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Genetics

उत्पादत्मक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट्स के साथ P1 Transduction द्वारा ई कोलाई में जीन विलोपन का उत्पादन

Published: September 1, 2018 doi: 10.3791/58267
Automatic Translation
1, 1, 1
1Evolution and Genetics, Department of Biosciences, University of Oslo

Summary

यहां हम पूर्व के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान एंटीबायोटिक प्रतिरोध-कैसेट विलोपन अंय ई. कोलाई उपभेदों में हटाने म्यूटेंट बनाने के लिए एक आधार के रूप में निर्माण । ऐसे विलोपन उत्परिवर्तनों जुटाया जा सकता है और एक प्राप्तकर्ता P1 भोजी transduction का उपयोग कर तनाव के इसी लोकस में डाला ।

Abstract

एक पहले दृष्टिकोण के लिए बैक्टीरिया में एक अज्ञात जीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए एक दस्तक इस जीन का बना है । यहां, हम भोजी P1 के साथ सामान्यीकृत transduction का उपयोग करके एक दूसरे के लिए एक ई कोलाई तनाव से जीन विलोपन उत्परिवर्तनों के हस्तांतरण के लिए एक मजबूत और तेजी से प्रोटोकॉल का वर्णन । इस विधि की आवश्यकता है कि उत्परिवर्तन चयन किया जा (जैसे, जीन व्यवधान एंटीबायोटिक कैसेट निवेशन का उपयोग कर के आधार पर) । इस तरह के एंटीबायोटिक कैसेट एक दाता तनाव से जुटाया जा सकता है और ब्याज की एक प्राप्तकर्ता तनाव में शुरू करने के लिए जल्दी और आसानी से एक जीन विलोपन उत्परिवर्ती उत्पंन । एंटीबायोटिक कैसेट को flippase मांयता साइटों है कि एक साइट द्वारा कैसेट के उत्पाद विशेष recombinase एक साफ नॉक आउट केवल एक ~ १००-आधार जोड़ी-जीनोम में लंबे निशान अनुक्रम के साथ उत्पादन की अनुमति शामिल डिजाइन किया जा सकता है । हम एक विधानसभा में शामिल तम जीन एंकोडिंग के द्वारा प्रोटोकॉल का प्रदर्शन ट्रांसपोर्टर के साथ जुड़े हुए हैं और इस नॉक-आउट के प्रभाव का परीक्षण करते हैं, जो दो trimeric ट्रांसपोर्टर adhesins के काम करते हैं । हालांकि P1 transduction द्वारा जीन विलोपन अपनी सीमाओं, आसानी और उसके कार्यांवयन की गति है यह जीन विलोपन के अंय तरीकों के लिए एक आकर्षक विकल्प है ।

Introduction

एक आम पहले दृष्टिकोण के लिए एक जीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए दस्तक mutagenesis बाहर प्रदर्शन और परिणामस्वरूप phenotype का निरीक्षण है । यह भी रिवर्स आनुवंशिकी का कार्यकाल है । जीवाणु ई. कोलाई पिछले ७० साल या तो के लिए आणविक जीवविज्ञान के workhorse गया है, अपनी संवर्धन और आनुवंशिक हेरफेर1के लिए अपनी सुविधा की आसानी की वजह से । कई तरीकों ई. कोलाईमें जीन विलोपन का उत्पादन करने के लिए विकसित किया गया है, मार्कर एक्सचेंज mutagenesis सहित2,3 और, अधिक हाल ही में, recombineering का उपयोग कर λ लाल या आरएसी एट सिस्टम4,5 , 6.

एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रणाली में, व्यक्तिगत जीन की कोडिंग अनुक्रम एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट है कि बाद में5गुणसूत्र,7से उत्पादीकरण किया जा सकता है द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं । कोडिंग अनुक्रम, उदाहरण के लिए एक कनमीसिन (कान) प्रतिरोध कैसेट, जो flippase (FLP) मांयता लक्ष्य (FRT) दोनों ओर साइटों द्वारा पार्श्व है द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं । FRT साइटों recombinase FLP, जो FRT कान कैसेट के विलोपन के लिए अग्रणी साइटों के बीच साइट विशिष्ट पुनर्संयोजन मध्यस्थता द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे हैं । इस तरह, एक दिया है जीन कोडिंग अनुक्रम का पूरा विलोपन प्राप्त किया जा सकता है, लगभग १०० आधार जोड़े (बीपी) (चित्रा 1) के केवल एक ंयूनतम निशान अनुक्रम पीछे जा ।

बस एक दशक से अधिक पहले, तथाकथित कईयो संग्रह विकसित किया गया था । यह एक जीवाणु एक मानक प्रयोगशाला ई. कोलाई K12 तनाव, पर आधारित पुस्तकालय है, जहां लगभग सभी गैर आवश्यक जीन व्यक्तिगत रूप से λ लाल पुनर्संयोजन द्वारा नष्ट कर दिया गया7,8। इस संग्रह के भीतर क्लोन प्रत्येक एक कोडन अनुक्रम एक उत्पादत्मक कान प्रतिरोध कैसेट के साथ प्रतिस्थापित किया है । कईयो संग्रह के लिए कई आवेदन9के लिए एक उपयोगी उपकरण साबित हो गया है । ऐसा ही एक आवेदन अंय ई. कोलाई उपभेदों में विलोपन म्यूटेंट का उत्पादन है । एक दिया विलोपन क्लोन से कान कैसेट ऐसे P110,11,12,13,14के रूप में आम तौर पर transducing bacteriophages, द्वारा जुटाया जा सकता है । एक फेज इस तरह के एक तनाव से तैयार स्टॉक तो ब्याज की एक प्राप्तकर्ता ई. कोलाई तनाव को संक्रमित किया जा सकता है, जहां एक कम लेकिन विश्वसनीय आवृत्ति पर कान कैसेट युक्त क्षेत्र मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा प्राप्तकर्ता जीनोम में शामिल किया जा सकता है (चित्रा 2) । Transductants के लिए कान युक्त मध्यम पर विकास के लिए चुना जा सकता है । इस के बाद, यदि एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट को हटाने वांछित है, FLP recombinase ट्रांस में transductant तनाव को आपूर्ति की जा सकती है । FLP युक्त प्लाज्मिड, जो एक एम्पीसिलीन (amp) प्रतिरोध मार्कर, कान और amp के प्रति संवेदनशील क्लोन किया जाता है इलाज के बाद, और जंगली प्रकार कोडिंग अनुक्रम और कान कैसेट के सही उत्पाद कॉलोनी पीसीआर द्वारा सत्यापित कर रहे हैं ।

यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है, एक नॉक आउट ई. कोलाई ऊपर उल्लिखित रणनीति के आधार पर तनाव के उत्पादन में कदम से प्रत्येक का वर्णन । उदाहरण के रूप में, तम जीन को हटाने का प्रदर्शन किया जाता है । तम encodes एक बाहरी झिल्ली β-बैरल प्रोटीन है कि परिवहन और विधानसभा मॉड्यूल (टैम), जो कुछ ही ट्रांसपोर्टर प्रोटीन और पिली15,16,17की उत्पत्ति में शामिल है का एक हिस्सा है । इस नॉक आउट तनाव के कारण दो trimeric के adhesins (ताळा), Yersinia adhesin बेकार और ई. कोलाई immunoglobulin (़)-बाध्यकारी ताा EibD की उत्पत्ति पर तमोगुण विलोपन के प्रभाव की जांच की गई । 18,19.

