Summary
Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van discrete metalen zuurstof clusters, polyoxometalates (POMs), bij de enkelvoudige molecuul limiet met behulp van een biologisch nano-gebaseerd elektronisch platform. De methode biedt een complementaire benadering van traditionele analytische chemie instrumenten die worden gebruikt in de studie van deze moleculen.
Abstract
Individuele moleculen kunnen worden gedetecteerd en gekarakteriseerd door het meten van de mate waarin ze de Ionische stroom die door een enkele nanometer-schaal porie stroomt, verminderen. Het signaal is kenmerkend voor de fysisch-chemische eigenschappen van het molecuul en de interacties met de porie. We tonen aan dat de nanopore gevormd door de bacteriële proteïne exotoxin Staphylococcus aureus alpha gemolizinami (αhl) kan detecteren polyoxometalates (POMs, anionische metaal zuurstof clusters), bij de enkelvoudige molecuul limiet. Bovendien worden meerdere afbraakproducten van 12-foshotungstic acid POM (PTA, H3PW12O40) in oplossing gelijktijdig gemeten. De gevoeligheid van één molecuul van de nanometer-methode maakt het mogelijk dat POMs wordt gekenmerkt bij significant lagere concentraties dan nodig is voor nucleaire magnetische resonantie (NMR)-spectroscopie. Deze techniek kan dienen als een nieuw hulpmiddel voor chemici om de moleculaire eigenschappen van polyoxometalaten of andere metallische clusters te bestuderen, om POM synthetische processen beter te begrijpen en hun opbrengst mogelijk te verbeteren. Hypothetisch gezien kon de locatie van een bepaald atoom, of de rotatie van een fragment in het molecuul, en de metaal oxidatietoestand met deze methode worden onderzocht. Daarnaast heeft deze nieuwe techniek het voordeel dat het real-time monitoren van moleculen in oplossing mogelijk is.
Introduction
Het opsporen van biomoleculaire analyten op het enkelvoudige molecuul niveau kan worden uitgevoerd door het gebruik van nanodeeltjes en het meten van ionogene stroom modulaties. Meestal zijn nanodeeltjes onderverdeeld in twee categorieën op basis van hun fabricage: biologisch (zelf samengesteld uit eiwitten of DNA-origami)1,2,3of Solid-State (bijv.vervaardigd met Semiconductor processing tools)4,5. Terwijl Solid-State nanopores werden gesuggereerd als potentieel meer fysiek robuust en kunnen worden gebruikt over een breed scala aan oplossings omstandigheden, eiwit nanodeeltjes tot nu toe bieden meer gevoeligheid, meer weerstand tegen vervuiling, grotere bandbreedte, betere chemische selectiviteit en een grotere signaal-ruis verhouding.
Een verscheidenheid aan eiwitionen kanalen, zoals die gevormd door Staphylococcus aureus α-hemolysine (αhl), kan worden gebruikt voor het opsporen van enkelvoudige moleculen, waaronder ionen (bijv.H+ en D+)2,3, polynucleotiden (DNA en RNA)6,7,8, beschadigd DNA9, polypeptiden10, eiwitten (gevouwen en uitgeklapt)11, polymeren (polyethyleenglycol en andere)12,13 , 14, goud nanodeeltjes15,16,17,18,19, en andere synthetische moleculen20.
We hebben onlangs aangetoond dat de αHL-nanometer ook metalen clusters, polyoxometalaten (POMs), op het niveau van één molecuul gemakkelijk kan detecteren en karakteriseren. POMs zijn discrete nanoschaal anionische metalen zuurstof clusters die werden ontdekt in 182621, en sindsdien zijn veel meer soorten gesynthetiseerd. De verschillende maten, structuren en elementaire composities van polyoxometalates die nu beschikbaar zijn, leidden tot een breed scala aan eigenschappen en toepassingen, waaronder chemie22,23, katalyse24, material Science25 ,26, en biomedisch onderzoek27,28,29.
