose olika krav. Nicka/SCID/IL2rγnull (NSG) musen är en av de mest använda immunsupprimerade mus stammarna; Det tillåter engraftment med mänskliga hematopoetiska stamceller och/eller mänskliga vävnader och den efterföljande utvecklingen av en funktionell människans immunsystem. Detta är en kritisk milstolpe att förstå prognosen och patofysiologin av mänskliga-specifika sjukdomar såsom HIV/AIDS och medhjälp sökandet efter ett botemedel. Häri, rapporterar vi ett detaljerat protokoll för att generera en humaniserad NSG musmodell (hu-NSG) av hematopoetisk stamcellstransplantation till en strålning-villkorade neonatal NSG mus. Hu-NSG musmodell visar flera härstamning utveckling av transplanterade stamceller från mänskliga och känslighet för HIV-1 virusinfektion. Det recapitulates också viktiga biologiska egenskaper som svar på kombinatoriska antiretroviral kombinationsbehandling (cART).
Introduction
Eftersom att upprätta lämpliga djurmodeller för mänskliga sjukdomar är nyckeln till att hitta ett botemedel, har lämpliga djur modeller länge varit eftersträvas och förbättrats över tiden. Flera stammar av immunsupprimerade murina modeller har utvecklats som tillåter engraftment av mänskliga celler eller vävnader och efterföljande utförandet av humaniserad funktioner1,2. Sådan humaniserad musmodeller är kritiska för utredningar av mänskliga-specifika sjukdomar3,4,5.
Förvärvat immunbristsyndrom (AIDS) följd av infektion med humant immunbristvirus (HIV) är ett exempel. Före inrättandet av humaniserad musmodeller enbart etiska och tekniska begränsningar HIV och AIDS prekliniska djurstudier att icke-mänskliga primater3. Dock hindrar de höga kostnader och krav för specialiserad vård för sådana djur HIV och AIDS studier i typiska akademiska inställningar. HIV primärt infekterar humana CD4 + T-celler och påverkar utveckling och immunsvar av andra mänskliga immunceller som B-celler, makrofager och dendritiska celler6; Därför är liten djurmodeller transplanteras med funktionella människors immunförsvar i hög efterfrågan.
Ett genombrott kom 1988, när CB17 -scid möss med en mutation i Prkdcscid utvecklades och visade framgångsrik engraftment av människans immunsystem1. Prkdcscid mutation resultaten i defekt T - och B-cell funktioner och en avlägsnad adaptiva immunsystemet hos möss, varigenom engraftment av människans perifera mononukleära celler (PBMC), hematopoetiska stamceller (Förenta), blod och hematopoetiska fostervävnad7,8. Ändå, låga nivåer av engraftment observeras ofta i denna modell; möjliga orsaker är 1) återstående medfödd immun aktivitet moduleras via naturliga mördarceller (NK)-celler och 2) sent stadium utveckling av musen T - och B-celler (leakiness)5. Den efterföljande utvecklingen av icke-feta diabetiker (nicka)-scid musmodell uppnått dramatiska down-förordning av NK-cells aktivitet; Det är således kunna stödja en högre och mer hållbar engraftment av människans immunsystem komponenter9. Att ytterligare undertrycka eller hindra utveckling av medfödd immunitet, musmodeller med trunkering eller total knockout av interleukin-2 receptor γ-kedjan (Il2rg) (nicka) -scid bakgrund fastställdes. Il2rg, även känd som gemensamma cytokin-receptor γ-kedjan, är en oumbärlig komponent av olika cytokiner receptorer10,11,12,13. Stammar såsom nicka. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) och NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presenterar robust störningar av mus cytokin signalering och fullständig ablation av NK-cells utveckling, i tillägg till svårt nedsatt adaptiv immunitet14,15,16.