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Protocol

1. उपभेदों और Plasmids

  1. बैक्टीरियल उपभेदों
    1. ई. कोलाई उपभेदों BW251135, JW4179 (BW25113 तम:: कान)7, BL21 (DE3)20, और BL21ΔABCF21का उपयोग करें । अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
  2. Bacteriophages
    1. सामांय transduction के लिए फेज P1वीरसिंह का उपयोग करें । क्लोरोफॉर्म की कुछ बूंदों के साथ एक तरल स्टॉक के रूप में फेज स्टोर (२.२ कदम देखें) । अधिक जानकारी के लिए, सामग्री तालिकादेखें ।
  3. Plasmids
    1. इस प्रोटोकॉल में निंन plasmids का उपयोग करें: pCP2022, pIBA2-बेकार23, और pEibD1024। नियंत्रण plasmids के रूप में, pASK-IBA2 और pET22b ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें ।
  4. विकास की स्थिति
    1. एक lysogeny शोरबा में बैक्टीरिया का प्रचार (LB) मध्यम25 जोरदार झटकों के साथ (180-200 rpm) ३७ डिग्री सेल्सियस या 30 डिग्री सेल्सियस पर BL21ΔABCF और pCP20 युक्त उपभेदों के मामले में ।
    2. ४३ ° c पर प्लाज्मिड इलाज निष्पादित करें ।
    3. एक ठोस माध्यम के लिए, 1% के साथ पौंड अनुपूरक आगर (डब्ल्यू/
    4. शीर्ष आगार के लिए, ०.७% आगर और 10 mM CaCl2 के साथ पूरक पौंड और मध्यम आटोक्लेव । 26electroporation के बाद वसूली के लिए समाज माध्यम का प्रयोग करें ।
    5. एंटीबायोटिक दवाओं के लिए निंनलिखित सांद्रता का प्रयोग करें: Amp के लिए १०० μg/एमएल और 25 μg/

2. एक फेज Lysate की तैयारी

  1. दाता तनाव का संक्रमण
    1. पौंड मध्यम के 5 मिलीलीटर में दाता तनाव JW4197 बढ़ो 10 मिमी CaCl2 के साथ पूरक और वैकल्पिक रूप से (25 µ जी/एमएल) के साथ एक ऑप्टिकल घनत्व ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) ~ १.० । एक spectrophotometer का उपयोग कर आयुध डिपो६०० मूल्य को मापने ।
    2. पौंड मीडियम में मौजूदा P1 फेज शेयर की एक कमजोर श्रृंखला बनाएं: अनुशंसित कमजोरियां 10-3 से 10-7के बीच होती हैं ।
    3. मिश्रण २०० बैक्टीरियल निलंबन और १०० एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब या समकक्ष में दिए गए फेज कमजोर पड़ने के μL के μL । फेज कमजोर पड़ने के रूप में कई ट्यूबों के रूप में तैयार । मिलाते हुए बिना ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ट्यूब मशीन ।
    4. ~ पिघला हुआ शीर्ष आगर के 3 मिलीलीटर जोड़ें (~ ५० ° c) 10 मिमी CaCl2 ट्यूबों के साथ पूरक, शीघ्र ही ट्यूबों भंवर द्वारा अच्छी तरह से सामग्री मिश्रण, और भी परतों बनाने के लिए गरम पौंड प्लेटों पर मिश्रण डालना.
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटें ।
  2. Lysate तयारी
    1. अगले दिन फेज सजीले टुकड़े की अर्द्ध-धाराप्रवाह वृद्धि के साथ एक थाली का चयन करें । एक अर्द्ध-धाराप्रवाह प्लेट पर, प्लेट के लगभग आधे सतह क्षेत्र स्पष्ट (चित्रा 3) है ।
    2. एक टीका पाश या एक समान उपकरण का उपयोग कर इस तरह के एक थाली से शीर्ष आगर परत परिमार्जन और एक केंद्रापसारक ट्यूब में शीर्ष आगार जगह है । पौंड के 1-2 मिलीलीटर और क्लोरोफॉर्म और भंवर की एक बूंद के लिए जोरदार ट्यूब ~ 1 मिनट जोड़ें । एक धुएं डाकू में क्लोरोफॉर्म जोड़ें ।
    3. ४,००० x जी पर 15 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक या तेजी से आगर और बैक्टीरियल कोशिकाओं गोली ।
    4. एक ताजा microcentrifuge ट्यूब करने के लिए supernatant हटो, गोली से किसी भी मलबे पर ले जाने से परहेज । क्लोरोफॉर्म के 2 बूंदें जोड़ें और 4-10 डिग्री सेल्सियस पर lysate की दुकान । एक धुएं डाकू में क्लोरोफॉर्म जोड़ें । फेज lysate के रूप में इस संक्रामक कणों की संख्या का एक महत्वपूर्ण कमी में परिणाम होगा फ्रीज मत करो ।
  3. lysate titer का निर्धारण
    1. BW25113 में वृद्धि 10 मिमी CaCl2 के साथ पूरक में ३७ ° c जब तक संस्कृति ~ १.० के एक आयुध डिपो६०० तक पहुंचता है ।
    2. पौंड में फेज lysate के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार (जैसे, 10-6-10-9) ।
      नोट: lysate के ऊपर से सैंपल को प्लास्टिक के लिए क्लोरोफॉर्म ट्रांसफर करने से बचने के लिए सावधान रहें ।
    3. मिश्रण २०० बैक्टीरियल निलंबन और १०० एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब या समकक्ष में दिए गए फेज कमजोर पड़ने के μL के μL । फेज कमजोर पड़ने के रूप में कई ट्यूबों के रूप में तैयार । मिलाते हुए बिना ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ट्यूब मशीन ।
    4. जोड़ें ~ पिघला हुआ शीर्ष आगर के 3 मिलीलीटर (~ ५० ° c) 10 मिमी CaCl2 ट्यूबों के साथ पूरक, सामग्री अच्छी तरह से ट्यूबों शीघ्र ही भंवर द्वारा मिश्रण, और भी परतों बनाने के लिए गरम पौंड प्लेटों पर मिश्रण डालना.
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटें ।
    6. निम्नलिखित दिन प्रत्येक प्लेट के लिए सजीले टुकड़े की संख्या (बैक्टीरियल चटाई में स्पष्ट क्षेत्रों) की गणना और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग कर lysate के titer की गणना:
      Equation 1
      उदाहरण: 10-7, 10-8और 10-9कमजोर पड़ने वाली प्लेटों पर, क्रमशः २३१, 27, और 2 सजीले टुकड़े हैं । के रूप में १०० प्रत्येक कमजोर पड़ने के μL संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया गया था, और क्योंकि titer पट्टिका बनाने इकाइयों (pfu)/mL के रूप में व्यक्त किया जाता है, चढ़ाना कारक है 10 । ये संख्याएं सूत्र में दर्ज की गई हैं:
      Equation 2
      इस प्रकार, titer लगभग है 2 x 10 10 संक्रामक फेज कणों/

