Summary
在这里,我们提出了一个协议,使用基于生物纳米孔的电子平台,在单分子极限处检测离散金属氧簇、多氧金属酸盐(POM)。该方法为研究这些分子的传统分析化学工具提供了补充方法。
Abstract
单个分子可以通过测量它们减少流经单个纳米刻度孔的离子电流的程度来检测和特征。信号是分子的物理化学性质及其与孔隙相互作用的特征。我们证明,由细菌蛋白外毒素金黄色葡萄球菌α溶酶(αHL)形成的纳米孔可以在单分子极限处检测多氧金属酸盐(POM、离子金属氧簇)。此外,同时测量溶液中12磷酸POM(PTA,H3PW12O40)的多种降解产物。纳米孔法的单分子灵敏度使POM的显著浓度显著低于核磁共振(NMR)光谱。该技术可作为化学家研究多氧金属酸盐或其他金属簇的分子特性,更好地了解POM合成工艺,并可能提高其产量的新工具。假设,可以使用这种方法研究给定原子的位置或分子中片段的旋转以及金属氧化状态。此外,这项新技术的优点是能够实时监测溶液中的分子。
Introduction
使用纳米孔和测量离子电流调制,可以在单分子水平上检测生物分子分析物。通常,纳米孢子根据其制造分为两类:生物(由蛋白质或DNA折纸自行组装)1、2、3或固态(例如,由半导体加工工具)4,5.虽然固态纳米孔被认为具有潜在的物理上更坚固,可用于广泛的溶液条件,但迄今为止,蛋白质纳米孔具有更高的灵敏度、更强的抗结垢性、更大的带宽、更好的化学性选择性,以及更大的信噪比。
各种蛋白质离子通道,如金黄色葡萄球菌α-溶酶(αHL)形成的通道,可用于检测单个分子,包括离子(例如,H+和D=2,3,多核苷酸(DNA)和RNA)6,7,8,损坏的DNA9,多肽10,蛋白质 (折叠和展开)11,聚合物 (聚乙烯乙二醇等)12,13,14、金纳米粒子15、16、17、18、19等合成分子20。
我们最近证明,αHL纳米孔还可以轻松地在单分子水平上检测和表征金属簇,多氧金属酸盐(POM)。POM 是 1826年发现的离散纳米级电子金属氧簇,自那时以来,已经合成了更多类型。现在可用的多氧金属酸盐的不同尺寸、结构和元素组合物具有广泛的特性和应用,包括化学 22、23、催化24、材料科学25 ,26和生物医学研究27,28,29。
POM 合成是一种自组装过程,通常通过混合所需的单体金属盐量来在水中进行。一旦形成,POM 表现出巨大的大小和形状的多样性。例如,Keggin聚苯乙烯结构,XM12O40q-由一个异构体(X)组成,四氧包围形成四面体(q是电荷)。异构体位于由12个八面体MO6单位(其中M = 在高氧化状态下过渡金属)形成的保持架内,由相邻的共享氧原子相互连接。虽然钨多氧金属结构在酸性条件下稳定,氢氧化离子导致金属氧(M-O)键30的水解裂解。这种复杂的过程导致一个或多个MO6八面体亚单位的损失,导致形成单空和三空物种,并最终完全分解POM。我们在这里的讨论将仅限于pH5.5和7.5的12磷酸的部分分解产物。
该协议的目的是使用基于生物纳米孔的电子平台在单分子极限处检测离散金属氧团。此方法允许检测溶液中的金属簇。溶液中的多个物种可以比传统的分析方法更灵敏地进行区分33。通过它,可以阐明POM结构的细微差异,其浓度明显低于NMR光谱所需的浓度。重要的是,这种方法甚至允许对Na8HPW9O341的等同形式进行区分。
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Protocol
注意:以下协议特定于电子生物科学 (EBS) 纳米片直流系统。然而,它可以很容易地适应其他电生理学仪器,用于测量电流通过平面脂双层膜(标准脂质双层膜室,U管几何,拉微毛细血管等)。给出了商业材料及其来源的鉴定,以描述实验结果。在任何情况下,这种鉴定都并不意味着国家标准与技术研究所的建议,也不意味着材料是最好的。