Tre humaniserad musmodeller med en scid mutation och Il2rg knockout är ofta anställda i HIV/AIDS forskning: BLT (benmärg/lever/Thymus) modellen, PBL (perifert blod leukocyt) modellen och SRC (SCID återinplantering Cell) modellen 3. the BLT modell skapas via kirurgisk transplantation av mänskliga fostrets lever och tymus under musen njure kapseln tillsammans med intravenös injektion av fostrets lever Förenta3,17,18. BLT musmodell erbjuder hög engraftment effekt, utveckling av mänskliga hematopoetiska celler i alla härstamningar, och inrättandet av en stark människans immunsystem; Dessutom T-cellerna utbildas i en mänsklig autolog bräss och uppvisar HLA-begränsad immunsvar4,5,17,19. Kravet på kirurgiska ingrepp är dock fortfarande den stora nackdelen med BLT modellen. Musmodell PBL upprättas genom intravenös injektion med humana perifera lymfoida celler. PBL modellen erbjuder bekvämlighet och ger framgångsrik T-cells engraftment, men dess tillämpning är begränsad på grund av otillräcklig B-cell och myeloida cell engraftment, låg engraftment nivåer övergripande och uppkomsten av allvarliga graft - versus - host sjukdom (GVHD)3 ,20. SRC musmodell etableras genom injektion av humant Förenta i nyfödda eller unga vuxna SCID möss. Den uppvisar genomsnittliga engraftment effektivitet över 25% (bedömd som perifert blod CD45 procent) och stöder flera-lineage utvecklingen av injicerade Förenta och utarbetandet av en medfödd mänskliga immunsystemet. Begränsning av SRC modellen är dock att den T-cellssvar är mus H2-begränsad istället för mänskliga HLA-begränsad14,21.
SRC musmodell anses en lättköpt och tillförlitlig modell för prekliniska HIV och AIDS små djurstudier, exemplifieras av den konsekvent engraftment människans immunsystem och framgångsrika hematopoetiska utveckling. Vi har tidigare rapporterat inrättandet av en musmodell för NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) och beskrivs dess tillämpning i hivreplikation och latens studier22,23,24. Denna hu-NSG musmodell uppvisar höga nivåer av benmärgen homing, mottagligheten för HIV-infektion, och rekapitulation av HIV-infektion och patogenes. Dessutom hu-NSG musmodell svarar korrekt på kombinatoriska antiretroviral kombinationsbehandling (cART) och recapitulates plasma viral rebound vid vagn uttag, bekräftar upprättandet av en HIV latens reservoar25,26 ,27. Denna HIV latens reservoar bekräftas ytterligare av produktionen av replikering-behöriga HIV virus ex vivo induceras av mänskliga vilande CD4 + T-celler isolerade från infekterade och vagn-behandlade hu-NSG möss.
Häri, beskriver vi de detaljerade protokollet för inrättandet av hu-NSG musmodell från neonatal NSG möss, inklusive förfaranden för behandling av HIV-infektion och vagn för latens utveckling. Vi förväntar oss detta protokoll att erbjuda en ny uppsättning strategier i HIV djurstudier avseende HIV virologi, latens och behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurens vård och förfaranden har utförts enligt protokoll granskats och godkänts av staden av hopp institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) innehas av den ansvariga ledaren för denna studie (Dr John Rossi, IACUC #12034). Mänskliga fostrets levervävnad erhölls från avancerade Bioscience resurser (Alameda, CA), en ideell organisation, i enlighet med federala och statliga förordningar. Leverantören har sina egna institutionella granskning Board (IRB) och är kompatibelt med mänskliga subjektet skyddskrav. Mänskliga PBMC är isolerade från kasserade perifert blod prover från anonym friska donatorer av hopp blod givare centrum (Duarte, CA), med ingen identifiering angående ålder, ras, kön eller etnicitet. IRB #/ REF #: 97071/075546
1. aseptisk allmänmedicin
- Utföra vävnadsodling experiment i utsedda laminär skåp.
- Hålla vävnad odlingsmedium och kosttillskott under sterila förhållanden och filtrera med hjälp av en 0,22 µm filtrering enhet innan du använder.
- Bevara beredda mänskliga Förenta i sterilt rör och hålla på is tills injektionen.
- Till följd av svår immunbrist, hantera NSG möss aseptiskt. Bära en disponibel kirurgi klänning, hår mössa, ansiktsmask, skoskydd och handskar för att förhindra kontaminering. Sanera den bänk yta, bestrålning innehavaren och induktion kammare för anestesi med klor koldioxid baserat steriliserande (t.ex., Clidox) före och efter experiment.
- Applicera petroleum-baserade ögonsalva efter retro-orbital blödning för att undvika torra ögon.