3. P1 Transduction

  1. प्राप्तकर्ता कक्ष तैयार कर रहा है
    1. पौंड में प्राप्तकर्ता तनाव BL21ΔABCF बढ़ो ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) ~ १.० में एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए पूरक । आयुध डिपो६०० मान को मापने के लिए एक spectrophotometer का उपयोग करें ।
    2. ०.५ के संक्रमण (MOI) मूल्य की बहुलता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक फेज lysate की मात्रा की गणना करें । MOI की गणना करने के लिए, संस्कृति के आयुध डिपो६०० के आधार पर बैक्टीरिया की संख्या का अनुमान । मान लें कि १.० के एक आयुध डिपो६०० मान ~ 109 cfu/एमएल से मेल खाती है । lysate के ज्ञात titer के आधार पर आवश्यक वॉल्यूम की गणना करें ।
      उदाहरण (चरण 2.3.6 के बाद उदाहरण में परिकलित titer पर आधारित):
      Equation 3
    3. 10 मिमी और मिश्रण करने के लिए प्राप्तकर्ता तनाव संस्कृति के लिए2 CaCl जोड़ें । transduction के लिए संस्कृति के 1 मिलीलीटर ले लो ।
  2. transduction प्रदर्शन
    1. फेज lysate के 1 मिलीलीटर (10 मिमी पर CaCl2 सहित) के रूप में चरण 3.1.2 में परिकलित और धीरे मिश्रण करने के लिए उपयुक्त मात्रा जोड़ें ।
      नोट: मिश्रण करने के लिए क्लोरोफॉर्म स्थानांतरित करने से बचने के लिए lysate के ऊपर से नमूना पिपेट करने के लिए सावधान रहें.
    2. स्थैतिक ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मिश्रण की मशीन ।
    3. सोडियम साइट्रेट जोड़कर संक्रमण रोकें, पीएच ५.५, १०० mM ।
    4. जीवाणु (2 मिनट के लिए ५,००० x g ) और supernatant हटाने के लिए, तो उंहें ताजा पौंड के 1 मिलीलीटर में resuspend १०० mM सोडियम साइट्रेट, पीएच ५.५ के साथ पूरक ।
    5. कोशिकाओं को दो बार धोने के रूप में कदम 3.2.4 में मुक्त phages और कैल्शियम को हटाने सुनिश्चित करने के लिए ।
    6. १०० mM सोडियम साइट्रेट, पीएच ५.५ के साथ पूरक ताजा पौंड की 1 मिलीलीटर में बैक्टीरिया resuspend । मिलाते के साथ 1 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया की मशीन (> १०० rpm) ।
    7. (2 मिनट के लिए ५,००० एक्स जी ) केंद्रापसारक द्वारा बैक्टीरिया ले लीजिए और उंहें १०० mM सोडियम साइट्रेट, पीएच ५.५ के साथ £ के ~ १०० μL में resuspend ।
    8. 25 µ g/एमएल और 10 मिमी सोडियम साइट्रेट, पीएच ५.५ पर कान के साथ पूरक एक पौंड प्लेट पर बैक्टीरिया फैल, और कालोनियों (~ 24 एच) प्रकट होने तक 30 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु बढ़ने ।
  3. transductants का चयन
    1. एक बार कालोनियों के चयन की थाली पर हो गए हैं, उंहें एक ही कालोनियों के लिए पौंड + कान पर लकीर और 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने तक एकल कालोनियों दिखाई देते हैं ।

4. कान की कैसेट को एक्साइज

  1. पुनर्संयोजन प्लाज्मिड के साथ परिवर्तन
    1. कान प्रतिरोधी BL21ΔABCF तनाव electrocompetent बनाओ ।
      1. ताजा पौंड (5 मिलीलीटर) में एक ही कॉलोनी से तनाव बढ़ने 30 ° c पर (25 µ g/एमएल) कान के साथ पूरक जब तक आयुध डिपो६०० ~ 0.5-0.7 है ।
      2. यहां से, 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर निंनलिखित कदम उठाने । जीवाणु (10 मिनट के लिए ५,००० x g ) और supernatant को दूर करने के लिए ।
      3. पिछले केंद्रापसारक कदम दोहरा और अंत में, बर्फ ठंड 10% ग्लिसरॉल के १०० µ एल में सेल गोली पुनः स्थगित करके दो बार आइस-ठंड आसुत पानी के साथ सेल गोली धो लो ।
    2. बर्फ पर 1 मिमी electroporation cuvettes शांत हो जाओ ।
    3. सेल सस्पेंशन करने के लिए प्लाज्मिड डीएनए (pCP20) के 1 स्नातकोत्तर जोड़ें, धीरे निलंबन मिश्रण, और यह एक ठंडा electroporation cuvette के लिए स्थानांतरण ।
    4. १.८ केवी के लिए electroporator सेट और कोशिकाओं electroporate ।
    5. समाज माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ने और 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए उन्हें बढ़ रही द्वारा बचाव कोशिकाओं बदल.
    6. थाली पौंड + Amp प्लेटों पर कोशिकाओं के १०० µ एल और 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को विकसित ।
  2. पुनर्संयोजन की प्रेरण
    1. पौंड + Amp प्लेट से एकल कालोनियों उठाओ और inoculate ताजा पौंड सभी एंटीबायोटिक्स लोप ।
    2. FLP recombinase की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए रातोंरात गैर-स्वतंत्र तापमान (४३ ° c) पर कोशिकाओं को बढ़ाएँ ।
  3. recombinants का चयन
    1. धारावाहिक कमजोर पड़ने और प्लेट ५० µ एल के एक 105-106 कमजोर पड़ने पर गैर चुनिंदा प्लेटें और यह 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ती बनाओ ।

