Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att detektera diskreta metall syre kluster, polyoxometalater (POMs), vid den enda molekyl gränsen med hjälp av en biologisk nanopore-baserad elektronisk plattform. Metoden ger ett kompletterande förhållningssätt till traditionella analytiska kemi verktyg som används vid studiet av dessa molekyler.
Abstract
Enskilda molekyler kan upptäckas och kännetecknas genom att mäta graden av vilken de minskar den joniska strömmen flyter genom en enda nanometer skala por. Signalen är karakteristisk för molekylers fysikalisk-kemiska egenskaper och dess interaktioner med por. Vi visar att nanopore bildas av bakteriell protein exotoxin Staphylococcus aureus alfa gemolizinovoj (αhl) kan detektera polyoxometalates (poms, anjon metall syre kluster), vid den enda molekyl gränsen. Dessutom mäts samtidigt flera nedbrytningsprodukter av 12-fosfotungstic Acid POM (PTA, H3PW12O40) i lösningen. Nanopore-metodens enda molekyl känslighet gör det möjligt för POMs att kännetecknas av betydligt lägre koncentrationer än vad som krävs för kärnmagnetisk resonans (NMR)-spektroskopi. Denna teknik kan fungera som ett nytt verktyg för kemister att studera de molekylära egenskaperna hos polyoxometalater eller andra metalliska kluster, för att bättre förstå POM syntetiska processer, och möjligen förbättra deras avkastning. Hypotetiskt, placeringen av en given Atom, eller rotation av ett fragment i molekylen, och metalloxidations tillståndet kunde undersökas med denna metod. Dessutom har denna nya teknik fördelen av att tillåta realtidsövervakning av molekyler i lösning.
Introduction
Detektera biomolekylära analyter på den enda molekylnivå kan utföras med hjälp av nanoporer och mäta Joniska nuvarande modulationer. Typiskt, nanoporer är indelade i två kategorier baserat på deras tillverkning: biologisk (självmonterad från protein eller DNA origami)1,2,3, eller solid-state (t. ex., tillverkas med verktyg för halvledar bearbetning)4,5. Medan solid-state nanoporer föreslogs som potentiellt mer fysiskt robust och kan användas över ett brett spektrum av lösnings villkor, protein nanoporer hittills erbjuder större känslighet, mer motstånd mot nedsmutsning, större bandbredd, bättre kemisk selektivitet och ett större signal-brus-förhållande.
En mängd olika protein jonkanaler, såsom den som bildas av Staphylococcus aureus α-gemolizinovoj (αhl), kan användas för att detektera enstaka molekyler, inklusive joner (t. ex.,H + och D+)2,3, polynukleotider (DNA och RNA)6,7,8, skadat DNA9, polypeptider10, proteiner (vikta och ovikt)11, polymerer (polyetylenglykol och andra)12,13 , 14, Guldnanopartiklar15,16,17,18,19och andra syntetiska molekyler20.
Vi har nyligen visat att αHL nanopore också lätt kan detektera och karakterisera metalliska kluster, polyoxometalater (POMs), på den enda molekylnivån. POMs är diskreta nanoskala anjonisk metall syre kluster som upptäcktes 182621, och sedan dess har många fler typer syntetiserats. De olika storlekarna, strukturerna och elementarkompositionerna av polyoxometalater som nu finns tillgängliga ledde till ett brett spektrum av egenskaper och tillämpningar, inklusive kemi22,23, katalys24, materialvetenskap25 ,26, och biomedicinsk forskning27,28,29.