POM synthese is een zelf assemblageproces dat gewoonlijk in water wordt uitgevoerd door de stoichiometrisch vereiste hoeveelheden monomere metaalzouten te mengen. Eenmaal gevormd, POMs vertonen een grote diversiteit van maten en vormen. Bijvoorbeeld, de keggin polyanion structuur, XM12O40q- is samengesteld uit een bevat (X) omgeven door vier oxygenen om een tetraëder te vormen (q is de lading). Het bevat is centraal gelegen in een kooi gevormd door 12 octaëdrisch mo6 eenheden (waar M = overgangsmetalen in hun hoge oxidatietoestand), die met elkaar verbonden zijn door naburige gedeelde zuurstofatomen. Hoewel de structuur van Tungsten polyoxometalates stabiel is in zure omstandigheden, leiden hydroxyionen tot het Hydrolytische decolleté van metaal-zuurstof (M-O)-bindingen30. Dit complexe proces resulteert in het verlies van een of meer MO6 Octahedrale subeenheden, wat leidt tot de vorming van monovacant en vrijgekomen soorten en uiteindelijk tot de volledige ontleding van de POMs. Onze bespreking hier zal beperkt zijn tot de partiële ontledingsproducten van 12-fosfolienzuur bij pH 5,5 en 7,5.
Het doel van dit protocol is het detecteren van discrete metaal zuurstof clusters bij de enkelvoudige molecuul limiet met behulp van een biologisch nano-gebaseerd elektronisch platform. Deze methode maakt de detectie van metaal clusters in oplossing mogelijk. Meerdere soorten in oplossing kunnen worden gediscrimineerd met een grotere gevoeligheid dan conventionele analytische methoden33. Met het, subtiele verschillen in POM structuur kan worden opgehelderd, en in concentraties duidelijk lager dan die nodig zijn voor NMR-spectroscopie. Belangrijk, deze aanpak maakt zelfs de discriminatie van isomere vormen van na8HPW9O341.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Het onderstaande protocol is specifiek voor het Electronic BioSciences (EBS) nano patch DC-systeem. Het kan echter gemakkelijk worden aangepast aan andere elektrofysiologie apparatuur die wordt gebruikt om de stroom te meten door middel van vlakke lipide dubbelmembranen (standaard lipide dubbelmembraan kamer, U-buis geometrie, getrokken micro capillairen, enz.). De identificatie van commerciële materialen en hun bronnen wordt gegeven om de experimentele resultaten te beschrijven. Deze identificatie impliceert in geen geval aanbeveling van het Nationaal Instituut voor normen en technologie, en impliceert ook niet dat de materialen het best beschikbaar zijn.
1. bereiding van de oplossing en analyt
- Bereid alle elektrolytoplossingen met 18 MΩ-cm water van een type-1 waterzuiveringssysteem om traceer organische soorten te verwijderen en filtreer vervolgens alle elektrolytoplossingen via een 0,22 μm vacuüm filter direct voor ionen kanaal opnames.
Opmerking: De waterkwaliteit is een cruciale factor voor de stabiliteit en de levensduur van het membraan nanopore-systeem. - Wild type αHL.
- Volg de voorzorgsmaatregelen van MSDS bij het hanteren van het αHL toxine eiwit.
- Meng gelyofiliseerd wild-type monomere S. aureus α-hemolysine (αHL) poeder met 18 MΩ-cm water op 1 mg/ml. Verdeel 10 tot 30 μL aliquots van het monster in Cryo-veilige centrifugebuizen, knip snel in vloeibare stikstof en bewaar vervolgens bij-80 °C. U ook gezuiverde voorgevormde heptameric αHL31gebruiken.
- Los de lipide 1,2-diphytanoyl-SN-glycero-3-fosfocholine (dphypc) tot 0,2 mg/ml in n-Decane in een 4 ml glas Scintillatie injectieflacon met een polytetrafluorethyleneeflon-gecoate dop. Bewaar de oplossing bij 4 °C voor herhaald gebruik gedurende maximaal één maand.
