Summary
Questo protocollo fornisce un metodo per stabilire topi umanizzati (hu-NSG) tramite iniezione intraepatica di cellule staminali ematopoietiche umane nella radiazione-condizionato topi NSG neonatali. Il mouse di hu-NSG è suscettibile di infezione da HIV e combinatorio antiretrovirale di combinazione (cART) e serve come un modello fisiopatologico adatto per le indagini di replica e la latenza di HIV.
Abstract
Norme etiche e sfide tecniche per la ricerca in patologia umana, immunologia e sviluppo terapeutico sono collocati piccoli modelli animali in forte domanda. Con una stretta somiglianza genetica e comportamentale agli esseri umani, piccoli animali come il mouse sono buoni candidati per i modelli di malattia umana, attraverso il quale possono essere ricapitolate le risposte e umano-come i sintomi. Ulteriormente, il background genetico del mouse possa essere modificato per soddisfare le diverse esigenze. Il mouse NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) è uno dei più utilizzati ceppi di topo immunocompromessi; Esso consente di attecchimento con cellule staminali ematopoietiche umane e/o tessuti umani e lo sviluppo successivo di un funzionale sistema immunitario umano. Questo è un traguardo fondamentale nella comprensione della prognosi e la fisiopatologia delle malattie umane specifiche quali l'HIV/AIDS e favorendo la ricerca di una cura. Qui, segnaliamo un protocollo dettagliato per la generazione di un modello di topo umanizzato NSG (hu-NSG) da trapianto di cellule staminali ematopoietiche in un mouse NSG neonatale e radiazione-condizionati. Il modello di mouse hu-NSG illustra lo sviluppo multi-stirpe di cellule staminali umane trapiantate e suscettibilità all'infezione virale di HIV-1. Esso riassume anche chiave caratteristiche biologiche in risposta alla terapia antiretrovirale combinatoria (cART).
Introduction
Perché stabilire idonei modelli animali di malattie umane è la chiave per trovare una cura, modelli animali appropriati sono stati a lungo perseguiti e migliorati nel tempo. Più ceppi di modelli murini immunocompromessi sono stati sviluppati che permettono l'attecchimento di cellule umane e/o tessuti e la successiva esecuzione di funzioni umanizzato1,2. Tali modelli umanizzato del topo sono fondamentali per le indagini di malattie umane specifiche3,4,5.
Sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) derivando dall'infezione con il virus di immunodeficenza umana (HIV) è un esempio. Prima della creazione di modelli murini umanizzati, limitazioni etiche e tecniche confinati gli studi sugli animali preclinici di HIV/AIDS a primati non umani3. Tuttavia, le alte spese e requisiti per cure specialistiche per tale animale ostacolano gli studi di HIV/AIDS nel tipici ambiente accademico. HIV soprattutto infetta CD4 + T-cellule umane e impatta lo sviluppo e le risposte immunitarie di altre cellule immuni umane quali linfociti B, macrofagi e cellule dendritiche6; di conseguenza, piccoli modelli animali trapiantati con funzionale del sistema immunitario umani sono in forte domanda.
Una svolta è arrivata nel 1988, quando CB17 -scid topi con una mutazione di Prkdcscid sono stati sviluppati e ha mostrati il riuscito engraftment del sistema immunitario umano1. I risultati di mutazione Prkdcscid nelle funzioni a cellula T e B difettosa e un sistema immunitario adattativo ablato in topi, consentendo l'attecchimento del periferico umano cellule mononucleari (PBMCs), cellule staminali ematopoietiche (HSCs), del sangue e tessuti ematopoietici fetali7,8. Ciò nonostante, i bassi livelli di attecchimento sono osservati frequentemente in questo modello; le cause possibili sono 1) residua attività immunitaria innata modulata tramite natural killer (NK)-cellule e 2) il fase avanzata di sviluppo del mouse T - e B-cellule (permeabilità)5. Lo sviluppo successivo dei diabetici non obesi (NOD)-modello del toposcid raggiunto drammatico giù-regolamento dell'attività delle cellule NK; così, è in grado di supportare un livello superiore e attecchimento più sostenibile del sistema immunitario umano componenti9. Ad ulteriori sopprimere o ostacolare lo sviluppo dell'immunità innata, modelli di mouse tenendo troncamento o KO totale della interleuchina 2 recettore γ-catena (Il2rg) (NOD) - sfondo discid sono stati stabiliti. Il2rg, noto anche come comune citochina-recettore γ-catena, è una componente indispensabile di varie citochine recettori10,11,12,13. Ceppi come cenno del capo. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) e NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presentare robusta rottura del mouse cytokine signaling e ablazione completa dello sviluppo della NK-cellula, in oltre a grave compromissione della risposta immunitaria adattativa14,15,16.