5. जीन विलोपन का सत्यापन

  1. प्लाज्मिड हानि और सफल पुनर्संयोजन का सत्यापन
    1. इस क्रम में, 4.3.1 पर पौंड + कान, पौंड + Amp, और पौंड प्लेटों पर चरण में तैयार प्लेटों से एकल कालोनियों । लकीर में सहायता करने के लिए, एक कॉलोनी ग्रिड का उपयोग करें ( अनुपूरक फ़ाइल 1देखें) । 30 ° c पर प्लेटें जब तक कालोनियों (~ 24 एच) दिखाई देते हैं ।
    2. 10-20 क्लोन है कि गैर चयनात्मक प्लेट पर हो गए है लेकिन आगे सत्यापन के लिए चयनात्मक मीडिया पर बढ़ने में विफल उठाओ ।
  2. कॉलोनी पीसीआर ने किया अतिरिक्त सत्यापन
    1. तम कोडिंग अनुक्रम ( सामग्री की तालिकादेखें) के अस्तर प्राइमरों के साथ एक कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन ।
    2. एक मास्टर पीसीआर मिक्स तैयार करते हैं । मिश्रण की जरूरत की राशि का परीक्षण किया जा करने के लिए कालोनियों की संख्या पर निर्भर करता है ( 1 तालिकामें उदाहरण देखें). मिश्रण बर्फ पर रिएजेंट, पोलीमरेज़ पिछले जोड़ें ।
    3. पीसीआर मास्टर मिक्स अच्छी तरह से मिक्स, तो एक पीसीआर पट्टी की नलियों में 20 µ एल बांटना । प्रत्येक कॉलोनी की एक छोटी राशि उठाओ एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग कर दिखलाई जा करने के लिए और एक ट्यूब के लिए इसे जोड़ने. तुलना के लिए मूल प्राप्तकर्ता दबाव शामिल करने के लिए याद रखें । वैकल्पिक रूप से, भी दाता तनाव शामिल हैं ।
    4. एक पीसीआर प्रतिक्रिया भागो (प्रयोग कार्यक्रम के लिए तालिका 2 देखें) ।
    5. 1% agarose जेल तैयार करें ।
      1. ५० मिलीलीटर जेल के लिए, agarose के ०.५ ग्राम को मापने और ताे बफर (४० mm Tris, 20 एमएम एसिटिक एसिड, और 1 एमएम EDTA, पीएच ८.०) के ५० मिलीलीटर जोड़ें । एक माइक्रोवेव ओवन में मिश्रण गर्मी जब तक सभी agarose भंग कर दिया है ।
      2. एक बार agarose भंग कर दिया है, लगभग ५० डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान शांत, और फिर डीएनए धुंधला डाई के 5 μL जोड़ें । घोल को अच्छी तरह मिला लें और उसे एक जेल ट्रे में एक कास्टिंग चैंबर में डाल दें । अच्छी तरह से कंघी की एक या अधिक पंक्तियां डालें ताकि सभी नमूनों के लिए पर्याप्त कुओं, साथ ही आणविक आकार मार्करों हैं । 30 मिनट के लिए सेट करने के लिए जेल की अनुमति दें ।
    6. पीसीआर चलाने के एक बार पूरा हो गया है, प्रत्येक नमूने के लिए 6x डीएनए लोडिंग डाई के 4 µ एल जोड़ें । जेल को ट्रो चैंबर में रखें और जब तक कुओं को ढक कर रखा जाए ताे बफर डालें ।
    7. जेल में एक अच्छी तरह से एक पीसीआर प्रतिक्रिया से 10-15 µ एल लागू करें । इसके अलावा एक आणविक आकार मार्कर के 5 µ एल जोड़ें । फिर, 30 मिनट के लिए जेल में चलाने ७५ V ।
    8. एक बार चलाने के पूरा हो गया है, छवि एक नीली बत्ती imager का उपयोग कर जेल ।

6. अन्य तकनीक

  1. प्रोटीन एक्सप्रेशन
    नोट: परीक्षण प्रोटीन की अभिव्यक्ति (बेकार और EibD) विस्तार में वर्णित किया गया है कहीं23,24। यह मुख्य चरणों का संक्षिप्त सारांश है ।
    1. रूपांतर BL21ΔABCF Δतम wय इथ आवश्यक plasmids (pIBA2-बेकार और pEibD10 तथा इसी नियंत्रण plasmids) और transformants के लिए LB + Amp पर चयन करें ।
    2. प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, एक रात में बदल बैक्टीरिया की संस्कृति के 1 मिलीलीटर के साथ पौंड मध्यम + Amp के inoculate १०० मिलीलीटर और मध्य लॉग चरण, जो समय पर, या तो anhydrotetracycline के साथ प्रोटीन उत्पादन प्रेरित (१०० एनजी/ isopropyl thiogalactoside (०.५ मिमी पर) ।
    3. प्रेरण के 2 ज के बाद 30 डिग्री सेल्सियस, संस्कृतियों के turbidity उपाय और ५० एमएल के आयुध डिपो६०० = १.० पर 15 मिनट के लिए ४,००० x gपर संस्कृतियों के द्वारा इसी की एक संख्या इकट्ठा । 10 मिमी HEPES, पीएच ७.४ के साथ गोली 1x धो लें, और फिर या तो यह दुकान पर-20 ° c या यह प्रक्रिया आगे के रूप में ६.२ चरण में ।
  2. बाहरी झिल्ली निष्कर्षण
    नोट: बाहरी झिल्ली निष्कर्षण लियो एट अल द्वारा विस्तार से वर्णित के रूप में किया जाता है । 27. मुख्य कदम नीचे संक्षेप हैं ।
    1. 10 मिमी HEPES, पीएच ७.४, 10 मिमी MgCl2 और MnCl2, lysozyme (०.१ मिलीग्राम/एमएल), और DNase मैं एक चुटकी के साथ पूरक के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
    2. लाइसे कोशिकाओं (जैसे, एक मनका डिब्बा का उपयोग कर) ।
    3. सेल मलबे को हटाने और एक ताजा ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरित करने के लिए शीघ्र ही (१५,६०० x gपर 2 मिनट) कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
    4. १६,००० x gपर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं केंद्रापसारक, जिसके बाद, 1% N के ४०० μL में गोली resuspend-lauroyl sarcosine 10 मिमी HEPES, पीएच ७.४ में ।
    5. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए आंदोलन के साथ कोशिकाओं मशीन, जिसके बाद, उंहें ऊपर के रूप में 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    6. 10 मिमी HEPES, पीएच ७.४ के २०० μL के साथ पारदर्शी गोली 1x धो सकते हैं, और फिर 10 मिमी HEPES के 30 μL में इसे resuspend और 4x μL-पृष्ठ नमूना बफर के 10 एसडीएस जोड़ें ।
  3. गतिविधि परख
    नोट:28के रूप में वर्णित बेकार और EibD के लिए एसडीएस-पृष्ठ और गतिविधि परख करते हैं । मुख्य कदम नीचे संक्षेप हैं ।
  4. एसडीएस-PAGE
    1. एक polyacrylamide जेल पर उन्हें लोड करने से पहले 5 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों गर्मी, प्रोटीन denaturing से बचने के लिए.
    2. एसडीएस-PAGE में जुदाई के बाद, एक polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली में प्रोटीन स्थानांतरण ।
    3. स्थानांतरण के बाद, पंजाब में 2% स्किम्ड-मिल्क पाउडर के साथ झिल्ली को ब्लॉक करें ।
  5. बेकार-कोलेजन सुदूर-पश्चिमी दाग
    1. ब्लॉक करने के बाद, गोजातीय कोलेजन प्रकार मैं 10 μg/एमएल और 1 एच के लिए झिल्ली की एकाग्रता के लिए बफर अवरुद्ध में पतला जोड़ें ।
    2. पंजाब के साथ झिल्ली 2x धो + ०.०५% Tween20 (पंजाब-टी) ।
    3. प्राथमिक एंटीबॉडी (मोनोक्लोनल विरोधी कोलेजन कर्नल-1) झिल्ली को जोड़ने के लिए, बफर अवरुद्ध में 1:2000 पतला ।
    4. 1 एच के लिए झिल्ली की मशीन के बाद, के रूप में चरण 6.3.2.2 में वर्णित 2x धो और फिर माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें [बकरी विरोधी माउस आईजीजी-सहिजन peroxidase (एचआरपी) संयुग्मी], पतला 1:10000 बफर अवरुद्ध में ।
    5. 1 एच के लिए झिल्ली की मशीन, तो यह पंजाबियों के साथ 2x धो टी । निर्माता के निर्देशों के अनुसार झिल्ली के लिए एक बढ़ाया chemiluminescent सब्सट्रेट जोड़ें और एक सीसीडी कैमरे का उपयोग कर बैंड का पता लगाने ।
  6. EibD-आईजीजी बाध्यकारी परख
    1. ब्लॉक करने के बाद, एक द्वितीयक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी खरगोश एचआरपी) जोड़ें, बफ़र अवरुद्ध में 1:2000 पतला ।
    2. 1 एच के लिए झिल्ली गर्मी, तो यह पंजाबियों के साथ 2x धो लो । चरण 6.3.2.5 में वर्णित के रूप में chemiluminescent डिटेक्शन निष्पादित करें ।