POM-syntes är en själv monteringsprocess som normalt utförs i vatten genom att blanda de stoichiometriskt erforderliga mängderna monomermetallsalter. När bildas, POMs uppvisar en stor mångfald av storlekar och former. Till exempel, Keggin polyanion struktur, XM12O40q- består av en heteroatom (X) omgiven av fyra oxygener för att bilda en tetraeder (q är avgiften). Heteroatomen är centralt placerad i en bur som bildas av 12 oktaedriska Mo6 enheter (där M = övergången metaller i deras höga Oxidationstillstånd), som är kopplade till varandra genom angränsande gemensamma syreatomer. Medan volfram polyoxometalates struktur är stabil i sura förhållanden, hydroxidjoner leda till hydrolytisk klyvning av metall-syre (M-O) obligationer30. Denna komplexa process resulterar i förlusten av en eller flera Mo6 oktaedriska subunits, vilket leder till bildandet av monoledig och triledig arter och så småningom till fullständig nedbrytning av poms. Vår diskussion här kommer att begränsas till de partiella sönderdelningsprodukter av 12-fosfotungstic syra vid pH 5,5 och 7,5.
Målet med detta protokoll är att detektera diskreta metall syre kluster vid den enda molekyl gränsen med hjälp av en biologisk nanopore-baserad elektronisk plattform. Denna metod gör det möjligt att upptäcka metalliska kluster i lösning. Flera arter i lösning kan diskrimineras med större känslighet än konventionella analysmetoder33. Med det kan subtila skillnader i POM struktur klarläggas, och vid koncentrationer markant lägre än de som krävs för NMR spektroskopi. Viktigare är att detta tillvägagångssätt även tillåter diskriminering av isomeriska former av na8HPW9O341.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: Protokollet nedan är specifikt för den elektroniska biovetenskaper (EBS) Nanopatch DC-system. Emellertid, det kan lätt anpassas till andra elektrofysiologi apparat som används för att mäta strömmen genom plana lipidbilayer membran (standard lipidbilayer membran kammare, U-rör geometri, drog mikrokapillärer, etc.). Identifieringen av kommersiellt material och deras källor ges för att beskriva de experimentella resultaten. I inget fall innebär detta identifiering antyder rekommendation av det nationella institutet för standarder och teknik, inte heller innebär det att materialen är de bästa tillgängliga.
1. beredning av lösning och analyt
- Förbered alla Elektrolytlösningar med 18 MΩ cm vatten från ett typ-1 vattenreningssystem för att ta bort spår organiska arter och sedan filtrera alla Elektrolytlösningar genom ett 0,22 μm vakuum filter omedelbart före Jon kanals inspelningar.
Anmärkning: Vattenkvaliteten är en kritisk faktor för stabiliteten och livslängden hos membranet nanopore systemet. - Wild typ αHL.
- Följ SDB-försiktigheterna vid hantering av αHL toxin protein.
- Blanda frystorkat vildtyp monomer S. aureus α-hemolysin (αHL) pulver med 18 MΩ-cm vatten vid 1 mg/ml. Fördela 10 till 30 μL alikvoter av provet i kryosäkra centrifugrör, snabbt frysa i flytande kväve och förvara vid-80 ° c. Alternativt kan du använda renad förformad heptameric αHL31.
- Lös upp Lipiden 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DPhyPC) till 0,2 mg/mL i n-decane i en 4 ml glas scintillationskampull med en polytetrafluoreethyleneeflon-belagd mössa. Förvara lösningen vid 4 ° c för upprepad användning i upp till en månad.
- Bered fosfotungstic Acid-lösningar.
- Följ SDB försiktighetsåtgärder vid hantering av phosphotungstic syra pulver och Förbered en 2 mM fosfotungstic syra stamlösning genom att lösa 57,6 mg H3PW12O40 i 10 ml av en 1 M NaCl och 10 mm NaH2Po4 lösning, som utgör stamlösningen.
- Ta 5 mL av denna lösning och justera pH till 5,5 med 3 M NaOH. Justera pH-värdet för de övriga 5 mL av stamlösningen till 7,5 med 3 M NaOH.
Anmärkning: Vid pH 5,5 sönderdelas 12-fosfotungstic syra (PTA, H3PW12O40) i första hand till den monolediga anjon [PW11O39]7-.
2. testa cell sammansättningen
- Montera test cellen enligt tillverkarens anvisningar.
- Blöt en AG/AgCl tråd i blekmedel (natriumhypoklorit) i 10 minuter efter att slipa den med 600 sandpapper. Placera elektroden innanför kvarts nanopore-membranet (QNM).