Tre modelli di mouse umanizzato recanti un scid mutazione e Il2rg knockout sono frequentemente impiegati nella ricerca sull'HIV/AIDS: il modello di BLT (midollo osseo/fegato/timo), il modello PBL (leucociti di sangue periferico) e il modello SRC (SCID Repopulating cella) 3. the BLT modello viene creato tramite il trapianto chirurgico del fegato fetale umano e timo sotto la capsula del rene del mouse accompagnato con l'iniezione endovenosa del fegato fetale HSCs3,17,18. Modello del topo BLT offre engraftment alta efficacia, sviluppo delle cellule ematopoietiche umane in tutte le stirpi e istituzione di un forte sistema immunitario umano; Inoltre, le cellule T sono istruite in un timo umano autologo e mostrano HLA-restricted risposte immunitarie4,5,17,19. Tuttavia, il requisito per le procedure chirurgiche rimane il principale svantaggio del modello BLT. Modello del topo PBL è stabilito tramite l'iniezione endovenosa con cellule linfoidi periferiche umane. Il modello PBL offre convenienza e produce riuscito engraftment delle cellule T, ma la sua applicazione è limitata a causa della insufficiente della B-cellula ed engraftment delle cellule mieloidi, attecchimento basso livelli complessivi e l'insorgenza della malattia di grave dell'innesto - contro - ospite (GVHD)3 ,20. Modello del topo SRC viene stabilito tramite iniezione di HSCs umano nel neonato o giovani adulti topi SCID. Si esibisce engraftment media efficienza superiori al 25% (valutato come sangue periferico CD45 percentuale) e supporta lo sviluppo di multiplo-stirpe di HSCs iniettato e l'elaborazione di un sistema immunitario umano innato. Tuttavia, la limitazione del modello SRC è che la risposta a cellula T è mouse H2-limitati invece umani HLA-restricted14,21.
Modello del topo SRC è considerato un modello affidabile e facile per l'HIV/AIDS piccolo animali studi preclinici, esemplificato dal engraftment coerenza di un sistema immunitario umano e positivo sviluppo ematopoietico. Precedentemente abbiamo segnalato l'istituzione di un modello murino di NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) e descritto la sua applicazione nella replicazione dell'HIV e latenza studi22,23,24. Questo modello del topo di hu-NSG presenta alti livelli di homing di midollo osseo, suscettibilità all'infezione da HIV e ricapitolazione dell'infezione da HIV e patogenesi. Inoltre, il modello del mouse di hu-NSG risponde in modo appropriato alla terapia antiretrovirale combinatoria (carrello) e ricapitola il rebound virale del plasma al momento del ritiro del carrello, confermando l'istituzione di un HIV latenza serbatoio25,26 ,27. Questo serbatoio di latenza di HIV è suffragato dalla produzione di replica-competente di virus HIV ex vivo indotta da umani CD4 + T-cellule isolate da topi infetti e carrello-trattati hu-NSG di riposo.
Qui, descriviamo il protocollo dettagliato per l'istituzione del modello del topo di hu-NSG dai topi NSG neonatali, incluse le procedure relazionate al trattamento dell'HIV infezione e carrello per lo sviluppo di latenza. Ci aspettiamo che questo protocollo per offrire una nuova serie di approcci in studi su animali per quanto riguarda l'HIV virologia, latenza e trattamento HIV.
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Protocol
Tutti cura degli animali e le procedure sono state eseguite secondo protocolli esaminati e approvati dalla città della speranza istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) tenuto dal ricercatore principale di questo studio (Dr. John Rossi, IACUC n. 12034). Tessuto epatico fetale umano è stato ottenuto da Advanced Bioscience risorse (Alameda, CA), un'organizzazione senza scopo di lucro, in conformità alle norme federali e statali. Il fornitore ha la propria Institutional Review Board (IRB) ed è conforme ai requisiti di protezione del soggetto umano. Essere umano PBMCs sono isolati da campioni di sangue periferico scartati da anonimi donatori sani da City of Hope sangue donatore Center (Duarte, CA), senza identificazione per quanto riguarda età, razza, sesso o etnia. IRB #/ REF #: 97071/075546
1. generale pratica asettica
- Esperimenti di coltura del tessuto in area a flusso laminare.
- Mantenere il mezzo di coltura tissulare e supplementi in condizioni sterili e del filtro utilizzando un priore di unità di filtrazione da 0,22 µm da utilizzare.
- HSC umane preparati in provette sterili di preservare e conservare il ghiaccio fino ad iniezione.