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Representative Results

BL21ΔABCF की एक तम नॉक आउट पीढ़ी:

ऊपर उल्लिखित रणनीति पहले BL21 के एक व्युत्पंन तनाव (DE3), एक मानक प्रयोगशाला प्रोटीन उत्पादन है, जो बाहरी झिल्ली प्रोटीन उत्पादन के लिए अनुकूलित है और21BL21ΔABCF कहा जाता है के लिए इस्तेमाल किया तनाव का उत्पादन किया गया है । यह तनाव चार प्रचुर मात्रा में बाहरी झिल्ली प्रोटीन के लिए कोडिंग जीन का अभाव है और, नतीजतन, और अधिक heterologously उत्पादन में सक्षम है बाहरी झिल्ली प्रोटीन व्यक्त की तुलना में जंगली प्रकार तनाव । यह परीक्षण करने के लिए कि ताम ताा में शामिल है या नहीं, इस पृष्ठभूमि में तम जीन हटाया गया.

एक P1 lysate कईयो संग्रह तनाव JW4179 से तैयार किया गया था, जहां तम जीन (पहले yftMकहा जाता है) कोडिंग अनुक्रम एक कान प्रतिरोध कैसेट की जगह है । फिर, एक transduction प्रयोग BL21ΔABCF के साथ प्राप्तकर्ता तनाव के रूप में किया गया था । कई कान प्रतिरोधी कालोनियों प्राप्त किया गया, जिसके बाद दो कान कैसेट के उत्पाद के लिए चुना गया । प्लाज्मिड pCP20, FLP recombinase एन्कोडिंग, इन क्लोनों में पेश किया गया था और, बाद में, एक एंटीबायोटिक चयन के अभाव में ४३ डिग्री सेल्सियस से बढ़ द्वारा ठीक. क्लोन के एक नंबर दोनों Amp (जो pCP20 का एक मार्कर है) और कान के लिए संवेदनशीलता के लिए जांच की गई, और कई क्लोन दोनों को संवेदनशील प्राप्त किया गया । इन क्लोन कॉलोनी पीसीआर द्वारा सत्यापित कर रहे थे तम कोडिंग अनुक्रम पार्श्व का उपयोग कर और पाया कि तम जीन सफलतापूर्वक हटा दिया गया था (चित्रा 4) ।

ताा उत्पत्ति में तम की भूमिका:

तम को कुछ शास्त्रीय ट्रांसपोर्टरों के16 और व्युत्क्रम ट्रांसपोर्टर intimin15की उत्पत्ति में शामिल किया गया है दिखाया गया है । ताळा की उत्पत्ति के लिए महत्वपूर्ण है या नहीं, BL21ΔABCF Δतम plasmids एन्कोडिंग दो परीक्षण प्रोटीन, Yersinia adhesin बेकार और ई. कोलाई ़-बाध्यकारी प्रोटीन EibD के साथ बदल गया था कि क्या परीक्षण करने के लिए । इन प्रोटीन ई. कोलाई में अच्छी तरह से व्यक्त करने के लिए जाना जाता है और पहले अध्ययन23,28में ताा उत्पत्ति के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है ।

प्रोटीन उत्पादन उत्प्रेरण के बाद, अभिव्यक्ति संस्कृतियों के बाहरी झिल्ली भागों अलग और एसडीएस द्वारा विश्लेषण-पृष्ठ थे । नमूनों में प्रोटीन के trimerization का प्रदर्शन नहीं उबला हुआ था । १०० केडीए के ऊपर आकार पर चलने वाले ट्रिमर्स, जबकि मोनोमर में ४५ केडीए (बेकार) और ५१ केडीए (EibD) के आकारों की उम्मीद है. BL21ΔABCF और BL21ΔABCF Δतममें अभिव्यक्ति के स्तर के बीच कोई बड़ा अंतर नहीं देखा गया, यद्यपि बेकार को Δतम तनाव (चित्रा 5 ए) में कुछ निचले स्तर पर उत्पादित होने लगता है । हालांकि, इसके विपरीत EibD के लिए मामला प्रतीत होता है ।

की जांच करने के लिए कि क्या तम की कमी सही तह या प्रोटीन के परिवहन को प्रभावित हो सकता है, उनके लाइगैंडों को बांध करने की क्षमता का परीक्षण किया गया । बेकार के लिए, यह एक कोलेजन दूर पश्चिमी दाग (चित्रा 5B) द्वारा पूरा किया गया । बेकार, दोनों उपभेदों में, एक समान स्तर पर कोलेजन बाध्य, प्रदर्शन है कि प्रोटीन सही ढंग से जोड़कर और कार्यात्मक है । इसी प्रकार, दो उपभेदों में EibD की आईजीजी-बाध्यकारी गतिविधियों को अभिव्यक्ति स्तर (चित्रा 4c) से संबंधित है । इन परिणामों से यह प्रदर्शित होता है कि तम का विलोपन ताा उत्पत्ति पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ता, इन दो माडलों के लिए कम से ताळा नहीं ।