- Placera en cylindrisk AgCl pellets elektrod inbäddad i en silvertråd utanför QNM.
- När test cellen har ställts in slår du på strömförsörjningen och datainsamlingsprogrammet. Se till att DC ström avläsningen är 0 pA i avsaknad av lösning i test cellen.
- Använd en spruta ansluten till test cellen via en vätske linje för att lägga till buffrad elektrolytlösning över ansiktet på QNM och för att säkerställa att den joniska strömmen mättat förstärkaren. Om den inte gör det, kan QNM vara igensatta. Använd en pop spänning (± 1 V) och/eller ett tryck större än 300 mm Hg för att rensa den. Om det fungerar, minska spänningen och trycket.
3. lipidbilayer bildas
- Fyll lösningen i test cellen så att lösnings nivån är långt över ansiktet på QNM. Sänk sedan lösnings nivån via spruta till under ansiktet, så att strömmen sjunker till noll.
- Doppa en 10 μL pipettspets i injektionsflaskan med lipider. Tryck på den bakre änden av pipettspetsen och knacka på den på sidan av injektionsflaskan för att ta bort alla synliga lipider.
- Vidrör pipettspetsen på luft vatten gränssnittet för lösningen i test cellen när lösnings nivån ligger över QNM-ansiktet och vänta i två till fem minuter för att Lipiden ska spridas jämnt.
- Sakta sänka lösnings nivån under ansiktet av QNM tills den nuvarande mättade fettsyror, och sedan sakta höja lösnings nivån förbi ansiktet på QNM att bilda ett lipidbilayer membran.
- När ett lipidens verkar bildas (dvs, när strömmen går till noll), prova poppar det flera gånger genom att öka trycket och se till att QNM inte är igensatt. Att reformera lipidbilayer membranet, sänka lösnings nivån under ansiktet av QNM och sakta höja den.
- Om lipidbilayer membranet inte bildas första gången, sänk lösningen under ansiktet och höja den igen. Om det inte bildas efter 3 prövningar, tillsätt fler lipider som beskrivs i 3,2 och 3,3.
- När du har bildat ett membran anger du den aktuella förskjutningen till noll när den tillämpade potentialen är noll.
4. αHL pore-formation
- Tillsätt 2,5 ng av renat, färdigbildat αHL-heptameric-proteinprov (eller 250 ng av monomerisk αhl) till test cellen (volym ≈ 200 μl) för att möjliggöra kanal bildning.
- Öka trycket på lipidens med en gastät spruta (figur 1) efter en lipidens bildas, för att expandera membranet från QNM, och underlätta nanopore insättning. Höj det applicerade mottrycket typiskt mellan 40 till 200 mmHg, beroende på varje QNM.
Anmärkning: Den EBS programvara har en automatisk insättnings funktion som gäller en högre bias (typiskt 200 till 400 mV) för att inducera por formation och sedan automatiskt minskar den önskade spänningen till mätningen bias när en enda kanal former. - Efter en nanopore former, minska mottrycket till ca 1 ⁄ 2 av insättnings tryck. Om flera kanaler observeras, ta bort dem genom att avsevärt minska trycket.
5. metalliskt kluster partitionering i Nanopore
- För att redogöra för elektrod obalans, Ställ in DC offset spänning så att när den tillämpade potentialen är inställd på noll finns ingen uppmätt ström.
- Innan du lägger till POM-provet, utför ett kontroll experiment för att säkerställa att det inte finns några föroreningar (t. ex.spårnings-poms från ett tidigare experiment) i behållaren. Specifikt förvärva en Jon ström spår under en tillämpad potential på + 120 mV till-120 mV i avsaknad av några POMs att kontrollera att inga spontana nuvarande blockader är närvarande.