- A seguito di grave immunodeficienza, gestire topi NSG asetticamente. Indossare un camice monouso chirurgia, capelli cap, maschera viso, copriscarpe e guanti per prevenire la contaminazione. Disinfettare la superficie del banco, titolare di irradiazione e camera di induzione di anestesia con sterilizzante di basato sul biossido di cloro (per esempio, Clidox) prima e dopo gli esperimenti.
- Applicare l'unguento a base di petrolio degli occhi dopo retro-orbitale sanguinamento per evitare secchezza degli occhi.
- Cambiare a contenenti antibiotico dieta per prevenire l'infezione dovuto spurgo retro-orbitale.
2. il trattamento HIV Virus, infetta roditori e campioni di sangue/tessuto contenenti Virus
Attenzione: L'HIV è un patogeno umano di classe 3; le regole di manipolazione devono essere seguite esattamente.
- Gestire i campioni contenenti virus HIV in un area BSL2 + spazio-laboratorio 3. Bloccare virus contenenti i reagenti in modo sicuro in un contenitore secondario durante il trasporto. Disinfettare la superficie esterna di tutti i contenitori strofinando approfondita con candeggina al 10% e isopropanolo prima del trasporto.
- Mantenere tutti i rifiuti contenenti virus in appositi contenitori dei rifiuti con 2-3 strati di sacchetti di rifiuti a rischio biologico. Prima dello smaltimento dei rifiuti, disinfettare spruzzando generosamente i rifiuti con soluzione di iodio/etossilati nonilfenolo (ad es., Wescodyne) e autoclave.
- Indossare indumenti protettivi: capelli cap, copertura del fronte, visiera antispruzzo, copriscarpe, Abito da intervento chirurgico monouso e guanti doppio strato.
- Gestire i roditori infetti con estrema cautela. Condurre le iniezioni e le raccolte di sangue, mentre i topi sono sotto anestesia (passi 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3 e 8.1-8.2).
3. isolamento di cellule staminali ematopoietiche
- Preparare la soluzione di collagenasi/dispase per digestione del tessuto.
- Sciogliere la polvere di collagenasi/dispase per rendere la soluzione di riserva ad una concentrazione di 100 mg/mL e memorizzi soluzione stock collagenasi/dispase nelle 150 µ l aliquote a-20 ° C.
- Per l'utilizzo di soluzione della collagenosi, diluire 150 µ l di brodo di collagenasi/dispase con 15 mL di RPMI 1640 completati con 10% FCS e 1% di penicillina/streptomicina.
Nota: La concentrazione finale di collagenasi/dispase per digestione del tessuto è 1 mg/mL.
- Con una lama di rasoio sterile, tagliare il tessuto del fegato fetale (16-24 settimane di gestazione) in piccoli pezzi (circa 2-3 mm3 dimensioni) seguito da digestione con soluzione di collagenasi/dispase (1 mg/mL) per 30 minuti a temperatura ambiente. Regolare il volume della soluzione di digestione in modo che tutti i pezzi di tessuto sono completamente sommerse. Utilizzare il back-end dello stantuffo della siringa per macinare delicatamente il campione di tessuto per facilitare la digestione.
- Passare il composto di digestione attraverso un filtro sterile nylon 70 µm per acquisire una sospensione unicellulare.
- Arricchire per CD34 + HSCs utilizzando un sistema Mac secondo istruzioni del produttore.
- Contare la percentuale valida di arricchito CD34 + HSCs utilizzando un emocitometro28 e procedere all'iniezione intraepatico in topi NSG neonatali.
- Congelare il restante arricchito CD34 + HSCs in media (ad es., CryoStor CS2) di congelamento e preservare le cellule in un serbatoio di azoto liquido. Al momento utilizzo futuro, raccontano la percentuale valida di scongelati CD34 + HSCs prima dell'iniezione. Con l'uso di media di congelamento, post-disgelo attuabilità è tra 80-90%.
4. intraepatica iniezione di umane CD34 + HSCs nei topi NSG neonatale
Nota: Topi NSG neonatale 2-3 giorni dalla nascita sono più adatti per questa procedura, così come sono abbastanza forte da sopportare l'irradiazione alla dose metà-letale, mentre i giovani abbastanza per totalmente hanno alterato il sistema immunitario. Nessun'anestesia è richiesta per l'iniezione di HSC.
- Posizionare l'intera cucciolata di topi NSG neonatali (in genere 5-10 topi, entrambi i sessi) in una gabbia di irradiazione a forma di torta sterile ed esporre ad una dose totale di 200-250 cGy gamma-ray radiazioni da una sorgente di radiazione di cesio-137. Garantire che quella dose di radiazione è all'interno della gamma, come perdita di peso significativa o anche la morte può essere osservata quando NSG topi sono esposti ad alte dosi di irradiazione. 12
Nota: La radiazione è un pericolo per la salute, protezione personale contro le radiazioni deve essere assunto. - A seguito di irradiamento, iniettare ogni mouse NSG neonatale con 5 x 105 vitali umane CD34 + HSCs utilizzando una configurazione di ago/siringa (Figura 1). Direttamente iniettare le cellule nel fegato.