- Ändra till antibiotikum-innehållande kost för att förebygga infektion på grund av retro-orbital blödning.
2. hantera HIV-Virus, infekterade gnagare och virusinnehållande blod/vävnadsprover
Varning: HIV är en klass 3 mänskliga patogenet. hantering reglerna måste följas exakt.
- Hantera HIV virus-innehållande prover i en utsedda BSL2 +/ 3 laboratorium utrymme. Lås virusinnehållande reagenser ordentligt i en sekundär behållare under transport. Desinficera den yttre ytan av alla behållare genom grundlig torka med 10% blekmedel och isopropanol före transport.
- Hålla alla virusinnehållande avfall i utsedda avfallsbehållare med 2-3 lager av biologiskt farligt avfall väskor. Innan avfallshantering, desinficera generöst besprutning avfallet med jod/etoxilerade nonylfenol lösning (t.ex. Wescodyne) och autoklav.
- Använd personlig skyddsutrustning: hår cap, frontplatta, anti splash ansiktsskydd, skoskydd, disponibel kirurgi klänning och dubbla lager handskar.
- Hantera infekterade gnagare med extrem försiktighet. Utföra injektioner och blod samlingar medan möss är under narkos (steg 5.1-5.2, 6,3-6,5, 7,3 och 8.1-8,2).
3. isolering av hematopoetiska stamceller
- Bered kollagenas/dispase för vävnad matsmältningen.
- Lös upp kollagenas/dispase pulver för att göra utgångslösning med en koncentration på 100 mg/mL, och lagra kollagenas/dispase stamlösning i 150 µL alikvoter vid-20 ° C.
- För att arbeta kollagenas lösning, späd 150 µL av kollagenas/dispase lager med 15 mL RPMI 1640 kompletteras med 10% FCS och 1% penicillin/streptomycin.
Obs: Den slutliga koncentrationen av kollagenas/dispase för vävnad matsmältningen är 1 mg/mL.
- Med en steril rakblad, skär levern fostervävnad (16-24 veckor graviditetsveckan) i små bitar (cirka 2-3 mm3 i storlek) följt av matsmältningen med kollagenas/dispase lösning (1 mg/mL) i 30 minuter vid rumstemperatur. Justera volymen på matsmältningen lösning så att alla vävnad bitar är helt nedsänkt. Använd den baksida änden av sprutkolven att försiktigt slipa de vävnadsprov för att underlätta matsmältningen.
- Passera matsmältningen blandningen genom en 70 µm sterila nylon mesh-filter att förvärva en enda cellsuspension.
- Berika för CD34 + Förenta använder ett Mac-system per tillverkarens instruktion.
- Räkna livskraftig andelen berikad CD34 + Förenta använder en hemacytometer28 och vidare till intrahepatisk injektion i neonatal NSG möss.
- Frysa den återstående berikad CD34 + Förenta i frysning media (t.ex., CryoStor CS2) och bevara celler i en tank med flytande kväve. Vid framtida bruk, berätta livskraftig andelen tinade CD34 + Förenta före injektion. Med användning av frysning media, är efter blidvädret bärkraft mellan 80 till 90%.
4. intrahepatisk injektion av mänskliga CD34 + Förenta i Neonatal NSG möss
Obs: Neonatal NSG möss 2-3 dagar från födseln är mest lämpade för detta förfarande, eftersom de är starka nog att uthärda bestrålning på halv-dödlig dos, medan unga nog att helt har nedsatt immunförsvar. Ingen bedövning krävs för HSC injektionen.
- Placera hela kullen av neonatal NSG möss (vanligtvis 5-10 möss, båda könen) i en steril pie-formade bestrålning bur och utsätt för en total dos på 200-250 cGy gamma-ray strålning från en cesium-137 strålkälla. Se till att stråldosen är inom spänna, som betydande viktminskning eller dödsfall kan observeras när NSG möss utsätts för höga doser av bestrålning. 12
Obs: Strålning är en hälsofara, personliga strålskydd ska tas. - Efter bestrålning, injicera varje neonatal NSG-mus med 5 x 105 livskraftiga mänskliga CD34 + Förenta med en spruta nål setup (figur 1). Direkt injicera celler i levern.