Anmärkning: På grund av den asymmetriska strukturen på αHL-kanalen (figur 1), kommer magnitute av den joniska strömmen att skilja sig åt för positiva och negativa applicerade potentialer. Förhållandet av den uppmätta strömmen ovanför denna tillämpade spänning är indikativt för orienteringen av αHL nanopore i membranet. - Tillsätt POM-provet genom att spola behållaren med metallisk klusterlösning med en koncentration på 1 till 5 mM. Alternativt kan du ladda provet i kapillär före cell sammansättningen för att studera delningen av POMs i den andra änden av αHL-kanalen.
- Spela in den joniska strömmen med hjälp av tillverkarens programvara för att upptäcka övergående ström blockader som orsakas av partitionering av enskilda POMs i nanopore. Uppskatta de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos molekylen från det Joniska nuvarande blockeringsdjupet, händelsefrekvensen och uppehålls tidens fördelning av blockaderna.
6. Jon kanals inspelningar och data analys
- Förvärva de joniska aktuella tidsserierna mätningar med hjälp av en hög impedans, låg-brus förstärkare och datainsamlingssystem. Utför mätningarna vid en tillämpad spänning på-120 mV (i förhållande till kanal CIS sida) för varje pH.
- Applicera ett low-pass 100 kHz 8-poligt Bessel-filter på signalen, som därefter digitaliseras vid 500 kHz (dvs 2 ms/punkt). Extrahera händelser från tidsserierna och analysera händelser med hjälp av adept-algoritmen i mosaik mjukvarupaketet32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under de senaste två decennierna, membran-bundet protein nanometer-skala porer har visats som mångsidig Single-molekyl sensorer. Nanopore-baserade mätningar är relativt enkla att utföra. Två kammare fyllda med elektrolytlösning separeras av en nanopore inbäddad i ett elektriskt isolerande Lipidmembran. Antingen en patch-klämma förstärkare eller en extern strömförsörjning ger en elektrostatisk potential över nanopore via AG/AgCl elektroder nedsänkt i elektrolytreservoarer. Det elektriska fältet driver enskilda laddade partiklar i por, vilket ger övergående minskningar i den joniska strömmen som beror på storlek, form och laddning av partiklarna. Ett datorprogram styr den applicerade spänningen och övervakar, i Real-Time, de joniska ström blockaderna som orsakas av molekylar reversibelt att partitionera in i pmalen. Strömmen förstärks och konverteras till spänning med en låg-brus, hög impedans fält-effekttransistor och digitaliseras med hjälp av ett datainsamlings kort.
Här ger vi ett allmänt förfarande för att detektera polyoxometalater med en biologisk nanopore. Som framgår av figur 2, före tillsats av poms den obehindrad kanal har en genomsnittlig öppen kanal ström av ~ 100 Pa vid en tillämpad potential-120 MV. Tillägg av åtgärdsprogrammen ger övergående blockader och minskar den joniska strömmen med cirka 80%. Som förväntat, eftersom dessa partiklar är negativt laddade, blockaderna observeras inte när polariteten av den tillämpade potentialen är omvänd. Observera att om POMs inte interagera med pore väggen, skulle de diffusa genom por ' s i ca 100 ns, vilket är alldeles för kort för att upptäckas med en konventionell patch klämma förstärkare. Således, merparten av tiden en given partikel tillbringar i por är en direkt följd av samspelet mellan partikel och por. Varaktigheten av en Jon ström blockad händelse definieras som uppehållstiden, Tau (τ).
För att illustrera nyttan av denna metod, diskuterar vi användningen av en αHL nanopore att övervaka nedbrytningen av 12-fosfovolframsyra (PTA, H3PW12O40) vid pH 5,5 och pH 7,5. Denna nedbrytning kan observeras med 31P NMR mätningar, men koncentrationen behövs är 2 mm medan nanopore mätningar behöver mindre än 30 μm, på grund av nanopore mätning känslighet. Vid pH 5,5, [PW11O39]7- är den dominerande arten30.