5. engraftment convalida attraverso Retro-orbitale sanguinamento e analisi di citometria a flusso
- Al sito di iniezione di 10-12 settimane post-HSC, anestetizzare topi facendo uso di un apparecchio di inalazione isoflurane/ossigeno. Regolare il flusso di ossigeno per mantenere la percentuale di isoflurano a 4-5%. L'anestesia dura 3-5 minuti, a seconda dei singoli mouse. Adeguatamente anestetizzati topi mostrano un lento e modello di respirazione profonda e nessuna reazione alla stimolazione toe-pizzicamento.
- Raccogliere 50-100 µ l di sangue periferico da ogni mouse attraverso retro-orbitale campionamento28. Conservare i campioni di sangue in K2EDTA o tubi di raccolta sangue eparinizzato per impedire la coagulazione.
Nota: Provette per prelievo ematico sono tenuti ad avere il rivestimento dell'anticoagulante affinché PBMCs del mouse possono essere isolate da sangue intero per l'analisi di citometria a flusso. EDTA è conosciuto per inibire le reazioni enzimatiche quali PCR e qRT-PCR; così, se le reazioni enzimatiche a valle sono necessarie, utilizzare un apparato di raccolta di sangue eparinizzato. - Centrifugare i campioni di sangue a 2.000 x g per 20 minuti a 4 ° C per agglomerare le cellule del sangue.
- Trasferire i surnatanti di plasma in nuove provette microcentrifuga dopo centrifugazione e conservare a-80 ° C se è richiesta l'analisi di cytokine.
- Lisare gli eritrociti (globuli rossi) entro il pellet di cellule del sangue a temperatura ambiente per 10 minuti utilizzando il Buffer di lisi di globuli rossi (Tabella materiali).
Nota: Se i campioni di plasma non sono necessari, lisare direttamente il sangue intero con soluzione di lisi senza centrifugazione.
- Pallina restante globuli dopo lisi RBC a 300 x g per 5 minuti a 4 ° C; aspirare il supernatante. Lavare il pellet cellulare con 0,01% BSA contenente DPBS, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
- Bloccare le cellule con 100 µ l di 1 x blocco cocktail (tabella 3 per ricetta) per 20 minuti a 4 ° C.
- Dopo il blocco, direttamente aggiungere ogni soluzione di anticorpo in sospensione delle cellule ad una concentrazione di 2 µ l/106 cellule e incubare per 30 minuti a 4 ° C. Gli anticorpi per la convalida di attecchimento sono: anti-umani CD45 (leucociti, RRID: AB_2732068), anti-umano CD3 (T-cellule, RRID: AB_396896), anti-umani CD4 (helper T-cellule, RRID: AB_397037), anti-umani CD8 (cellule T citotossiche, RRID: AB_2722501), anti-umani CD14 (monociti, RRID: AB_10373536) e anti-umano CD19 (B-cellule, RRID: AB_10373382). Per pannello di flusso suggerito, vedere tabella 4 e Tabella materiali per i numeri di catalogo, RRIDs e numeri di lotto.
Nota: Macchiatura dell'anticorpo nella soluzione di blocco Elimina il legame non specifico degli anticorpi anti-umani verso gli indicatori di superficie del mouse, come diversi marcatori di superficie condividere omologia tra umano e del mouse. - Isolare l'essere umano PBMCs da donatori sani e preparare tinto singolo flusso cytometry compensazione controlli utilizzando PBMCs umano purificato. in alternativa, utilizzare microsfere di fluorescenza-etichettato come compensazione controlli29.
- Analizzare i campioni di sangue periferico utilizzando un citometro a flusso e quantificare la percentuale di umane cellule CD45 +, CD3 + cellule umane, cellule CD14 + umane e CD19 + cellule umane da cellule del sangue periferico totale.
- Per l'infezione da HIV a valle e gli studi di latenza, calcolare la percentuale di cellule T CD4 + e CD8 + cellule di T all'interno delle cellule CD3 +.
Nota: In genere, un CD4: rapporto CD8 tra 1,5 e 2,5 è osservato prima dell' infezione di HIV30.
- Per l'infezione da HIV a valle e gli studi di latenza, calcolare la percentuale di cellule T CD4 + e CD8 + cellule di T all'interno delle cellule CD3 +.
6. analisi dell'infezione da HIV di hu-NSG topi e carico virale del Plasma mediante qRT-PCR
- Propagare il magazzino virale HIV BaL in essere umano PBMCs da donatori sani, vendemmia a post-infezione giorno 10 e titolare utilizzando p24 ELISA kit31.