5. engraftment validering genom Retro-Orbital blödning och flödescytometri Flödesanalys
- Vid 10-12 veckor post-HSC injektion, söva möss med isofluran syrgas inandning utrustning. Justera syreflödet för att upprätthålla isofluran andel på 4-5%. Anestesi tar 3-5 minuter, beroende på individuella mus. Korrekt sövda möss visar en långsam och djup andningsmönster och ingen reaktion på tå-klämmande stimulering.
- Samla 50-100 µL av perifert blod från varje mus genom retro-orbital provtagning28. Lagra blodprov i K2EDTA eller hepariniserat blod blod insamling rör för att förhindra koagulering.
Obs: Blod insamling rör krävs att blodförtunnande beläggning så att musen PBMC kan isoleras från helblod för flödescytometri Flödesanalys. EDTA är kända för att hämma enzymatiska reaktioner såsom PCR och qRT-PCR. Således, om nedströms enzymatiska reaktioner krävs, Använd en hepariniserad blod insamling apparatur. - Centrifugera blodprov vid 2000 x g i 20 minuter vid 4 ° C till pellet blodkroppar.
- Överföra plasma supernatanterna till nya mikrocentrifugrör efter centrifugering och förvaras vid-80 ° C om cytokin analys krävs.
- Lysera röda blodkroppar (RBC) inom blodkroppar pelleten i rumstemperatur i 10 minuter med röda blodkroppar lyseringsbuffert (Tabell för material).
Obs: Om plasmaprover inte krävs direkt lyse i helblod med Lys lösning utan centrifugering.
- Pellet återstående blodkroppar efter RBC Lys vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C; Aspirera supernatanten. Tvätta cell pellets med 0,01% BSA som innehåller DPBS, Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C och sug ut supernatant. Upprepa steget tvätt en gång.
- Blockera celler med 100 µL av 1 x blockerar cocktail (tabell 3 för recept) i 20 minuter vid 4 ° C.
- Efter blockering, direkt lägga till varje antikropp lösning i cellsuspension vid en koncentration på 2 µL/106 celler och inkubera vid 4 ° C i 30 minuter. Antikroppar för engraftment validering är: anti-humant CD45 (leukocyter, RRID: AB_2732068), anti-humant CD3 (T-celler, RRID: AB_396896), anti-humana CD4 (helper T-celler, RRID: AB_397037), anti-humant CD8 (cytotoxiska T-celler, RRID: AB_2722501), anti-humant CD14 (monocyter, RRID: AB_10373536), och anti-humant CD19 (B-celler, RRID: AB_10373382). För föreslagna flöde panel, se tabell 4 och Tabell av material för katalognummer, RRIDs och partinummer.
Obs: Antikropp färgning i blockering lösning eliminerar icke-specifik bindning av anti-humana antikroppar mot mus yta markörer, som flera ytmarkörer dela homologi mellan människa och mus. - Isolera mänskliga PBMC från friska donatorer och förbereda singel-färgade flöde flödescytometri ersättning kontroller med renat mänskliga PBMC. Alternativt, använda fluorescens-märkta mikrosfärer som ersättning kontroller29.
- Analysera perifert blodproverna med hjälp av en flödescytometer och kvantifiera andelen mänskliga CD45 + celler, mänskliga CD3 + celler, mänskliga CD14 + celler och mänskliga CD19 + celler från totala perifera blodkroppar.
- För nedströms HIV-infektion och latens studier, beräkna procentandelen av CD4 + T-celler och CD8 + T-celler inom de CD3 + cellerna.
Obs: Vanligtvis ett CD4:CD8 förhållande mellan 1.5 och 2.5 observeras före HIV infektion30.
- För nedströms HIV-infektion och latens studier, beräkna procentandelen av CD4 + T-celler och CD8 + T-celler inom de CD3 + cellerna.
6. analys av HIV-infektion av hu-NSG möss och Plasma Viral Load med qRT-PCR
- Sprida HIV BaL viral lager i mänskliga PBMC från friska donatorer, skörda på dag 10 efter infektion och Titrera med p24 ELISA kit31.
- Välj hu-NSG möss med mer än 20% human CD45 + celler i perifert blod för HIV-infektion.
- Söva hu-NSG möss med isofluran syrgas inandning utrustning (steg 5.1).
- Efter att ha bekräftat djur är sövda, injicera HIV BaL viruset på en dos av 200 ng av p24 per mus genom intraperitoneal rutt.