Dataanalysen utförs genom att beräkna ett histogram av den relativa blockerande djup kvoten (dvs<jag>/<io>, där <jag> är den genomsnittliga strömmen med Pom i por och <jago > är den genomsnittliga öppna kanal strömmen). Histogrammet av medelvärdet nuvarande blockad djup nyckeltal vid-120 mV och pH 5,5 uppvisar en mindre topp på <i>/<io> ≈ 0,06 och större topp på < i >/<io> ≈ 0,16 (figur 3 , grön). Vi antar att dessa toppar motsvarar [P2W5O23]6- och [PW11O39]7-, respektive, baserat på 31p NMR. 31 P NMR-studier tyder på att en ökning av pH-värdet förändrar den relativa koncentrationen av dessa två arter, och detta bekräftas av förändringen i området för de två topparna som visas i figur 3.
När Pom-lösningen titreras till pH 7,5 ex situminskar den totala Pom-koncentrationen på grund av den partiella nedbrytningen av de två huvudarterna till oorganiska salter (dvs. fritt fosfat, HxPo4−3 + x och tungstat, wo42− joner). Histogrammet för relativ blockad djup förhållandet visar också två huvudsakliga toppar (figur 3, orange), men med 20-faldig färre händelser (vilket tyder på den totala POM koncentrationen vid pH 7,5 är cirka 20 gånger mindre än vid pH 5,5, om Nanopores fångst effektivitet för POMs är densamma vid de två pH-värdena). Det är intressant att notera att vid pH 7,5 och högre, de POM arter som observerats här inte upptäcktes i 31P NMR spektrum på grund av deras låga koncentration orsakad av deras dissociation till fosfat och tungstatjoner.
Varje evenemangs uppehållstid i pore definieras av varaktigheten av de enskilda Joniska nuvarande blockader. Fördelningen av uppehållstider ger insikt i de olika arter som är närvarande. Det visades tidigare att för blockader som orsakats av en annorlunda storlek polymerer av poly (etylenglykol), är uppehållstiden fördelningen för varje storlek av denna polymer väl beskrivas av en enda exponentiell. Detta resultat tyder på samspelet mellan denna polymer är en enkel reversibel kemisk reaktion12,13,20.
Figur 4 illustrerar att uppehålls tids fördelningarna för de två topparna var väl differentierade vid pH 5,5 och 7,5. Två funktioner är tydliga. Först, under alla förhållanden, flera exponentials krävs för att passa varje distributioner, vilket tyder på att det finns variationer av POMs inom varje art. För det andra är uppehållstiden för POMs i pore mycket kortare vid pH 7,5 jämfört med de vid pH 5,5, vilket tyder på en försvagning av samspelet mellan por och POMs. Det har tidigare visats att en förändring av pH förändrar det relativa antalet fasta laddningar i eller i närheten av αHL-kanallumen. Dessa förändringar kommer att direkt förändra samspelet med partitionering poms inne i por och därför ändra sina uppehållstider34,35.
Figur 1: Schematiskt diagram över försöks installationen. Metod för nanopore-baserad karakterisering av enskilda polyoxometalatmolekyler. Ett protein nanopore som själv monterar i en 4 Nm tjockt lipidbilayer membran badar av vattenlösning elektrolyt i ett glas kapillär och större reservoar. Ett tryck appliceras på glaset kapillär med en gas tight spruta för att underlätta nanopore inkorporering. En potentiell V appliceras över membranet med ett matchat par av AG/AgCl elektroder och driver en jonisk ström (t. ex., na+ och cl-) genom pore. Strömmen konverteras till spänning med en hög impedansförstärkare, digitaliserad med en analog till digital omvandlare (ADC) och lagras på en dator. Datorprogramvara styr den tillämpade potentialen genom en digital till analog omvandlare (DAC) och bildskärmar, i realtid, den övergående nuvarande blockader som orsakas av enstaka molekyler som partitionen i por. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Nanopore-baserad detektion av enskilda Metallo-nanopartiklar. En illustration av Joniska aktuella tidsserie spår som inträffar före och efter tillsats av en pom lösning till nanopore apparaten. Delningen av individ anjon POMs in i pmalen orsakar övergående ström minskningar i den genomsnittliga öppna pore strömmen, <io>. (Höger) En typisk händelse som illustrerar den genomsnittliga strömmen av blockaden (<i>) och uppehåll tiden (τ) av partikeln i pmalen. Den tillämpade potentialen var-120 mV, och lösningarna innehöll 1 M NaCl, 10 mM NaH2Po4 vid pH 5,5. CIS-utrymmet innehöll också 30 μM 12-fosfovolatsyra. Det nuvarande blockad djupet (<i>/<io>) och uppehållstiden (τ) ger information om vilka Pom-arter som finns i lösningen. Under de förhållanden som vi använde här, Gate inte αHL kanal (spontant Stäng) när POMs inte är närvarande. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: histogram av den aktuella blockaden för djup vid pH 5,5 och 7,5. Histogram av den POM-inducerad Joniska nuvarande blockad djup förhållandet vid pH 5,5 (grön) och 7,5 (orange) med en tillämpad potential V =-120 MV. De två toppar som finns vid varje pH-värde motsvarar de kända dominerande POM-arterna i lösningen under dessa förhållanden. De nuvarande blockeringsdjupsproportionerna 0 och 1 motsvarar en helt blockerad och öppen por, respektive. Histogrammen skapades med en bin bredd på 0,001 och normaliserades till antal/s genom att dividera med datainsamlings tiden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: uppehållstid fördelning och montering med flera exponentials. Fördelningen av uppehållstider för POM-inducerad nuvarande blockader som orsakats av de två viktigaste arterna (toppar 1 och 2 i figur 4) observerades vid pH 5,5 och 7,5 i en semi-log tomt. För båda arterna är uppehållstiden markant kortare vid det högre pH-värdet, vilket tyder på att samspelet mellan pore och POMs förändrats. De solida linjerna är anfall av en exponentiell blandnings modell till datan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av deras anjoniska laddning, POMs sannolikt förknippar med organiska räknare cations genom elektrostatiska interaktioner. Därför är det viktigt att identifiera rätt lösnings förhållanden och rätt elektrolytmiljöer (särskilt katjoner i lösning) för att undvika komplexbildning med POMs. Särskild försiktighet krävs vid buffertvalet. Till exempel är fångst takten för POMs med tris (hydroximetyl) aminometan och citronsyra-buffrade lösningar betydligt lägre än i fosfatbuffrad lösning, troligen på grund av att någon av de två första buffertarna bildar ett komplex med den POM som inte interagera starkt med nanopore. Dessutom var NaCl elektrolyten avsiktligt används i stället för KCl (liksom andra alkalimetaller) för att undvika utfällning av [PW11O39]7- av K+.
Kritisk till exakt mätning av uppehållstid distributioner är förmågan att mäta den aktuella på en tillräckligt hög bandbredd. Till exempel, med exponentiellt fördelade uppehållstider finns det långt fler blockader med kort än långa uppehållstider, och en noggrann uppskattning av uppehållstid distributioner bättre uppnås genom att samla in en hel del data (dvs. förvärva den på så hög som en bandbredd systemets elektriska kapacitans tillåter). För att uppnå detta tillstånd i nanopore spektroskopi bör systemet kapacitans (membran och herrelösa kapacitans) minimeras. Strö kapacitans reduceras genom att minska längden på alla anslutande kablar och använda högkvalitativa elektriska kontakter. Membranet kapacitansen minimeras genom att minska ytan av bilayer, öka tjockleken av stödjande material (dvs., kvarts, polytetrafluoreten, etc.), och minska området för exponerade stödjande material till elektrolyten. I praktiken, en typisk instrumentets strökapacitans (≈ 2 pF) kommer att begränsa bullret för membran ≈ 1 micron till 5 micron i diameter. Detta utgör metodens begränsning. Till exempel kan upptäckten av små och mycket laddade enstaka molekyler vara utmanande på grund av deras relativt korta uppehållstider.