- Topi di hu-NSG SELECT con più di 20% umano CD45 + cellule nel sangue periferico per l'infezione da HIV.
- Anestetizzare topi hu-NSG utilizzando un apparecchio di inalazione isoflurane/ossigeno (punto 5.1).
- Dopo aver confermato l'animale è anestetizzato, iniettare il virus HIV BaL alla dose di 200 ng di p24 per topo per via intraperitoneale.
Nota: Essere estremamente cauti con l'ago, non riutilizzare gli aghi e gettare immediatamente dopo l'uso in contenitore taglienti designato. Disinfettare la zona di iniezione dopo somministrazione di virus. - Tre settimane dopo l'infezione, anestetizzare topi hu-NSG e raccogliere il sangue periferico attraverso retro-orbitale sanguinamento utilizzando eparinizzato tubi capillari e provette per la raccolta.
- Separato al plasma e globuli rossi per centrifugazione a 2.000 x g per 20 minuti.
- Lyse RBCs. Block e macchia restanti cellule del sangue con gli anticorpi per l'analisi di citometria a flusso (sezione 5.3-5.8).
Nota: L'analisi di citometria a flusso dovrebbe concentrarsi sul confronto CD4: rapporto CD8, prima e dopo l'infezione. Diminuzione significativa nel conteggio delle cellule CD4 + è previsto, come il CD4 antigene serve come un co-recettore per l'entrata virale. - Campioni di plasma di uso per analizzare il virale del HIV vengono caricati tramite qRT-PCR. Isolare il RNA virale da campioni di plasma utilizzando un kit di mini di RNA virale. Eseguire qRT-PCR con primer specifici LTR di HIV-1 e la sonda imposta (dettagli di sequenza nella tabella 5), utilizzando il protocollo del produttore.
7. la somministrazione orale di carrello e convalida di soppressione virale (opzionale)
Nota: Questo passaggio è facoltativo per le indagini per quanto riguarda la prognosi di HIV, virologia o correlate all'infezione patofisiologia durante la fase di infezione acuta. Carrello trattamento del HIV-infettati hu-NSG è utilizzato per ricapitolare latenza di HIV tra pazienti umani ricezione carrello. HIV-infettati con successo hu-NSG topi sono dati carrello per 4 settimane. Il regime di carrello consiste di tenofovir disoproxil fumarato (TDF; 300 mg/capsula), emtricitabina (FTC; 200 mg/capsula) e raltegravir (RAL; 400 mg/capsula). La dose di carrello per il trattamento di topi affetti da HIV hu-NSG è secondo corpo superficie (tabella 1, equazione 1, tabella 2)32.
- Calcolare la quantità di ogni farmaco necessaria per ogni gabbia durante una settimana di trattamento, tenendo in considerazione il volume di acqua in bottiglia, il numero di topi in ogni gabbia e un'assunzione quotidiana di media di acqua da 4 mL per topo.
Nota: Il punto chiave in questo passaggio è per garantire che ogni mouse acquisisce la dose giornaliera all'interno di 4 mL di acqua potabile. - Macinare tutti e tre i farmaci con le dosi regolate in polvere fine e sciogliere la miscela di polveri in acqua zuccherata (ad es., Medidrop Suralose). Cambiare la bottiglia di acqua ogni settimana con cocktail appena disciolto carrello fornito in acqua zuccherata.
Nota: La polvere della droga non può sciogliere immediatamente, agitare energicamente per ottenere una sospensione omogenea prima di restituire la bottiglia alla gabbia della holding. - Raccogliere campioni di sangue periferico tramite retro-orbitale sanguinamento ogni due settimane e analizzare sia il CD4: rapporto CD8 mediante citometria a flusso (sezione 5.3-5,8) e il carico virale del plasma mediante qRT-PCR (sezione 6.6).
Nota: In genere dopo 4 settimane di trattamento, la carica virale plasmatica diminuisce a sotto il limite di rilevamento e un tipico CD4: rapporto CD8 viene ripristinato.
8. validazione del Rebound virale su carrello ritiro (opzionale)
Nota: Questo passaggio è fondamentale nella convalida del modello di latenza, come rimbalzo virale al momento del ritiro del carrello fornisce la prova diretta di un serbatoio di latenza. Si raccomanda anche di servire come esperimento di controllo per le indagini terapeutiche su HIV suppressants di rimbalzo.
- Piano per il ritiro del carrello dopo i carichi virali del plasma da campioni di sangue periferici sono inferiori al limite di rilevazione e il CD4: rapporto CD8 viene ripristinato in un range compreso tra 1,5 e 2,5.