Obs: Var extremt försiktig med nålen, inte återanvända nålar och kassera omedelbart efter användning i utsedda skarpa behållare. Desinficera området injektionsstället efter administrering av virus. - Tre veckor efter infektion, söva hu-NSG möss och samla perifert blod genom retro-orbital blödning med hepariniserad kapillärrör och samling rör.
- Separat plasma och blodkroppar genom centrifugering vid 2000 x g i 20 minuter.
- Lysera röda blodkroppar. Block och fläcken återstående blodkroppar med antikroppar för flödescytometri Flödesanalys (avsnitt 5.3-5,8).
Obs: Flödesanalys flödescytometri bör fokusera på jämföra baserat på CD4:CD8 före och efter infektion. Signifikant minskning av CD4 + cellantal förväntas, som CD4 serverar antigen som en co-receptor för viral inträde. - Användning plasmaprover att analysera HIV viral laddar qRT-PCR. Isolera viral RNA från plasmaprover med en viral RNA mini kit. Utföra qRT-PCR med HIV-1 LTR-specifika primers och sonden uppsättningar (sekvens detaljer i tabell 5), med tillverkarens protokollet.
7. oral administrering av vagn och validering av Viral Suppression (tillval)
Obs: Detta steg är valfritt för undersökningar angående HIV prognos, virologi eller infektionsrelaterade patofysiologi under fasen akut infektion. cART behandling av HIV-infekterade hu-NSG används för att sammanfatta HIV latens bland mänskliga patienter vagn. Framgångsrikt HIV-infekterade hu-NSG möss ges vagn i 4 veckor. Den vagn regimen består av tenofovirdisoproxilfumarat (TDF; 300 mg/kapsel), emtricitabin (FTC; 200 mg/kapsel) och raltegravir (RAL; 400 mg/kapsel). Vagn för behandling av HIV-infekterade hu-NSG möss-dosen justeras enligt kropp yta (tabell 1, ekvation 1, tabell 2)32.
- Beräkna mängden varje medicinering som krävs för varje bur under en vecka efter behandling, med beaktande av volymen av vatten flaskan, antalet möss i varje bur, och en genomsnittlig daglig vattenintag med 4 mL per mus.
Obs: Den centrala punkten i det här steget är att säkerställa att varje mus förvärvar sin dagliga dos inom 4 mL dricksvatten. - Slipa alla tre mediciner med justerade doser till fint pulver och lös upp pulvret blandningen i sötad vatten (t.ex. Medidrop Suralose). Ändra vattenflaskan varje vecka med nymalen upplöst vagn cocktail levereras i sötad vatten.
Obs: Drogen pulvret kan inte lös omedelbart och skaka kraftigt för att uppnå en homogen suspension innan han återvände flaskan till jordbruksföretaget buren. - Samla in perifert blodprover via retro-orbital blödning varannan vecka och analysera båda CD4:CD8 förhållandet med hjälp av flödescytometri (avsnitt 5.3-5,8) och plasma virusbelastningen med qRT-PCR (avsnitt 6.6).
Obs: Vanligtvis efter 4 veckors behandling, plasma viral belastningen minskar till under detektionsgränsen och en typisk CD4:CD8 förhållandet är återställd.
8. validering av Viral Rebound vid vagn uttag (tillval)
Obs: Detta steg är kritisk i validera latens modellen, eftersom viral rebound vid vagn uttag ger direkta bevis för en latens reservoar. Det rekommenderas också att tjäna som en kontroll experiment för terapeutiska undersökningar på HIV rebound dimbildning.
- Planera för vagn tillbakadragande efter plasma virusbelastning från perifert blodprover är under detektionsgränsen och förhållandet CD4:CD8 återställs till ett intervall mellan 1.5 och 2.5.
- Samla perifert blodprover genom retro-orbital blödning varannan vecka efter vagn tillbakadragande. Noga övervaka förändringen i plasma virusbelastning (avsnitt 6.6) samt CD4:CD8 förhållandet (avsnitt 5.3-5,8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flödescytometri Flödesanalys utförs ofta för att validera renheten av isolerade Förenta, utvärdera engraftment nivåer, profil immunsvar mot virusinfektion, och undersökningen vagn effekt. En typisk antikropp panel innehåller 4-6 individuella fluorescently märkt antikroppar; en flödescytometer med flera lasrar och ett brett urval av filter är alltså avgörande för att uppnå korrekta resultat.