1. 溶液和分析剂制备
- 从 1 型净水系统中制备 18 MΩ-cm 水的所有电解质溶液,去除微量有机物,然后在电离通道记录前通过 0.22 μm 真空过滤器过滤所有电解质溶液。
注意:水质是影响膜纳米孔系统稳定性和寿命的关键因素。 - 野生类型 =HL。
- 处理 βHL 毒素蛋白时,请遵循 MSDS 预防措施。
- 将冻干野生型单体S. aureus +-溶血辛 (αHL) 粉末与 18 MΩ-cm 水混合,以 1mg/mL 表示。将样品的10至30μL等分分分配到冷冻安全离心管中,在液氮中快速闪烁冻结,然后储存在-80°C。或者,使用纯化的预制半球+ HL31。
- 将脂质 1,2-二苯基-sn-Glycero-3-磷胆碱 (DPhyPC) 溶解至 0.2 mg/mL n-脱胶,在 4 mL 玻璃闪烁小瓶中,带聚四氟乙烯氯联涂层盖。将溶液储存在 4°C,重复使用长达一个月。
- 准备磷酸溶液。
- 在处理磷钨酸粉时,请遵循 MSDS 预防措施,并通过溶解 57.6 mg H3PW12O40到 10 mL 的 1 M NaCl 和 10 mM NaH2PO4来制备 2 mM 磷酸库存溶液解决方案,构成库存解决方案。
- 取此溶液的 5 mL,用 3 M NaOH 将 pHH 调整为 5.5。使用 3 M NaOH 将库存溶液的其他 5 mL 的 pH 量调整为 7.5。
注意:在pH 5.5时,12磷酸(PTA,H3PW12O40)主要分解成单空的太阳神[PW11O39]7-。
2. 测试单元组件
- 根据制造商的说明组装测试单元。
- 用600砂纸磨砂后,将一根Ag/AgCl线浸入漂白剂(次氯酸钠)10分钟。将电极放置在石英纳米孔膜 (QNM) 内。
- 将圆柱形 AgCl 颗粒电极嵌入 QNM 外的银线中。
- 设置测试单元后,打开电源和数据采集程序。在测试单元中没有溶液的情况下,确保直流电流读数为 0 pA。
- 使用通过流体管路连接到测试单元的注射器在 QNM 表面上方添加缓冲电解质溶液,并确保离子电流使放大器饱和。如果没有,QNM 可能会堵塞。施加爆裂电压 (± 1 V) 和/或大于 300 mm Hg 的压力以清除它。如果可行,请降低电压和压力。
3. 脂质双层形成
- 在测试单元中填充溶液,使溶液水平远高于 QNM 的面。然后通过注射器将溶液水平降低到面部以下,使电流降至零。
- 将 10 μL 移液器尖端浸入脂质小瓶中。按下移液器尖端的后端,在小瓶的侧面点击,以去除所有可见的脂质。
- 当溶液水平高于QNM表面时,将移液器尖端触摸到测试单元中溶液的空气-水接口上,等待两到五分钟,使脂质均匀扩散。
- 缓慢地将溶液水平降低到QNM表面以下,直到电流饱和,然后缓慢地将溶液水平提升到QNM表面,形成脂质双层膜。
- 一旦双层结构出现(即,当电流达到零时),尝试通过增加压力并确保 QNM 不堵塞来弹出它几次。要改革脂质双层膜,将溶液水平降低到QNM表面以下,然后慢慢升高。
- 如果脂质双层膜没有在第一次形成,将溶液降低到面部下方,然后再次升高。如果在3次试验后没有形成,如3.2和3.3所述,添加更多脂质。
- 形成膜后,当应用的电位为零时,将电流偏移设置为零。
4. •HL 孔隙形成
- 在测试细胞中加入2.5 ng的纯化预制β HL半球蛋白样品(或250 ng的单体βHL),以启用通道形成。