- Raccogliere campioni di sangue periferico attraverso retro-orbitale sanguinamento ogni 2 settimane dopo ritiro del carrello. Monitorare attentamente il cambiamento in carica virale plasmatica (sezione 6.6) così come il CD4: rapporto CD8 (sezione 5.3-5.8).
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Representative Results
Analisi di citometria a flusso è effettuato frequentemente per convalidare la purezza di HSCs isolato, valutare i livelli di attecchimento, profilo risposta immunitaria all'infezione virale ed efficacia di carrello di indagine. Un pannello di anticorpi tipico contiene anticorpi fluorescente contrassegnati individuali di 4-6; così, un citometro a flusso con più laser e una vasta selezione di filtri è cruciale per il raggiungimento di risultati accurati.
Per la convalida di attecchimento iniziale, il conteggio delle cellule CD45 + umano può variare da 20% a 80%, e sottoinsiemi di leucociti umani dovrebbero apparire come popolazioni discrete sulla dot-trama del flusso (Figura 2). Il rapporto di CD4:CD8 rimane tra 1,5 e 2,5 per un individuo sano; lo svuotamento CD4 + significativo si osserva tipicamente dopo l'infezione virale, producendo un rapporto più basso di CD4:CD8; e ripristino del rapporto sano è osservato previo trattamento di carrello (Figura 3).
qRT-PCR dà un limite di rilevazione di 40 RNA copie/mL di plasma; diluizioni corretta sono necessari prima dell'esperimento. Carica virale al plasma rilevato mediante qRT-PCR durante tutto il corso del regime infezione e carrello può essere tracciata e utilizzati per valutare l'efficienza di infezione e carrello (Figura 4).
Figura 1. Programma di installazione utilizzato per l'iniezione intraepatico siringa.
L'impostazione di ago/siringa Hamilton 80508 su ordine include un ago 30 gauge, 51-mm-lungo con un bordo smussato e una siringa di vetro allegato 50-µ l. Volume di iniezione massima in questa procedura è 25 µ l. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Flusso cytometry dati rappresentano riuscito engraftment e gli sviluppi delle cellule linfoidi e mieloidi nel sangue periferico.
I campioni di sangue periferico correttamente preparato dovrebbero avere separazioni popolazione discreta, e un mouse ben engrafted hu-NSG dovrebbe avere cellule T, cellule B e monocito positivo popolazioni presentato nel sangue periferico. Un grafico di CD4:CD8 è raccomandato per il calcolo del rapporto. un) riuscito engraftment ha mostrato più di 25% CD45 + umano leucociti nel sangue periferico; popolazione discreta di b) cellule di B, c) monociti, d) T-cellule tra antigeni CD45 + di; e) CD4 + cellule T helper e f) CD8 + cellule T citotossiche sono ben separate, e g) produce un rapporto tra 1,5 a 2,5 in questo non infetti hu-NSG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Modifiche di conteggio delle cellule di CD4 + durante tutto il corso dell'infezione virale, carrello e carrello ritirano.
Come progredisce l'infezione, il CD4: rapporto CD8 diminuisce da 1,5-2,5 a > 1.0, CD4: rapporto CD8 è stata servita come un parametro clinico nella valutazione della prognosi di HIV come pure trattamento efficacies. un) rappresentativo del flusso di dati che indicano il cambiamento nei rapporti di CD4:CD8 durante il corso sperimentale; b) restaurato grafico di tendenza di confronto che indica l'efficacia del carrello, che può essere identificato come percentuale di cellule T CD4 +. Rilevazione del conteggio delle cellule CD4 + T da citometria a flusso. N: numero di topi testati = 6; Barre di errore: significa ± SEM. * p < 0,05, * * p < 0.01, * * *p < 0,001, * * * p < 0,0001, ns: non significativo diverso. Analisi di varianza a due vie sono impiegato. Figura è ristampata con permesso22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. Modifiche di RNA virale del siero copiare numeri durante tutto il corso dell'infezione virale, ritirare il carrello e carrello
Rilevamento della viremia plasmatica nei topi affetti da HIV hu-NSG mediante qRT-PCR. L'area ombreggiata indica il periodo di tempo durante il quale i topi hanno ricevuto carrello (dal giorno 28 al giorno 70 come mostrato). Il limite di rilevazione (indicato dalla linea tratteggiata) del saggio PCR è (~ 110-160 RNA copie/mL) in 50-80 µ l di plasma ottenuto attraverso la vena caudale. Stella (*) indica il RNA virale non rilevato nel carrello trattato animali al giorno 56. Numero di copie virale RNA del siero analizzati da campioni di sangue periferico serve come prova diretta riguardo il grado di infezione virale. Dovrebbe essere in accordo con l'analisi del flusso CD4. N: numero di topi testati = 6; Barre di errore: significa ± SEM. * p < 0,05, * * p < 0.01, * * * p < 0,001, * * * p < 0,0001, ns: non significativo diverso. Analisi di varianza a due vie sono impiegato. Figura è ristampata con permesso22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Equazione 1. Dose di traduzione basato sulla superficie corporea (BSA).