Mekanismen genom vilken trycket möjliggör kontroll av kanal insättning är inte helt klarlagd. Kvarts mikrokapillärerna har en mycket liten diameter på vilken membranet bildas. Att använda tryck kommer att orsaka membranet att utbuktning (därmed öka membranet yta) och möjligen tunna membranet. Båda effekterna skulle öka hastigheten med vilken kanalerna kommer att bildas i membranet. När en enda kanal spontant bildas, minska trycket för att förhindra införandet av ytterligare kanaler. Avlägsnande av icke-insatt αHL från bulkvatten-fasen krävs inte om αHL-koncentrationen är tillräckligt låg.
Polyoxometalates strukturer och laddningar studeras för närvarande med hjälp av traditionella analytiska kemi tekniker, inklusive NMR, ultraviolett synlig, infraröd och Ramanspektroskopi, masspektrometri och röntgendiffraktion. Vi förväntar oss att nanopore mätningar kommer att komplettera karakterisering av dessa och andra fysikaliska egenskaper av POMs, samt studiet av deras artbildning vid låg koncentration, vilket kommer att bidra till att bättre förstå den syntetiska vägen av polyoxometalates Bildandet. Det visades också tidigare att αHL pore till och med kan skilja mellan 2 isomerer av den Trilediga Keggin-formen na8hpw9O3430.
Sammanfattnings, har vi visat att ett membran-bundet protein nanopore kan användas för att upptäcka och karakterisera volfram oxid metalliska kluster (heteropolytungstates) i lösning med hjälp av en enkel högupplöst elektrisk mätning. Den känslighet som denna nya metod ger medger spårning av subtila skillnader i POM-strukturen som uppstår vid olika pH-värden vid koncentrationer som är betydligt lägre (> 70-faldigt) än vad som krävs för traditionella metoder som NMR Spektroskopi. På grund av den enda molekyl detekterings förmågan hos nanoporer, kan den faktiska detektionsgränsen i metoden göras mycket lägre genom att mäta strömmen under längre tider (fångst hastigheten skalas i proportion till POM-koncentrationen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för ekonomiskt stöd från den Europeiska Molekylärbiologi organisationen för en postdoktor gemenskap (till J.E.) och ett bidrag från NIH NHGRI (till J.J.K.). Vi uppskattar hjälp av professorer Jingyue ju och Sergey Kalachikov (Columbia University) för att ge heptameric αHL, och för inspirerande diskussioner med professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
References
- Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
- Bezrukov, S., Kasianowicz, J. Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel. Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).
- Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations. Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).
- Please, T. R., Ayub, M. Solid-State Nanopore. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , Elsevier Inc. 121-140 (2013).
- Dekker, C.
- Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).
- Akeson, M., et al. Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules. Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).
- Singer, A., Meller, A. Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes. Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).
- Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an α-hemolysin nanopore. Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).
- Halverson, K. M., et al. Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).
- Oukhaled, G., et al. Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording. Physical Review Letters. 98 (15), 158101 (2007).
- Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).
- Robertson, J. W. F., et al. Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).
- Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -K., Rühe, J., Behrends, J. C. Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray. ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).
- Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters. Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).
- Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore. Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).
- Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry. Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).
- Campos, E., et al. Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the α-hemolysin nanopore. Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).
- Campos, E., et al. The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the α-hemolysin nanopore. Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).
- Baaken, G., et al. High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore. ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).
- Berzelius, J. J. Beitrag zur näheren Kenntniss des Molybdäns. Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).
- Long, D. -L., Burkholder, E., Cronin, L. Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices. Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).
- Muller, A., et al. Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies. Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).
- Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting. Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).
- Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications. Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).
- Busche, C., et al. Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters. Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).
- Pope, M., Müller, A. Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, Springer Science & Business Media. Dordrecht. (2012).
- Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F.
- Gao, N., et al. Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer's disease. Nature Communications. 5, 3422 (2014).
- Pope, M. T. Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1983).
- Braha, O., et al. Designed protein pores as components for biosensors. Chemistry & Biology. 4 (7), 497-505 (1997).
- Forstater, J. H., et al. MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data. Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).
- Balijepalli, A., et al. Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements. ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).
- Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel. Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).
- Piguet, F., et al. Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore. Nature Communication. 9 (966), (2018).