- Bereid phosphotungstic acid oplossingen.
- Volg de voorzorgsmaatregelen van MSDS bij het hanteren van het foshotungstic acid-poeder en bereid een 2 mM phosphotungstic acid-oplossing voor door het oplossen van 57,6 mg H3PW12O40 in 10 ml van een 1 M NaCl en 10 mm Nah2po4 oplossing, die de stamoplossing vormt.
- Neem 5 mL van deze oplossing en stel de pH in op 5,5 met 3 M NaOH. Pas de pH van de andere 5 mL van de stamoplossing aan 7,5 met 3 M NaOH.
Opmerking: Een t pH 5,5, 12-foshotungstic zuur (PTA, H3PW12O40) ontbindt voornamelijk in de monovacant anion [PW11O39]7-.
2. test de Celassemblage
- Monteer de testcel volgens de instructies van de fabrikant.
- Week één Ag/AgCl-draad in bleekwater (natriumhypochloriet) gedurende 10 minuten na schuren met 600 Grit schuurpapier. Plaats de elektrode in het kwarts nanopore-membraan (QNM).
- Plaats een cilindrische AgCl-pellet-elektrode ingebed in een zilver draad buiten de QNM.
- Zodra de testcel is ingesteld, schakelt u het programma voor energietoevoer en gegevensverzameling in. Zorg ervoor dat de DC-Stroommeting 0 pA is bij afwezigheid van een oplossing in de testcel.
- Gebruik een injectiespuit die met de testcel verbonden is via een vloeistoflijn om een gebufferde elektrolytoplossing boven het gezicht van de qnm toe te voegen en om ervoor te zorgen dat de Ionische stroom de versterker verzaveert. Als dat niet zo is, kan de QNM verstopt zijn. Breng een pop-spanning (± 1 V) en/of een druk groter dan 300 mm Hg aan om deze te wissen. Als dat werkt, verlaagt u de spanning en druk.
3. vorming van lipide-Bilayer
- Vul de oplossing in de testcel zodat het oplossings niveau ruim boven het gezicht van de QNM ligt. Verlaag vervolgens het oplossings niveau via de spuit tot onder het gezicht, zodat de stroom afneemt tot nul.
- Dompel een pipetpunt van 10 μL in de lipide-injectieflacon. Duw op de achterkant van de pipetpunt en tik erop aan de zijkant van de injectieflacon om alle zichtbare lipide te verwijderen.
- Raak de pipetpunt aan op de luchtwater interface van de oplossing in de testcel wanneer het oplossings niveau boven het gezicht van de QNM ligt en wacht twee tot vijf minuten totdat het lipide gelijkmatig verspreidt.
- Verlaag langzaam het oplossings niveau onder het gezicht van de QNM tot de huidige verzadigde vetzuren, en verhoog vervolgens langzaam het oplossings niveau voorbij het gezicht van de QNM om een lipide dubbelmembraan te vormen.
- Zodra een dubbelje lijkt te vormen (d.w.z. wanneer de stroom naar nul gaat), probeer het meerdere malen te knallen door de druk te verhogen en ervoor te zorgen dat de qnm niet verstopt is. Om het lipide dubbelmembraan te hervormen, verlaagt u het oplossings niveau onder het gezicht van de QNM en verhoogt u het langzaam.
- Als het lipide dubbelmembraan niet de eerste keer vormt, verlaagt u de oplossing onder het gezicht en verhoogt u het opnieuw. Als het niet na 3 proeven wordt vorm, voeg meer lipiden zoals beschreven in 3,2 en 3,3.
- Nadat u een membraan hebt gevormd, stelt u de huidige verschuiving in op nul wanneer de toegepaste potentiaal nul is.
4. αHL porie vorming
- Voeg 2,5 ng gezuiverde voorgevormde αHL heptamerische proteïne monster (of 250 ng van monomere αhl) toe aan de testcel (volume ≈ 200 μL) om kanaal vorming mogelijk te maken.