Equazione per la traduzione di dose umana di dosaggio contro piccoli animali da esperimento. Il fattorem K può essere trovato nella tabella 2.
| Farmaco | Dose giornaliera (mg) |
| Tenofovir disoproxil fumarato | 300 |
| Emtricitabina | 200 |
| Raltegravir | 800 |
Tabella 1. Dose giornaliera del farmaco individuo in regime di carrello
| Specie | Peso (kg) | BSA (m2) | Fattore Km |
| Umano | |||
| Adulto | 60 | 1.6 | 37 |
| Bambino | 20 | 0,8 | 25 |
| Mouse | 0,02 | 0,0007 | 3 |
Tabella 2. Peso, BSA e Km grafico fattore di conversione di dose
| Reagente | Volume (µ l) * | Concentrazione finale |
| 0,01% BSA in PBS | 98 | |
| IgG umano di 10 mg/ml | 1 | 100 μg/ml |
| 10 mg/ml di IgG di topo | 1 | 100 μg/ml |
| 100 | ||
| * Ricetta è per un campione di cellule bloccato in 100 μl blocco cocktail. Regolare il volume di conseguenza con numeri di esempio. | ||
Tabella 3. Blocco cocktail per isolato le cellule del sangue
| Anticorpo | Fluoroforo | Es. Max | Em. Max |
| CD45 | BB515 | 490 nm | 515 nm |
| CD3 | PE-Cy7 | 496 nm | 785 nm |
| CD4 | Pacific Blue | 401 nm | 452 nm |
| CD8 | BUV395 | 348 nm | 395 nm |
| CD14 | APC-Alexa 750 | 650 nm | 774 nm |
| CD19 | PE | 496 nm | 578 nm |
Tabella 4. Ha suggerito di pannello di flusso multi-colore
| Forward Primer | 5'-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTG-3 ' | |||
| Reverse Primer | 5'-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3 ' | |||
| Sonda * | 5'-AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTAGTGTTGACT-3 ' | |||
| * 5'-FAM, 3'-Black Hole Quenche 1 | ||||
Tabella 5. Primer di LTR di HIV-1 e sonda
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Discussion
Topi immunocompromessi innestati con cellule/tessuti umani presentano caratteristiche fisiologiche simili all'uomo e un enorme valore per gli studi di patologia, fisiopatologia e immunologia relative alle malattie umane specifiche. Tra più ceppi di topi immunocompromessi, il cenno del capo. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) modello è il più immunodeficiente a causa della sua mancanza di sia innata che adattativa, nonché ablato specifici del mouse cytokine signaling3,12,19 . Di conseguenza, topi NSG sono stati ampiamente utilizzati nel processo di umanizzazione ed è assodato che cellule umane ripopolare nel sangue periferico murino, linfoide e mieloide tessuti, e che i topi presentano adeguate risposte immunitarie umane a stimolazioni infettive come l'HIV27,33.
A causa della restrizione di host dell'HIV, gli studi sugli animali preclinici della prognosi di virologia e infezione HIV sono stati in precedenza limitati ai primati non umani infettati con immunodeficienza virus (SIV, la versione di primati non umani di HIV)3. Avanzamenti nella ricerca sulle cellule staminali e la generazione di topi NSG hanno aperto la possibilità di condurre la ricerca sull'HIV su piccoli animali murini con costi inferiori e più veloce sperimentale fatturato. Attualmente, umanizzazione NSG può essere raggiunto attraverso il trapianto di tessuti 1) fetali e HSC umane (modello BLT), 2) umano PBMCs (modello PBL) e 3) umano HSC (modello SRC). Il modello di BLT offre la massima efficienza di attecchimento, nonché di sviluppo globale di entrambe le funzioni linfoidi e mieloidi34,35, ma è tecnicamente impegnativo. Il modello PBL è il più conveniente stabilire ma ha una breve finestra sperimentale all'attecchimento derivanti da GVHD; Inoltre solo offre risposte a cellula T periferiche decente e manca di sviluppo linfoide e mieloide. Per queste ragioni, abbiamo impiegato il modello SRC in questo protocollo, con adattamenti per soddisfare i requisiti per le indagini di HIV. Il modello di hu-NSG è completamente privo di funzione immune ed efficiente al midollo osseo homing su radiazioni e trapianto di organi; Inoltre, permette sfida virale e le indagini successive ad un'età più giovane, evitando lo sviluppo di problemi patologici senile conosciuta per lo sfondo del ceppo di cenno del capo. Anche se le cellule T nel modello hu-NSG vengono educate in un ambiente timico mouse e sono solo H2-limitata, più, se non tutti, sottoinsiemi di cellule immuni umane possono svilupparsi in e colonizzare gli organi linfoidi e mieloidi del mouse. Notevolmente, il tessuto linfoide associato all'intestino del modello hu-NSG è anche ricostituito con le cellule immunitarie umane; così, questo modello potrebbe supportare potenzialmente mucoso trasmissione dell'HIV, simile al BLT modello22,23.