För inledande engraftment validering, det mänskliga CD45 + celltalet kan variera från 20% till 80% och delmängder av humana leukocyter ska visas som diskreta populationer på flöde dot-tomten (figur 2). Förhållandet mellan CD4:CD8 vistelser mellan 1.5 och 2.5 för en frisk individ; betydande CD4 + utarmning är vanligtvis observeras vid virusinfektion, vilket ger en lägre procentsats på CD4:CD8; och restaurering av förhållandet frisk observeras vid vagn behandling (figur 3).
qRT-PCR ger en detektionsgräns på 40 RNA kopior/mL plasma. ordentlig utspädningar krävs innan experimentet. Plasma virusbelastning upptäckt använder qRT-PCR under loppet av den infektion och vagn regimen kan plottas och används för att utvärdera effektiviteten av infektion och vagn (figur 4).
Figur 1. Sprutans nål installationsprogrammet används intrahepatisk injektionsvätska.
Skräddarsydda Hamilton 80508 sprutan/nålen inställningen omfattar ett 30-gauge, 51-mm lång nål med avfasade kanter och en spruta med bifogade 50-µL i glas. Maximal injektionsvolym i detta förfarande är 25 µL. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. Flödescytometri flödesdata representerar framgångsrik engraftment och utvecklingen av lymfoida och myeloida celler i perifert blod.
Framgångsrikt beredda perifert blodprover bör ha diskreta befolkningen separationer, och en väl engrafted hu-NSG mus bör ha T-celler, B-cell och monocyt positiva populationer presenteras i perifert blod. Ett CD4:CD8 diagram rekommenderas baserat på beräkningen. en) framgångsrik engraftment visade mer än 25% CD45 + humana leukocyter i perifert blod; diskreta befolkningen i b) B-celler, c) monocyter, d) T-celler bland mänskliga CD45 + leukocyt; e) CD4 + helper T-celler och f) CD8 + cytotoxiska T-celler är väl åtskilda, och g) ger en kvot mellan 1.5 till 2.5 i detta oinfekterade hu-NSG. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. CD4 + antal cellförändringar under loppet av virusinfektion, vagn och kärra återkalla.
Eftersom infektion fortskrider, CD4:CD8 förhållandet minskar från 1,5-2,5 till > 1.0, baserat på CD4:CD8 har delgivits som en klinisk parameter i utvärdera HIV prognos samt behandling efficacies. en) representativa flödesdata som visar förändringen i CD4:CD8 nyckeltal under experimentella; b) jämförelse trenddiagram som visar effektiviteten av vagn, som kan identifieras som återställde andelen CD4 + T-celler. Påvisande av CD4 + T cell sammanräkning av flödescytometri. N: Antal testade möss = 6; Felstaplar: betyder ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001, *** p < 0,0001, ns: ingen signifikant olika. Tvåvägs ANOVA analys är anställd. Figur är omtryckt med tillåtelse22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Ändringar av serum viral RNA kopiera siffror under loppet av virusinfektion, vagn och kärra återkalla
Påvisande av plasma viremi hos HIV-infekterade hu-NSG mössen med qRT-PCR. Det skuggade området anger den tidsperiod under vilken mössen fick vagn (från dag 28 till dag 70 som visas). Detektionsgränsen (indikeras av den streckade linjen) för PCR-analys är (~ 110-160-RNA kopior/mL) i 50 till 80 µL plasma som erhållits genom svansen. Stjärnor (*) anger viral RNA inte upptäcks i vagn behandlade djur vid dag 56. Serum viral RNA kopia nummer analyseras från perifert blodprover serverar som direkta bevis avseende graden av virusinfektion. Det bör i avtalet med CD4 flöde analysen. N: Antal testade möss = 6; Felstaplar: betyder ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001, ns: ingen signifikant olika. Tvåvägs ANOVA analys är anställd. Figur är omtryckt med tillåtelse22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ekvation 1. Dosen översättning baserat på kroppsyta (BSA).