- Verhoog de druk op de dubbellaagte met een gasdichte spuit (Figuur 1) nadat een dubbelval is gevormd, om het membraan uit de qnm uit te breiden en het inbrengen van nanopore te vergemakkelijken. Verhoog de toegepaste rugdruk meestal tussen 40 tot 200 mmHg, afhankelijk van elke QNM.
Opmerking: De EBS-software heeft een automatische invoegfunctie die een hogere bias toepast (meestal 200 tot 400 mV) om porie vorming te induceren en vervolgens automatisch de gewenste spanning naar de meet bias verlaagt zodra een enkel kanaal vormt. - Na een nanopore vormen, verminder de terugdruk tot ongeveer 1 ⁄ 2 van de insertie druk. Als er meerdere kanalen worden waargenomen, verwijdert u deze door de druk aanzienlijk te verlagen.
5. metalen cluster partitionering in de nano polymeer
- Om rekening te maken met elektrode onevenwichtigheden, stelt u de DC-offset spanning zodanig in dat wanneer de toegepaste potentiaal op nul is ingesteld, er geen gemeten stroom is.
- Voordat u het POM-monster toevoegt, voert u een controle-experiment uit om er zeker van te zijn dat er geen verontreinigingen zijn (bijv.sporen POMs van een vorig experiment) in het reservoir. Specifiek, verwerven van een Ionische stroom Trace onder een toegepast potentieel van + 120 mV tot-120 mV bij afwezigheid van een POMs om te controleren of er geen spontane stroom blokkades aanwezig zijn.
Opmerking: Vanwege de asymmetrische structuur van het αHL-kanaal (Figuur 1), zal de magnitute van de Ionische stroom verschillen voor positieve en negatieve toegepaste potentialen. De verhouding van de gemeten stroom boven deze toegepaste spanning is indicatief voor de oriëntatie van de αHL-nanometer in het membraan. - Voeg het POM monster toe door het reservoir met een metalen clusteroplossing met een concentratie van 1 tot 5 mM te spoelen. U het monster ook in het capillair laden voordat u de cel samenplaatst om de opdeling van POMs in het andere uiteinde van het αHL-kanaal te bestuderen.
- Noteer de Ionische stroom met behulp van de software van de fabrikant om voorbijgaande stroom blokkades te detecteren die worden veroorzaakt door het partitioneren van individuele POMs in de nanometer. Schat de fysische en chemische eigenschappen van het molecuul van de Ionische stroom blokkade diepte, frequentie van de gebeurtenis en de verblijftijd verdeling van de blokkades.
6. ion-kanaal opnames en data-analyse
- Verkrijg de Ionische current time series-metingen met behulp van een hoge impedantie, geluidsarme versterker en data-acquisitie systeem. Voer de metingen uit bij een toegepaste spanning van-120 mV (ten opzichte van kanaal CIS -zijde) voor elke pH.
- Breng een low-pass 100 kHz 8-polige Bessel-filter aan op het signaal, dat vervolgens wordt gedigitaliseerd op 500 kHz (d.w.z. 2 MS/punt). Extraheer gebeurtenissen uit de tijdreeksen en analyseer gebeurtenissen met behulp van het adept-algoritme in het Mosaic -softwarepakket32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de afgelopen twee decennia zijn membraan-gebonden eiwitten nanometer-schaal poriën gedemonstreerd als veelzijdige single-molecuul sensoren. Metingen op basis van nanopore zijn relatief eenvoudig uit te voeren. Twee kamers gevuld met elektrolytoplossing worden gescheiden door een nano erts ingebed in een elektrisch isolerend lipide-membraan. Ofwel een patch-klem versterker of een externe voeding biedt een elektrostatisch potentieel over de nanodeeltjes via Ag/AgCl-elektroden ondergedompeld in de elektrolyten reservoirs. Het elektrische veld drijft individuele geladen deeltjes in de poriën, die voorbijgaande reducties in de Ionische stroom produceert die afhangen van de grootte, vorm en lading van de deeltjes. Een computerprogramma regelt de toegepaste spanning en bewaakt in real-time de Ionische stroom blokkades veroorzaakt door moleculen reversibel partitioneren in de porie. De stroom wordt versterkt en omgezet in spanning met een laag-ruis, hoge impedantie veld-effect transistor en gedigitaliseerd met behulp van een Data Acquisition Card.