Figure 1
चित्रा 1: उत्पादत्मक एंटीबायोटिक कैसेट के साथ दस्तक बहिष्कार की पीढ़ी । जीन दस्तक के उत्पादन के लिए बहिष्कार, ब्याज की एक जीन (इस उदाहरण में जीन बी) एक कान प्रतिरोध FRT साइटों द्वारा पार्श्व कैसेट की जगह है । FRT-कान कैसेट, बारी में, लघु (~ ५० बीपी) के ऊपर और जीन बी के नीचे क्षेत्रों के लिए अनुक्रम मुताबिक़ के हिस्सों के बाजू है जीन बी के कोडिंग अनुक्रम λ लाल पुनर्संयोजन द्वारा FRT-कान कैसेट के लिए विमर्श किया है । एक बार यह पूरा हो गया है, कान कैसेट ही FLP recombinase, जो एक साइट FRT साइटों के बीच विशिष्ट पुनर्संयोजन मध्यस्थता करेंगे शुरू करने से हटाया जा सकता है । यह बी लोकस में एक ंयूनतम (~ १०० बीपी) निशान अनुक्रम जा रहा है, कान कैसेट एक्साइज । पूरी जानकारी के लिए देखें बाबा एट अल. 7. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: P1 transduction द्वारा जीन विलोपन । दाता तनाव (बेज रंग) एक कान कैसेट है कि (नीले) गुणसूत्र पर ब्याज की जीन (पीला) बदल दिया जाता है । दाता P1 भोजी से संक्रमित है । फेज दाता तनाव में पलता है, बड़ी संख्या में जिन्न का उत्पादन । सबसे जंगली प्रकार (लाल जीनोम) हैं, लेकिन एक अंश transducing phages है कि दाता तनाव गुणसूत्र के बजाय फेज डीएनए (नीले जीनोम) के एक हिस्से को शामिल किया है । इनमें से एक अनुपात कान कैसेट (पीला जीनोम) शामिल होंगे । अंततः, संक्रमित होस्ट कक्ष lyses और phages को माध्यम में रिलीज़ करता है । ये एक lysate तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है । transduction प्रयोग में, प्राप्तकर्ता तनाव (हल्का नीला) दाता तनाव से तैयार lysate से संक्रमित है । मामलों के एक अल्पसंख्यक में, प्राप्तकर्ता एक transducing फेज कान कैसेट ले जाने से संक्रमित है (यहां दिखाया गया है) । यदि कान कैसेट से सटे क्षेत्रों मुताबिक़ पुनर्संयोजन से गुजरना, कान कैसेट प्राप्तकर्ता गुणसूत्र में शामिल अंतर्जात एलील की जगह है, कान में जिसके परिणामस्वरूप प्रतिरोधी क्लोनों के लिए चुना जा सकता है । FLP recombinase के एक इलाज प्लाज्मिड उत्पाद पर इसके अलावा कान कैसेट, केवल एक छोटे निशान अनुक्रम छोड़ने (पीले रंग में यहां दिखाया गया है), जो कान के लिए क्लोन-संवेदनशील phenotype वापस आ जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक P1 संक्रमण के बाद प्लेटों के उदाहरण । (क) यह पैनल व्यक्तिगत सजीले टुकड़े के साथ एक थाली से पता चलता है । (ख) यह पैनल एक अर्द्ध-धाराप्रवाह प्लेट दिखाता है । (ग) यह पैनल एक से अधिक संक्रमित प्लेट दिखाता है, जहां लगभग सभी बैक्टीरिया फेज द्वारा लीजड ड किए गए हैं । कुछ प्रतिरोधी कालोनियों शीर्ष आगर परत से बाहर हो गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: तम कोडिंग अनुक्रम का विलोपन । तम:: कण विलोपन एलील में शुरू किया गया था तनाव BL21ΔABCF P1 transduction द्वारा । कान कैसेट, एक निशान अनुक्रम (~ १०० बीपी) के उत्पाद के बाद सब है कि तम लोकस में रहता है । यह पीसीआर द्वारा सत्यापित किया गया था, विलोपन साइट पार्श्व का उपयोग कर । BL21ΔABCF और इसके जनक तनाव, BL21 (DE3) में, पीसीआर एक उत्पाद तम कोडन अनुक्रम की लंबाई देता है (अपेक्षित आकार १.७ kilobase जोड़े) है । BL21ΔABCF में, जहां कान कैसेट है, उत्पाद की उंमीद निशान अनुक्रम (१४५ बीपी) से मेल खाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक तम विलोपन तनाव के द्वारा ताळा की अभिव्यक्ति । (क) यह पैनल ताळा (बेकार या EibD) और वेक्टर कण्ट्रोल (pIBA2 और pET22) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं से तैयार बाहरी झिल्ली के एसडीएस-पृष्ठ को दिखाता है. उपभेदों BL21ΔABCF और उसके व्युत्पंन तनाव कमी तम (ΔtamA) हैं । (ख) इस पैनल बेकार नमूनों की एक कोलेजन दूर पश्चिमी दाग से पता चलता है । बेकार नमूने और पैनल एक से pIBA2 नियंत्रण एक PVDF झिल्ली को हस्तांतरित और कोलेजन प्रकार मैं के साथ मशीन थे । वे तो एक विरोधी कोलेजन एंटीबॉडी के साथ जांच की और ECL द्वारा पता लगाया गया । (ग) यह पैनल EibD नमूनों के लिए एक एंटीबॉडी बाध्यकारी परख दिखाता है । EibD नमूनों और पैनल ए से pET22 नियंत्रण एक PVDF झिल्ली को हस्तांतरित किया गया और एक एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन और फिर ECL द्वारा पता लगाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिकर्मक 1x मिक्स 7x मिश्रण
पीसीआर ग्रेड पानी 17 µ l ११९ µ l
10 x पोलीमरेज़ बफ़र 2 µ l 14 µ l
10 मिमी deoxyribonucleotide मिश्रण ०.४ µ l २.८ µ l
१०० µ एम फॉरवर्ड प्राइमर ०.२ µ l १.४ µ l
१०० µ मीटर रिवर्स प्राइमर ०.२ µ l १.४ µ l
Taq डीएनए पोलीमरेज़ ०.२ µ l १.४ µ l
कुल 20 µ l १४० µ l

तालिका 1: कॉलोनी पीसीआर मास्टर मिक्स । मिश्रण की राशि की जांच की जाने वाली कालोनियों की संख्या पर निर्भर करता है । इसके अलावा, एक नियंत्रण प्रतिक्रिया (मूल प्राप्तकर्ता तनाव) तैयार करते हैं । उदाहरण के लिए, यदि स्क्रीनिंग पांच क्लोन, छह प्रतिक्रियाओं की जरूरत है, नियंत्रण भी शामिल है । यह सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त प्रतिक्रिया तैयार करने लायक है सभी नमूनों के लिए पर्याप्त पीसीआर मिश्रण है (दोहराया pipetting छोटे pipetting त्रुटियों को परिवर्धित). इस उदाहरण में, एक 7x मिश्रण (5 कालोनियों, 1 नियंत्रण, और 1 अतिरिक्त प्रतिक्रिया) तैयार करें ।

चरण तापमान समय नोट्स
1. ९४ ° c 3 min
2. ९४ ° c 30 एस
3. ५० ° c 30 एस
4. ७० ° c 2 min 1 min/kb प्रवर्धित, राउंड अप करने के लिए
२ २४ बार चरण पर लौटें
5. ७० ° c 5 min
6. 12 डिग्री सेल्सियस सदा के लिए अंतिम होल्ड

2 टेबल: कॉलोनी पीसीआर कार्यक्रम ।

अनुपूरक फाइल 1: कॉलोनी ग्रिड का एक उदाहरण । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

P1 transduction ई. कोलाईमें जीन विलोपन पैदा करने के लिए एक तेज, मजबूत, और विश्वसनीय तरीका है । यह यहां transducing द्वारा एक कईयो दाता तनाव से एक BL21-व्युत्पंन प्राप्तकर्ता को एक तम विलोपन उत्परिवर्ती प्रदर्शन किया है । transduction प्रक्रिया में प्रमुख चरणों transducing lysate, transduction ही, कान प्रतिरोध कैसेट के उत्पाद का उत्पादन कर रहे हैं, और पीसीआर द्वारा नॉक आउट के सत्यापन के लिए । कुल में, इस प्रक्रिया को लगभग 1 सप्ताह लेता है और कोई आणविक जीवविज्ञान तरीकों की आवश्यकता है, सत्यापन के लिए अंतिम पीसीआर से अलग किया जाएगा । इस प्रकार, P1 transduction λ लाल पुनर्संयोजन के साथ दक प्रयास और समय में प्रतिस्पर्धा और पारंपरिक मार्कर एक्सचेंज mutagenesis की तुलना में बहुत तेजी से कर सकते हैं ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल बहुत मजबूत है और कई चरणों के संशोधनों के लिए अनुमति देता है । वहां रहे हैं, तथापि, कुछ महत्वपूर्ण मापदंडों । P1 संक्रमण के लिए, यह मध्यम करने के लिए कैल्शियम आयनों जोड़ने के लिए आवश्यक है । कैल्शियम बैक्टीरिया को फेज के सोखना के लिए आवश्यक है, और मध्यम करने के लिए पर्याप्त कैल्शियम जोड़ने के लिए विफलता काफी संक्रमण की क्षमता को कम करेगा । BL21ΔABCF के रूप में कुछ जीवाणु उपभेदों CaCl की उपस्थिति में कुल करने के लिए करते हैं221. ऐसे मामलों में, CaCl2के बिना बैक्टीरिया उगाया जा सकता है, जो संक्रमण से पहले ही निलंबन में जोड़ा जा सकता है । हालांकि, अधिक परंपरागत उपभेदों के लिए, 10 मिमी CaCl2 शुरुआत से विकास के माध्यम में शामिल किया जा सकता है ।