- 形成双层后,用气密注射器(图1)增加双层结构的压力,以扩大QNM的膜,促进纳米孔插入。根据每个 QNM,升高施加的背压通常在 40 到 200 mmHg 之间。
注意:EBS 软件具有自动插入功能,该功能应用更高的偏置(通常为 200 到 400 mV)来诱导孔隙形成,然后在单个通道形成后自动将所需电压降至测量偏置。 - 形成纳米孔后,将背压降低到插入压力的1⁄2左右。如果观察到多个通道,则通过显著降低压力来去除它们。
5. 纳米孔中的金属簇分区
- 为了考虑电极不平衡,设置直流偏移电压,这样当施加的电位设置为零时,没有测量电流。
- 在添加 POM 样品之前,执行控制实验,以确保储液罐中没有污染物(例如,从以前的实验中跟踪 POM)。具体来说,在没有任何POM的情况下,在应用电位+120 mV至-120 mV下采集离子电流轨迹,以验证不存在自发电流封锁。
注意:由于αHL通道的不对称结构(图1),离子电流的放大作用因正极和负效应而不同。测量电流比高于此施加电压表示膜中αHL 纳米孔的方向。 - 以 1 至 5 mM 浓度的金属聚类溶液冲洗储液罐,加入 POM 样品。或者,在细胞组装之前将样品加载到毛细管中,以研究 POM 分区到 αHL 通道的另一端。
- 使用制造商的软件记录离子电流,以检测将单个 POM 分区到纳米孔中引起的瞬态电流封锁。从离子电流封锁深度、事件频率和封锁的停留时间分布估计分子的物理和化学性质。
6. Ion 通道记录和数据分析
- 使用高阻抗、低噪声放大器和数据采集系统获取离子电流时间序列测量。在每个 pH 的应用电压 -120 mV(相对于通道cis侧)下执行测量。
- 对信号应用低通 100 kHz 8 极贝塞尔滤波器,该滤波器随后在 500 kHz(即2 ms/点)下进行数字化。从时间序列中提取事件,并使用MOSAIC软件包32、33中的 ADEPT 算法分析事件。
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Representative Results
在过去的二十年中,膜结合蛋白纳米级孔被证明为多功能的单分子传感器。基于纳米孔的测量相对简单。 两个充满电解质溶液的腔室由嵌入在电绝缘脂质膜中的纳米孔隔开。修补夹放大器或外部电源通过浸入电解质储液罐中的 Ag/AgCl电极,在整个纳米孔中提供静电电位。电场将单个带电粒子驱动到孔隙中,从而根据粒子的大小、形状和电荷,产生离子电流的瞬态减小。计算机程序控制施加的电压,并实时监控分子逆向分割到孔隙中产生的离子电流封锁。电流通过低噪声、高阻抗场效应晶体管进行放大并转换为电压,并使用数据采集卡进行数字化。
在这里,我们提供用生物纳米孔检测多氧金属酸盐的一般程序。如图2所示,在添加 POM 之前,无阻碍通道的平均开路电流为 ± 100 pA,应用电位为 -120 mV。增加 POM 会产生瞬态封锁,并将离子电流降低约 80%。正如所料,由于这些粒子是负电荷,当应用电位极性反转时,不会观察到封锁。请注意,如果 POM 没有与孔壁交互,它们会在大约 100 ns 内漫射孔,这太短,无法用传统的贴片夹放大器检测出来。因此,给定粒子在孔隙中的大多数时间是粒子和孔隙之间相互作用的直接结果。离子电流封锁事件的持续时间定义为停留时间 tau (*)。
为了说明这种方法的效用,我们讨论了使用αHL纳米孔来监测pH5.5和pH7.5下12磷酸(PTA,H3PW12O40)的分解。这种分解可以通过31P NMR 测量进行观察,但所需的浓度为 2 mM,而纳米孔测量需要小于 30 μM,因为纳米孔测量灵敏度较低。在pH 5.5,[PW11O39=7-是主要物种30 。