Hier bieden we een algemene procedure voor het opsporen van polyoxometalates met een biologische nano-ore. Zoals te zien in Figuur 2, voorafgaand aan de toevoeging van POMs, heeft het onbelemmerde kanaal een gemiddelde open kanaal stroom van ~ 100 Pa bij een toegepast potentiaal van-120 mv. De toevoeging van POMs produceert voorbijgaande blokkades en verlaagt de Ionische stroom met ongeveer 80%. Zoals verwacht, omdat deze deeltjes negatief zijn geladen, worden de blokkades niet waargenomen wanneer de polariteit van het toegepaste potentiaal wordt omgekeerd. Merk op dat als de POMs niet interactie met de poriën muur, ze zou diffuus door de pore's in ongeveer 100 NS, die veel te kort te worden gedetecteerd met een conventionele patch klem versterker. Het grootste deel van de tijd dat een bepaald deeltje in de poriën doorbrengt, is dus een direct gevolg van de interactie tussen het deeltje en de porie. De duur van een Ionische stroom blokkade gebeurtenis wordt gedefinieerd als de verblijfstijd, tau (τ).
Ter illustratie van het nut van deze methode, bespreken we het gebruik van een αHL-nanometer om de ontleding van 12-fosfolienzuur (PTA, H3PW12O40) bij pH 5,5 en pH 7,5 te controleren. Deze ontleding kan worden waargenomen met 31P NMR-metingen, maar de benodigde concentratie is 2 mm, terwijl nanometer-metingen minder dan 30 μM nodig hebben, vanwege de meet gevoeligheid van nanopore. Bij pH 5,5, [PW11O39]7- is de overheersende soort30.
De gegevensanalyse wordt uitgevoerd door het berekenen van een histogram van de relatieve blokkade Diepteverhouding (d.w.z.<i>/<io>, waarbij <i> de gemiddelde stroom is met de pom in de porie en <io > is de gemiddelde open kanaal stroom). Het histogram van de gemiddelde huidige blokkade diepte ratio's bij-120 mV en pH 5,5 vertoont een kleine piek bij <i>/<io> ≈ 0,06 en de grote piek bij < i >/<io> ≈ 0,16 (Figuur 3 , groen). We gaan ervan uit dat deze pieken corresponderen met [P2W5o23]6- en [PW11O39]7-, respectievelijk, gebaseerd op 31P NMR. 31 P NMR studies suggereren dat verhoging van de pH de relatieve concentratie van deze twee soorten verandert, en dit wordt bevestigd door de verandering in het gebied van de twee pieken weergegeven in Figuur 3.
Wanneer de pom-oplossing wordt getitreerd naar pH 7,5 ex situ, neemt de totale pom-concentratie af als gevolg van de gedeeltelijke afbraak van de twee belangrijkste soorten tot anorganische zouten (d.w.z. vrij fosfaat, Hxpo4−3 + x en tungstate, wo42− ionen). Het histogram van de relatieve blokkade Diepteverhouding toont ook twee belangrijkste pieken (Figuur 3, oranje), maar met 20-voudige minder gebeurtenissen (wat SUGGEREERT dat de totale pom-concentratie bij pH 7,5 ongeveer 20-voudig kleiner is dan die bij pH 5,5, als de de vangefficiëntie van nanopore voor POMs is hetzelfde bij de twee pH-waarden). Het is interessant om op te merken dat bij pH 7,5 en hoger, de pom soorten die hier werden waargenomen niet werden gedetecteerd in het 31P NMR-spectrum vanwege hun lage concentratie, veroorzaakt door hun dissociatie in fosfaat-en wolframaat-ionen.