इसके विपरीत transduction के बाद यम से नि: शुल्क कैल्शियम निकालना जरूरी है । साइट्रेट कैल्शियम आयनों की एक chelator है, और क्योंकि इन P1 के सोखना के लिए कोशिकाओं की मेजबानी के लिए आवश्यक हैं, मध्यम से मुक्त कैल्शियम को हटाने के आगे संक्रमण रोकता है । यदि कैल्शियम हटा नहीं है, phages संस्कृति भर में आगे कोशिकाओं को संक्रमित होगा, सबसे अच्छा transduction की दक्षता को कम करने और सबसे खराब lysing पूरी संस्कृति, transductants सहित ।

एक और महत्वपूर्ण कदम संवर्धन बैक्टीरिया प्लाज्मिड pCP20 ले जा रहा है । pCP20 ३७ डिग्री सेल्सियस या उच्चतर के तापमान पर नकल नहीं करता है कि एक सशर्त नकल प्लाज्मिड है; इस प्रकार, कोशिकाओं में प्लाज्मिड स्थापित करने के लिए, इस प्लाज्मिड के साथ मशीन 30 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए (या कम), pCP20 की प्रतिकृति के लिए एक तापमान स्वतंत्र. इलाज pCP20 के लिए, एक उच्च तापमान (४३ ° c) का उपयोग किया जाता है । कुछ उपभेदों इस तापमान पर अच्छी तरह से विकसित नहीं है; इस तरह के मामलों में, ३७ ° c पर्याप्त होना चाहिए, हालांकि प्लाज्मिड इलाज इस तापमान पर कुछ हद तक कम कुशल हो जाएगा ।

जब बैक्टीरिया एंटीबायोटिक संवेदनशीलता के लिए परीक्षण करने के लिए चढ़ाना, प्लेट लकीर का क्रम महत्वपूर्ण है । प्रोटोकॉल क्लोन के लिए कॉल एंटीबायोटिक युक्त प्लेटों पर पहले लकीर और अंत में गैर चयनात्मक माध्यम पर हो सकता है । इस तरह, जांचकर्ता सुनिश्चित किया जा सकता है कि चयनात्मक मीडिया पर वृद्धि की कोई कमी एंटीबायोटिक संवेदनशीलता की वजह से होगा और बजाय प्लेटों पर हस्तांतरित सामग्री की एक संभावित कमी करने के लिए । प्रोटोकॉल के बाद, पौंड + कान प्लेट पर कोई वृद्धि कान प्रतिरोध कैसेट के उत्पाद को सत्यापित करता है; पौंड + Amp प्लेट पर कोई वृद्धि पुनर्संयोजन प्लाज्मिड pCP20 के नुकसान की पुष्टि; पौंड प्लेट पर बढ़ते उपभेदों (जो चयन प्लेटों पर एक ही लकीरिंग प्रयोग में वृद्धि नहीं हुई) सकारात्मक recombinants शामिल होंगे ।

अंय कदम के अधिकांश काफी छूट के लिए अनुमति देते हैं । प्रस्तुत के रूप में प्रोटोकॉल में, BL21ΔABCF 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति है, के रूप में यह तनाव ३७ डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से विकसित नहीं करता है । हालांकि, विकास दोष के बिना ई. कोलाई उपभेदों ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति हो सकता है (सिवाय जब pCP20 के साथ बदल) ।

संक्रमण के लिए इस्तेमाल बैक्टीरिया की संख्या कुछ हद तक अलग किया जा सकता है । आयुध डिपो६०० और एक व्यवहार्य गिनती के बीच मोटे तौर पर ०.१ और १.०, जहां पूर्व लगभग 108 cfu/एमएल और बाद ~ 109 cfu/एमएल के लिए संगत के एक आयुध डिपो६०० मूल्य के बीच रैखिक है । हालांकि, इस संबंध में प्रश्न में तनाव के आधार पर कुछ हद तक भिंन हो सकते हैं, विकास के माध्यम, और अंय कारकों । यह सिफारिश की है कि६०० आयुध डिपो और व्यवहार्य गणना के बीच संबंध विशेष रूप से MOI मूल्यों की गणना के लिए प्रत्येक प्रयोगशाला और तनाव, के लिए स्थापित किया जाना चाहिए । संक्रमण प्रयोगों में इस्तेमाल बैक्टीरिया की संख्या विशेष रूप से महत्वपूर्ण नहीं है, और 109 cfu/एमएल जल्दी स्थिर चरण है, जो कोशिका घनत्व और संस्कृति में व्यवहार्य कोशिकाओं के अनुपात के बीच एक उचित समझौता है का प्रतिनिधित्व करता है । यदि व्यवहार्य बैक्टीरिया की एक कम संख्या transduction के लिए उपयोग किया जाता है, phages की संख्या बस तदनुसार समायोजित करने की जरूरत है । MOI स्वयं भी कुछ हद तक वैविध्यपूर्ण हो सकता है. प्रोटोकॉल ०.५ के एक MOI मूल्य के लिए कॉल, हालांकि ०.१ और ०.५ के बीच कुछ भी एक अच्छी दक्षता में परिणाम चाहिए । ०.५ के एक MOI में, बैक्टीरिया के लिए phages का अनुपात 1:2 (यानी, बैक्टीरिया की संख्या की तुलना में phages की आधी संख्या) है । प्रोटोकॉल में उदाहरण में, संस्कृति के आयुध डिपो६०० १.० है, और संस्कृति के 1 मिलीलीटर transduction के लिए प्रयोग किया जाता है; इस प्रकार, आवश्यक phages की संख्या 5 x 108है । ०.५ का एक MOI मूल्य संक्रमण के एक उच्च स्तर देता है, लेकिन बैक्टीरिया है कि दोगुना संक्रमित हैं, जो जंगली प्रकार (संक्रामक) phages दूर transducing phages संख्या के रूप में transduction की क्षमता को कम करेगा की संख्या को कम करता है । एक transducing फेज और एक संक्रामक फेज के साथ एक डबल संक्रमण कोशिका lysis के लिए नेतृत्व, इस प्रकार बचे के पूल से इस transductant को नष्ट करेगा । इसलिए, ०.५ की एक MOI से अधिक नहीं होना चाहिए ।

प्रोटोकॉल भी कुछ शॉर्टकट के लिए अनुमति देता है । बजाय प्लेटों से lysates तैयारी, कुछ लेखक तरल माध्यम29में फेज lysates की तैयारी की वकालत । यह एक रात के रूप में समय की मशीन की जरूरत नहीं है कदम बचा सकता है । इसी तरह, titrating फेज lysate आवश्यक नहीं हो सकता है । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, MOI बहुत महत्वपूर्ण नहीं है, और उचित दक्षता बस एक मानक lysate के लिए 10 pfu /एमएल के एक titer संभालने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।