Uno degli ostacoli maggiori allo sradicamento dell'HIV è l'esistenza di un serbatoio di latenza tra pazienti trattati con carrello soppressiva33,36,37,38,39. Cellule latente infettate rimangono quiescenti e contribuiscono a rimbalzo virale di HIV al momento del ritiro del carrello. Serbatoi di latenza anatomicamente si trovano nel fegato, milza, cervello e altri tessuti linfoidi e sono principalmente composte da memory T-cells di CD4 +36,40,41. Come segnalato dal nostro gruppo, il modello di hu-NSG supporta pienamente lo sviluppo del lignaggio della T-cellula, che lo rende adatto per la modellazione patologica della latenza di HIV. Abbiamo mostrato che questo modello è altamente suscettibile all'infezione virale e successivamente al regime carrello tramite la somministrazione orale. Drammatica rebound virale si verifica immediatamente al momento del ritiro del carrello, che supporta pienamente l'esistenza di un serbatoio di latenza. Latente infettati memory T-cells CD4 + possono essere isolate da organi linfoidi del NSG-hu HIV-infettati durante il carrello, e saggi di conseguenza virale ricapitolano virologica ex vivo41. Il modello hu-NSG e il regime di HIV infezione/carrello descritto in questo protocollo sono così vaste applicazioni in campi correlati alla virologia HIV, infezione prognosi, patofisiologia di latenza e lo sviluppo di terapie antiretrovirali.
Modello del topo di hu-NSG in questo protocollo richiede irradiazione e iniezione intraepatica di HSCs al giorno 2-3 dopo la nascita; Pertanto, sono necessari in-House allevamento e condizioni abitative specifiche. Sebbene il trapianto di HSC neonatale generalmente produce efficienza alta attecchimento, in alcuni casi può verificarsi GVHD severo. In alcuni casi, una diminuzione significativa nel conteggio periferico CD45 + cella può essere osservata dopo l'infezione, e in condizioni estreme, sangue periferico CD45 + svuotamento può essere osservato; Pertanto, l'analisi di citometria a flusso e raccolta di sangue possono essere impegnativo. Uno dei principali limiti di questo modello di mouse hu-NSG si trova all'interno della natura chimerica delle sue T-cellule. T-cellule nel modello del topo di hu-NSG vengono educate all'interno dell'ambiente timico del mouse e vengono sottoposti a limiti di H2 anziché essere HLA-ristretti; di conseguenza, completa ricapitolazione dei cambiamenti dinamici di sottoinsiemi a cellula T al momento dell'infezione è meno probabile. Ulteriormente, anche se il modello del mouse di hu-NSG esibisce buona suscettibilità all'infezione da HIV-1, la carica virale plasmatica osservata può essere molteplice inferiore nel modello BLT, possibilmente dovuto la ricostituzione chiederai di funzioni linfoidi e mieloidi umane.
In sintesi, il mouse di hu-NSG raffigurato in questo protocollo offre una metodologia semplice ed efficace per la generazione di un modello murino umanizzato per studi di virologia e latenza di HIV, come alternativa al modello BLT. Nonostante i suoi limiti a sviluppo completo linfoide e mieloide, il modello di hu-NSG è stato dimostrato suscettibile dell'infezione e reattivo al carrello trattamento o altre terapie22,23,24. Il modello di patologia di latenza stabilito secondo questo protocollo ricapitola rebound virale HIV in vivo e latente memoria infetto che i T-cells di CD4 + può essere ulteriormente isolato per ulteriori indagini.
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Disclosures
Gli autori non divulgare conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health [sovvenzione numeri R01AI29329, R01AI42552 e R01HL07470 J.J.R] e National Cancer Institute, del National Institutes of Health [concessione numero P30CA033572 per sostenere la città della speranza Integrative Genomics Farmacologia analitica e analisi Cytometry core]. Il reagente seguente è stato ottenuto attraverso la ricerca sull'AIDS NIH e riferimento reagente programma, divisione di AIDS, NIAID, NIH: virus HIV BaL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
| CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
| IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
| Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
| Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
| Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
| Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
| Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
| Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
| QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
| TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
| HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
| IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
| APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
| PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |
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