数据分析是通过计算相对封锁深度比的直方图(即<i> /< i o>,其中 <i> 是孔隙中的 POM 的平均值电流和 <io o)> 是平均开路通道电流)。平均电流封锁深度比的直方图在 -120 mV 和 pH 5.5 处显示一个较小的峰值,在 <i>/<io> = 0.06 和主峰值在/<io> = 0.16 (图 3),绿色)。我们假设这些峰值对应于 [P2W5O23=6-和 [PW11O39=7-,基于31P NMR。31P NMR研究表明,增加pH值会改变这两个物种的相对浓度,这一点由图3所示两个峰面积的变化得到证实。
当POM溶液在原位下被分额至pH 7.5时,由于双主体物种部分降解为无机盐(即游离磷酸盐,HxPO4=3+x),总POM浓度降低和东州,WO42=离子)。相对封锁深度比的直方图还显示两个主峰(图3,橙色),但事件减少20倍(这表明pH 7.5处的总POM浓度比pH5.5时的总POM浓度低约20倍,如果在两个 pH 值下,纳米孔的 POM 捕获效率相同)。有趣的是,在pH 7.5及更高时,在31P NMR光谱中未检测到此处观察到的POM物种,原因是它们与磷酸盐和钨离子分离导致浓度低。
孔隙中每个事件的停留时间由单个离子电流封锁的持续时间定义。居住时间的分布提供了对存在的不同物种的洞察。早期表明,对于由不同大小的聚物(乙二醇)聚合物引起的封锁,该聚合物每种尺寸的停留时间分布由单个指数很好地描述。这一结果表明,该聚合物的相互作用是一种简单的可逆化学反应12,13,20。
图 4表明,两个峰值的停留时间分布在 pH 5.5 和 7.5 时得到了很好的区分。两个功能是明确的。首先,在所有条件下,需要多个指数来适应每个分布,这表明每个物种中都有POM的变化。其次,与pH 5.5相比,毛孔在pH7.5处的停留时间要短得多,这表明毛孔和POM之间的相互作用减弱。以前已经表明,pH 的变化会改变αHL 通道流明内或附近的固定电荷的相对数量。这些变化将直接改变与孔内分区POM的交互,从而修改其停留时间34,35。
图1:实验设置的原理图。单聚氧糖酯分子基于纳米孔的表征方法。一种在4nm厚的脂质双层膜中自我组装的蛋白质纳米孔,在玻璃毛细管和较大的储液罐中由水电解质溶液浸透。用气密注射器对玻璃毛细管施加压力,以帮助纳米孔结合。电位V与一对匹配的 Ag/AgCl 电极一起涂在膜上,并通过孔孔驱动离子电流(例如,Na+和 Cl-)。电流通过高阻抗放大器转换为电压,使用模拟到数字转换器 (ADC) 进行数字化并存储在计算机上。计算机软件通过数字到模拟转换器 (DAC) 控制应用电位,并实时监控由分裂到孔隙的单分子引起的瞬态电流封锁。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:基于纳米孔的单个金属纳米粒子的检测。在纳米孔装置中添加 POM 溶液之前和之后发生的离子电流时间序列轨迹的图示。将单个离子 POM 分区到孔隙中会导致平均开孔电流 <io> 中的瞬态电流降低。 (右)典型事件,说明孔隙中粒子的平均电流(
图3:当前封锁深度比的直方图,pH 5.5和7.5。POM诱导离子电流封锁深度比的直方图,在pH 5.5 (绿色)和 7.5 (橙色)与应用电位 V = -120 mV。在这些条件下,每个pH值处存在的两个峰对应于溶液中已知的主要POM物种。目前的封锁深度比率为 0 和 1,分别对应于完全阻塞和打开的孔隙。直方图的创建柱宽度为 0.001,并通过除以数据采集时间将其归化为计数/s。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:停留时间分布和拟合几个指数。在半日志图中,pH 5.5 和 7.5 观察到的由两种主要物种(图 4中的峰值 1 和 2)引起的 POM 引起的电流封锁的停留时间分布。对于这两个物种,在较高的pH值下,停留时间明显缩短,这表明毛孔和POM之间的相互作用发生了变化。实线适合指数混合模型与数据。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