De verblijftijd van elke gebeurtenis in de porie wordt bepaald door de duur van de afzonderlijke Ionische Current blokkades. De verdeling van de verblijfs tijden geeft inzicht in de verschillende soorten die aanwezig zijn. Eerder werd aangetoond dat voor blokkades door een verschillend formaat polymeren van poly (ethyleenglycol), de verblijftijd verdeling voor elke grootte van dat polymeer is goed beschreven door een enkele exponentiële. Dat resultaat suggereert dat de interactie van dat polymeer een eenvoudige omkeerbare chemische reactie12,13,20is.
Figuur 4 illustreert dat de verdeling van de verblijfstijd voor de twee pieken goed was gedifferentieerd bij de pH 5,5 en 7,5. Twee functies zijn duidelijk. Ten eerste zijn onder alle omstandigheden meerdere exponentiële nodig om aan elk van de distributies te voldoen, wat suggereert dat er variaties zijn van de POMs binnen elke soort. Ten tweede zijn de verblijftijden van de POMs in de poriën veel korter bij pH 7,5 vergeleken met die bij pH 5,5, wat een verzwakking van de interactie tussen de poriën en de POMs suggereert. Eerder is aangetoond dat een verandering in pH het relatieve aantal vaste ladingen in of nabij het αHL-kanaal lumen wijzigt. Deze veranderingen zullen de interacties met het partitioneren van POMs in de poriën direct veranderen en daarom hun verblijfs tijden wijzigen34,35.
Afbeelding 1: Schematisch diagram van de experimentele opstelling. Methode voor de karakterisering van individuele polyoxometalaatmoleculen op basis van nano erts. Een eiwit-nanopore dat zelf-assembleert in een 4 nm dik lipide dubbellaagmembraan wordt ondergedompeld in waterige elektrolyten oplossingen in een glazen capillair en groter reservoir. Er wordt een druk uitgeoefend op de glazen capillaire met een gasdichte spuit om de integratie van nano erts te helpen. Een potentiaal V wordt toegepast over het membraan met een overeenkomend paar Ag/AgCl-elektroden en stuurt een Ionische stroom (bijv.na+ en cl-) door de poriën. De stroom wordt omgezet in spanning met een hoge impedantie versterker, gedigitaliseerd met een analoge naar digitale converter (ADC) en opgeslagen op een computer. Computer software regelt de toegepaste potentiaal door middel van een digitaal naar analoog converter (DAC) en monitoren, in real-time, de voorbijgaande stroom blokkades veroorzaakt door enkelvoudige moleculen die partitie in de poriën. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: op nano erts gebaseerde detectie van individuele Metallo-nanodeeltjes. Een illustratie van Ionische Current Time Series-sporen die voor en na de toevoeging van een POM-oplossing aan het nanometer-apparaat voorkomen. Het partitioneren van individuele anionische POMs in de poriën veroorzaakt voorbijgaande stroom verlagingen in de gemiddelde open poriën stroom, <io>. (Rechts) Een typisch evenement, ter illustratie van de gemiddelde stroom van de blokkade (<i>) en de verblijfstijd (τ) van het deeltje in de porie. Het toegepaste potentieel was-120 mV, en de oplossingen bevatten 1 M NaCl, 10 mM NaH2po4 bij pH 5,5. Het CIS-compartiment bevatte ook 30 μM 12-fosfolienzuur. De huidige blokkade diepte ratio (<i>/<io>) en de verblijfs tijden (τ) geven informatie over welke pom soorten in de oplossing aanwezig zijn. Onder de omstandigheden die we hier gebruikten, de αHL kanaal niet Gate (spontaan sluiten) wanneer POMs niet aanwezig zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: histogrammen van de huidige blokkade diepte ratio bij pH 5,5 en 7,5. Histogrammen van de door POM geïnduceerde Ionische Current blokkade Diepteverhouding bij pH 5,5 (groen) en 7,5 (oranje) met een toegepaste potentiaal V =-120 mv. De twee pieken die aanwezig zijn bij elke pH-waarde komen overeen met de bekende, overheersende POM-soorten in oplossing onder die omstandigheden. De huidige blokkade diepte