Ekvation för att översätta human dos dosering mot små experimentella djur. Km faktor kan hittas i tabell 2.
| Medicinering | Dygnsdos (mg) |
| Tenofovirdisoproxilfumarat | 300 |
| Emtricitabin | 200 |
| Raltegravir | 800 |
Tabell 1. Dagliga dosen av enskilda läkemedel i vagn regim
| Arter | Vikt (kg) | BSA (m2) | Km faktor |
| Mänskliga | |||
| Vuxen | 60 | 1.6 | 37 |
| Barn | 20 | 0,8 | 25 |
| Mus | 0,02 | 0.0007 | 3 |
Tabell 2. Vikt, BSA och Km faktor diagram för dos konvertering
| Reagens | Volym (µl) * | Slutlig koncentration |
| 0,01% BSA i PBS | 98 | |
| 10 mg/ml mänskliga IgG | 1 | 100 μg/ml |
| 10 mg/ml mus-IgG | 1 | 100 μg/ml |
| 100 | ||
| * Receptet är för en cell prov blockeras i 100 µl blockerande cocktail. Justera volymen med prov nummer. | ||
Tabell 3. Blockerar cocktail för isolerade blodkroppar
| Antikropp | Fluorophore | Ex. Max | EM. Max |
| CD45 | BB515 | 490 nm | 515 nm |
| CD3 | PE-Cy7 | 496 nm | 785 nm |
| CD4 | Pacific Blue | 401 nm | 452 nm |
| CD8 | BUV395 | 348 nm | 395 nm |
| CD14 | APC-Alexa 750 | 650 nm | 774 nm |
| CD19 | PE | 496 nm | 578 nm |
Tabell 4. Föreslagna flerfärgade flöde panel
| Forward Primer | 5'-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTG-3 ' | |||
| Reverse Primer | 5'-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3 ' | |||
| Sonden * | 5'-AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTAGTGTTGACT-3 ' | |||
| * 5'-FAM, 3'-svart hål Quenche 1 | ||||
Tabell 5. HIV-1 LTR Primers och sond
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunsupprimerade möss rekonstituerades med mänskliga celler/vävnad människoliknande fysiologiska egenskaper och är ett enormt värde för patologi, patofysiologi och immunologi studier rörande mänskliga-specifika sjukdomar. Bland flera stammar av immunsupprimerade möss, nicka. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) modellen är den mest nedsatt immunförsvar på grund av dess brist på både medfödd och adaptiv immunitet, liksom avlägsnad mus-specifika cytokin signalering3,12,19 . Därför NSG möss har använts flitigt i processen humanisering och det är väletablerat att mänskliga celler återbefolka i murina perifert blod, lymfoida och myeloisk vävnader, och att möss uppvisar lämpliga mänskliga immunsvaret mot infektiös stimuli såsom HIV27,33.
På grund av värd begränsningen av HIV var prekliniska djurstudier av HIV virologi och infektion prognos tidigare begränsad till icke-mänskliga primater infekterade med simian immunodeficiency virus (SIV, den icke-mänskliga primater versionen av HIV)3. Vetenskapliga framsteg i stamcellsforskningen och generering av NSG möss har öppnat upp möjligheten att bedriva HIV forskning på små murina djur med lägre kostnad och snabbare experimentella omsättning. För närvarande kan NSG humanisering uppnås genom transplantation av 1) fostervävnad och mänskliga Förenta (BLT modell), 2) mänsklig PBMC (PBL modell) och 3) mänsklig Förenta (SRC-modell). BLT modellen erbjuder den högsta engraftment effektivitet samt omfattande utveckling av både lymfoida och myeloida funktioner34,35, men är tekniskt krävande. PBL modellen är det mest praktiskt att upprätta men har en kort experimentella fönster vid engraftment följd av GVHD; Dessutom det endast erbjuder anständigt perifera T-cell svar och saknar lymfoida och myeloisk utveckling. Av dessa skäl har anställt vi SRC modellen i detta protokoll, med anpassningar för att uppfylla kraven för HIV utredningar. Hu-NSG modellen är helt saknar immunförsvar och effektiva på benmärgen homing på strålning och transplantation; Dessutom kan viral utmaning och efterföljande undersökningar vid en yngre ålder, att undvika utvecklingen av åldersrelaterad patologiska problem känt att nicka stam bakgrunden. Även om T-celler i hu-NSG modellen utbildas i en mus thymic miljö och är endast H2-begränsad, kan flera, om inte alla delmängder av mänskliga immunceller utvecklas i och kolonisera mus myeloiska och lymfoida organ. Märkbart, bereds gut-associerade lymfoida vävnad av hu-NSG modellen också med mänskliga immunsystemet celler; Denna modell kunde således potentiellt stödja HIV slemhinnor överföring, liknar den BLT modell22,23.