由于其离子电荷,POM 可能通过静电相互作用与有机计数器阳离子相关联。因此,确定适当的溶液条件和正确的电解质环境(尤其是溶液中的阳离子)以避免与 POM 形成复杂情况非常重要。在缓冲液选择中需要特别小心。例如,使用三联甲酸甲烷和柠檬酸缓冲溶液的POM的捕获率明显低于磷酸盐缓冲溶液中的捕获率,这可能是因为前两个缓冲液中的任何一个与POM形成复合物,而POM不会与纳米孔的强相互作用。此外,NaCl电解质被特意用于代替KCl(以及其他碱金属),以避免[PW11O39] 7- K+的沉淀。
准确测量停留时间分布的关键是在足够高的带宽下测量电流的能力。例如,在以指数分布的居住时间下,与长期居住时间相比,存在比长时间更短的封锁,通过收集大量数据(即,以系统电电容允许的带宽获得)。为了在纳米孔光谱中达到此条件,应尽量减少系统电容(膜和杂散电容)。通过减少所有连接电缆的长度并使用高质量的电气触点,可降低杂散电容。通过减小双层材料的表面面积、增加支撑材料(即石英、聚四氟乙烯等)的厚度以及减小暴露的支撑材料的面积,将膜电容降至最低电解质。实际上,典型仪器的杂散电容(± 2 pF)将限制膜的噪声 = 直径为 1 微米至 5 微米。这构成了方法的限制。例如,由于小分子和高电荷单分子的停留时间相对较短,因此其检测可能具有挑战性。
压力控制通道插入的机制尚未完全了解。石英微毛细管的直径非常小,形成膜。施加压力会导致膜膨胀(从而增加膜表面积),并可能使膜变薄。这两种效应都会增加通道在膜中形成的速度。当单个通道自发形成时,降低压力以防止插入额外的通道。如果αHL 浓度足够低,则不需要从散装水相中去除非插入的 αHL。
目前,使用传统的分析化学技术,包括NMR、紫外线可见光、红外和拉曼光谱学、质谱和X射线衍射,对多氧金属酯的结构和电荷进行了研究。我们期望纳米孔测量将补充这些和POM的其他物理特性的表征,以及研究其低浓度的物种,这将有助于更好地了解多氧金属酸盐的合成途径形成。之前还表明,α HL孔孔甚至可以区分 2 个异构体的三空 Keggin 形式 Na8HPW9O3430。
总之,我们已经证明,一种膜结合蛋白纳米孔可用于检测和表征溶液中的氧化钨金属簇(异聚子类)。这种新方法提供的灵敏度允许跟踪 POM 结构中的细微差异,这些差异在浓度远低于传统方法(如 NMR)时,以不同的 pH 值产生(> 70 倍)光谱。由于纳米孔的单分子检测能力,通过测量较长时间的电流(捕获速率与POM浓度成比例),该方法的实际检测极限大大降低。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
我们感谢欧洲分子生物学组织为博士后奖学金(J.E.)和NIH NHGRI(J.J.K.)提供的赠款提供财政支助。我们感谢朱景岳教授和谢尔盖·卡拉奇科夫教授(哥伦比亚大学)提供半球 +HL 的帮助,以及与弗吉尼亚联邦大学约瑟夫·赖纳教授的鼓舞人心的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
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