ratio's van 0 en 1 komen overeen met respectievelijk een volledig geblokkeerde en open porie. De histogrammen zijn gemaakt met een opslaglocatie breedte van 0,001 en genormaliseerd naar tellingen/s door te delen door de gegevens verzamelings tijd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: verblijftijd verdeling en montage met verschillende exponentials. De verdeling van de verblijfs tijden voor door POM geïnduceerde stroom blokkades veroorzaakt door de twee-belangrijkste soorten (pieken 1 en 2 in Figuur 4), waargenomen bij de pH 5,5 en 7,5 in een semi-log perceel. Voor beide soorten zijn de verblijfs tijden aanzienlijk korter bij de hogere pH-waarde, wat suggereert dat de interactie tussen de poriën en de POMs is veranderd. De massieve lijnen zijn geschikt voor een exponentiële Meng model aan de gegevens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Door hun anionische lading associëren POMs waarschijnlijk met organische contra kationen door elektrostatische interacties. Daarom is het belangrijk om te bepalen van de juiste oplossing voorwaarden en de juiste elektrolyt omgevingen (met name kationen in oplossing) om te voorkomen dat complexe vorming met POMs. Bijzondere aandacht is vereist in de keuze van de buffer. Bijvoorbeeld, de opnamesnelheid van POMs met tris (hydroxymethyl) aminomethaan en citroenzuur-gebufferde oplossingen is significant lager dan die in fosfaatgebufferde oplossing, waarschijnlijk omdat een van de eerste twee buffers een complex vormt met de POM die niet sterk communiceren met de nanopore. Bovendien werd de NaCl-elektrolyt opzettelijk gebruikt in plaats van KCl (evenals de andere alkalimetalen) om de neerslag van [PW11O39]7- door K+te voorkomen.
Cruciaal voor de nauwkeurige meting van de verblijfstijd verdelingen is de mogelijkheid om de stroom te meten op een voldoende hoge bandbreedte. Met exponentieel verdeelde verblijfs tijden zijn er bijvoorbeeld veel meer blokkades met korte dan lange verblijfs tijden, en een accurate schatting van de tijd verdelingen van de verblijfplaats wordt beter bereikt door een grote hoeveelheid gegevens te verzamelen (d.w.z. het verwerven van zo hoog als een bandbreedte de elektrische capaciteit van het systeem mogelijk maakt). Om deze aandoening in nanodeeltjes spectroscopie te bereiken, moet de systeemcapaciteit (membraan en verdwaalde capaciteit) worden geminimaliseerd. De verdwaalde capaciteit wordt verminderd door de lengte van alle aansluitkabels te verminderen en door hoge kwaliteit elektrische contacten te gebruiken. De membraan capaciteit wordt geminimaliseerd door het oppervlak van de dubbellaagte verminderen, waardoor de dikte van ondersteunende materialen (d.w.z. kwarts, polytetrafluorethyleen, enz.) wordt verlaagd en het gebied van blootgestelde ondersteunende materialen wordt verlaagd. aan de elektrolyt. In de praktijk zal de verdwaalde capaciteit van een typisch instrument (≈ 2 pF) het lawaai voor membranen ≈ 1 micron tot 5 micron in diameter beperken. Dit vormt de beperking van de methode. De detectie van kleine en hoog geladen enkelvoudige moleculen kan bijvoorbeeld een uitdaging zijn vanwege hun relatief korte verblijfstijd.
Het mechanisme waarmee druk de aansturing van de kanaal invoeging mogelijk maakt, is niet volledig begrepen. De kwarts microcapillairen hebben een zeer kleine diameter waarop het membraan wordt gevormd. Door de druk toe te passen zal het membraan uitpueren (waardoor het membraanoppervlak toeneemt) en eventueel het membraan dun worden. Beide effecten zouden de snelheid verhogen waarmee kanalen in het membraan zullen vormen. Wanneer een enkel kanaal spontaan vormt, verlaagt u de druk om te voorkomen dat er extra kanalen worden ingevoegd. De verwijdering van niet-ingebracht αHL uit de waterige fase in bulk is niet vereist als de αHL-concentratie voldoende laag is.