En av de stora hindren att utrota HIV är förekomsten av en latens reservoar bland patienter behandlade med suppressiv vagn33,36,37,38,39. Latent infekterade celler förbli quiescent, och bidra till HIV viral rebound vid vagn uttag. Latens reservoarer finns anatomiskt i levern, mjälten, hjärnan och andra lymfoida vävnader, och främst består av minne CD4 + T-celler36,40,41. Som rapporterats av vår grupp, stöder hu-NSG modellen utveckling av T-cell härstamning, vilket gör den lämplig för patologiska modellering av HIV latens. Vi visade att denna modell är mycket mottagliga till virusinfektion och därefter till den vagn regimen via oral administrering. Dramatiska viral rebound uppstår omedelbart vid vagn tillbakadragande, som helt stöder existensen av en latens reservoar. Latent infekterade minne CD4 + T-celler kan isoleras från lymfoida organ i HIV-infekterade hu-NSG under vagnen och viral utväxt analyser sammanfatta viral rebound ex vivo41. Hu-NSG modellen och den HIV infektion/vagn regim beskrivs i detta protokoll alltså breda tillämpningar inom områden relaterade till HIV virologi, infektion prognos, latens patofysiologi och antiretrovirala therapeutics utveckling.
Hu-NSG musmodell i detta protokoll kräver bestrålning och intrahepatisk injektion av Förenta på dag 2-3 efter födseln; Därför krävs egen avel och särskilda villkor. Även om neonatal HSC transplantation ger generellt hög engraftment effektivitetsvinster, i vissa fall kan svår GVHD uppstå. I vissa fall en signifikant minskning av perifera CD45 + cellantal kan observeras vid infektion, och i extrema förhållanden, perifert blod CD45 + utarmning kan observeras; blodanalys insamling och flöde flödescytometri kan därför vara utmanande. En av de stora begränsningarna av denna hu-NSG musmodell ligger inom den chimära naturen av dess T-celler. T-celler i hu-NSG musmodell utbildas inom mus thymic miljön och är H2-begränsad istället för att HLA-begränsad; full rekapitulation av de dynamiska förändringarna av T-cell delmängder vid infektion är därför mindre sannolikt. Ytterligare, även om hu-NSG musmodell uppvisar bra känslighet för HIV-1 infektion, observerade plasma virusbelastningen kan understiga several-fold i BLT modellen, möjligen på grund av incomprehensive beredning av mänskliga lymfoida och myeloida funktioner.
Sammanfattningsvis erbjuder hu-NSG musen skildras i detta protokoll en enkel och effektiv metod för att generera en humaniserad musmodell för HIV virologi och latens studier, som ett alternativ till BLT modellen. Trots dess begränsningar i omfattande lymfoida och myeloida utveckling, har hu-NSG modellen bevisats mottagliga för infektion och lyhörd varukorg behandling eller andra therapeutics22,23,24. Latens patologi modellen etablerad enligt detta protokoll rekapitulerande HIV viral rebound i vivo och latent infekterade minne CD4 + T-celler kan vara ytterligare isolerade för ytterligare utredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna avslöja inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health [bidrag nummer R01AI29329, R01AI42552 och R01HL07470 till J.J.R.] och National Cancer Institute of National Institutes of Health [licensnummer P30CA033572 att stödja staden av hopp Interactive Genomics Analytisk farmakologi och analytiska flödescytometri kärnor]. Följande reagens erhölls genom NIH aidsforskning och referens reagens Program, uppdelning av AIDS, NIAID, NIH: HIV BaL virus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
| CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
| IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
| Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
| Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
| Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
| Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
| Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
| Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
| QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
| TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
| HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
| IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
| APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
| PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |
References
- Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
- Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
- McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
- McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
- Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
- King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
- Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
- Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
- Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
- Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
- Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
- Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O'Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
- Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
- Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
- van't Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
- Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
- Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
- Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
- Chun, T. -W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
- Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
- Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).