De structuren en heffingen van polyoxometalates worden momenteel bestudeerd met behulp van traditionele analytische chemie technieken, waaronder NMR, ultraviolette-zichtbare, infrarood-en Raman-spectroscopie, massaspectrometrie en röntgendiffractie. We verwachten dat nanometer-metingen de karakterisering van deze en andere fysische eigenschappen van POMs zullen aanvullen, evenals de studie van hun specialisering bij lage concentratie, die het synthetische traject van polyoxometalaten beter zal begrijpen Vorming. Er werd ook eerder aangetoond dat de αHL porie zelfs een onderscheid kan maken tussen 2 isomeren van de Trivacante Keggin Form na8hpw9O3430.
Samengevat, we hebben aangetoond dat een membraan-gebonden eiwit-nano polymeer kan worden gebruikt voor het opsporen en karakteriseren van Tungsten oxide metallic clusters (heteropolytungstates) in oplossing met behulp van een eenvoudige hoge-resolutie elektrische meting. De gevoeligheid van deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk om subtiele verschillen in de POM structuur te volgen die zich voordoen bij verschillende pH-waarden bij concentraties die aanzienlijk lager zijn (> 70-voudige) dan vereist voor traditionele methoden zoals NMR Spectroscopie. Vanwege het enkele molecuul detectievermogen van nanodeeltjes kan de werkelijke aantoonbaarheidsgrens in de methode veel lager worden gemaakt door de stroom voor langere tijd te meten (de opnamesnelheid wordt geschaald in verhouding tot de POM-concentratie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar voor de financiële steun van de Europese organisatie voor moleculaire biologie voor een postdoctoraal Genootschap (aan j) en een subsidie van het NIH NHGRI (naar J.J.K.). We waarderen de hulp van professoren Jingyue Ju en Sergey Kalachikov (Columbia University) voor het verstrekken van heptameric αHL, en voor inspirerende discussies met professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
References
- Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
- Bezrukov, S., Kasianowicz, J. Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel. Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).
- Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations. Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).
- Please, T. R., Ayub, M. Solid-State Nanopore. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , Elsevier Inc. 121-140 (2013).
- Dekker, C.
- Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).
- Akeson, M., et al. Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules. Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).
- Singer, A., Meller, A. Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes. Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).
- Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an α-hemolysin nanopore. Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).
- Halverson, K. M., et al. Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).
- Oukhaled, G., et al. Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording. Physical Review Letters. 98 (15), 158101 (2007).
- Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).
- Robertson, J. W. F., et al. Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).
- Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -K., Rühe, J., Behrends, J. C. Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray. ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).
- Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters. Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).
- Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore. Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).
- Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry. Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).
- Campos, E., et al. Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the α-hemolysin nanopore. Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).
- Campos, E., et al. The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the α-hemolysin nanopore. Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).
- Baaken, G., et al. High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore. ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).
- Berzelius, J. J. Beitrag zur näheren Kenntniss des Molybdäns. Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).
- Long, D. -L., Burkholder, E., Cronin, L. Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices. Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).
- Muller, A., et al. Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies. Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).
- Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting. Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).
- Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications. Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).
- Busche, C., et al. Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters. Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).
- Pope, M., Müller, A. Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, Springer Science & Business Media. Dordrecht. (2012).
- Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F.
- Gao, N., et al. Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer's disease. Nature Communications. 5, 3422 (2014).
- Pope, M. T. Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1983).
- Braha, O., et al. Designed protein pores as components for biosensors. Chemistry & Biology. 4 (7), 497-505 (1997).
- Forstater, J. H., et al. MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data. Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).
- Balijepalli, A., et al. Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements. ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).
- Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel. Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).
- Piguet, F., et al. Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore. Nature Communication. 9 (966), (2018).