तकनीक की सुगमता के बावजूद, P1 transduction सार्वभौमिक रूप से लागू नहीं है, और कई शर्तों के लिए यह उपयोगी होने के लिए पूरा किया जाना चाहिए । सबसे पहले, एक चयन नॉक आउट एलील के साथ एक दाता तनाव उपलब्ध होना चाहिए । यह आमतौर पर एक हटाने जहां एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट ब्याज की जीन बदल दिया है का उपयोग करके पूरा किया है । कईयो संग्रह इस संबंध में विशेष रूप से उपयोगी है, के रूप में यह एंटीबायोटिक कैसेट की एक तैयार करने के लिए उपयोग पुस्तकालय प्रदान करता है आधारित जीन दस्तक-लगभग सभी गैर-आवश्यक जीन ई. कोलाई K12 में कवर बहिष्कार । यह संग्रह बाहर दस्तक सबसे ई. कोलाई उपभेदों (यानी, ई. कोलाई कोर जीनोम के घटक) में पाया संरक्षित जीन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है । कम आम जीन के लिए, ऐसे रोगजनक ई. कोलाई उपभेदों या दुर्लभ चयापचय मार्ग जीन के डाह कारकों के रूप में, उत्परिवर्तन डी नोवोबनाए जाने की आवश्यकता हो सकती है । ऐसे मामलों में, P1 transduction अच्छी तरह से पसंद की विधि नहीं हो सकता है । आवश्यक जीन के अलावा, जीन है कि p1 संक्रमण के लिए आवश्यक है, जैसे गलू, उत्परिवर्तनों जो की सीसा p130प्रतिरोध करने के लिए, p1 transduction द्वारा एक विलोपन के लिए गरीब लक्ष्य हैं । एक और ध्यान दें जब कईयो संग्रह का उपयोग कर, विशेष रूप से, यह है कि कुछ उपभेदों लक्षित जीन है, जहां केवल एक ही कॉपी कान प्रतिरोध कैसेट8द्वारा बाधित किया गया था की एक दोहराव ले । ऐसे मामलों में, ब्याज का जीन आवश्यक हो सकता है; जांचकर्ताओं के लिए इस तरह के जीन8के लिए अद्यतन एनोटेशन की जांच की सिफारिश कर रहे हैं । हालांकि, इन संयमी दिया, P1 transduction प्रयोगशाला ई. कोलाई उपभेदों में सबसे जीन के विलोपन की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, BW25113 और BL21 (DE3) के बीच मतभेद छोटे होते है और केवल एक मुट्ठी भर प्रोटीन-कोडिंग जीन31को प्रभावित करते हैं ।

दूसरे, यह है कि प्राप्तकर्ता तनाव transduction काम करने के लिए एक मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए सक्षम होना चाहिए जोर देना महत्वपूर्ण है । एक recombinase RecA कमी तनाव, इसलिए कर सकते हैं, इस विधि द्वारा संशोधित नहीं किया जा सकता है । इस तरह के DH5α, HB101, TOP10, और एक्स्ट्रा लार्ज-1 नीले रंग के रूप में सभी मानक क्लोनिंग उपभेदों, शामिल नहीं है । RecA 8 बीपी के रूप में कम के रूप में समान हिस्सों के बीच पुनर्संयोजनों मध्यस्थता कर सकते हैं; हालांकि, उच्च समानता का एक लंबा क्षेत्र recombination की संभावना काफी३२,३३वृद्धि होगी । विशेष रूप से नैदानिक ई. कोलाई उपभेदों के साथ एक और समस्या है, कि लंबे हे-प्रतिजन जंजीरों मुखौटा कर सकते हैं के लिए रिसेप्टर P1 है, जो lipopolysaccharide३४के कोर oligosaccharide में निहित है । प्राप्तकर्ता तनाव के लिए इन आवश्यकताओं के अलावा, P1 transduction के लिए इस्तेमाल किया तनाव एक वीर उत्परिवर्ती होना चाहिए; यह उत्परिवर्तन एक पूर्ण lytic संक्रमण३५के लिए आवश्यक है ।

P1 transduction का एक तीसरा चेतावनी है कि जीन बाहर खटखटाया जाना चाहिए दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों के बीच पार्श्व क्षेत्रों में उच्च समानता के साथ एक क्षेत्र में रहते हैं । अगर वहां उपभेदों के बीच synteny की कमी है, लक्ष्य जीन कान कैसेट के साथ कोडन अनुक्रम के प्रतिस्थापन अच्छी तरह से असफल हो सकता है, पार्श्व क्षेत्रों की सामग्री में अंतर के कारण । इसलिए, P1 पर शुरू-मध्यस्थता जीन विलोपन से पहले, जांचकर्ताओं दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों के अनुक्रम की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि पार्श्व अनुक्रम मुताबिक़ कर रहे है चाहिए । बेशक, यह केवल अगर उपभेदों अनुक्रम किया गया है संभव है । एक अज्ञात अनुक्रम के साथ उपभेदों के मामले में, P1 transduction या तो विफल हो सकता है या अंय समस्याओं के कारण, इस तरह के पार्श्व क्षेत्रों में एक जीन रूपांतरण के रूप में । P1 डीएनए के लगभग ९० kilobase जोड़े transduce कर सकते हैं; यदि लक्ष्य जीन के आसपास के क्षेत्रों में जीन सामग्री में अंतर है (जैसे, छोटे विलोपन या सम्मिलन), यह संभावना है कि ये दाता अनुक्रम में वापस आ जाएगा । यह प्राप्तकर्ता दबाव के phenotype पर अनपेक्षित परिणाम हो सकता है । इसलिए, जहां संभव हो, दाता के अनुक्रम और ब्याज की जीन के आसपास प्राप्तकर्ता हमेशा P1 transduction से पहले की तुलना में होना चाहिए ।

अंत में, P1 transduction एक विशिष्ट जीन दस्तक स्थानांतरित करने का एक तेजी से रास्ता है, उपभेदों के एक नंबर के लिए बाहर एक बार प्रारंभिक दस्तक उत्परिवर्तन उत्पंन किया गया है । हालांकि तकनीक अपनी सीमाओं, आसानी और उसके कार्यांवयन की गति यह जीन विलोपन के अंय तरीकों के लिए एक आकर्षक विकल्प बना है । P1 केवल ई. कोलाई, जो आम तौर पर इस प्रजाति के लिए इसके उपयोग को प्रतिबंधित करता है संक्रमित करता है । हालांकि, P1 के कुछ वेरिएंट विकसित किया गया है कि एक व्यापक मेजबान रेंज है और परिवार Enterobacteriaceaeके भीतर अंय प्रजातियों को संक्रमित कर सकते हैं, और यहां तक कि कुछ अंय γ-proteobacterial प्रजातियों, हालांकि कम क्षमता३६पर, ३७. यहां तक कि Myxococcus xanthus, एक δ-proteobacterium को ई. कोलाई से क्लोन डीएनए का transduction३८बताया गया है. भविष्य के प्रयोगों में, इन वेरिएंट वीरसिंह उत्परिवर्तन के साथ एंटीबायोटिक कैसेट में इस्तेमाल प्राप्तकर्ता उपभेदों की सीमा को व्यापक करने के लिए संवर्धित किया जा सकता है-जनरल transduction द्वारा जीन विलोपन आधारित है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कईयो संग्रह उपभेदों राष्ट्रीय संसाधन परियोजना (काटकर चिकना करना, जापान): ई. कोलाईसे प्राप्त किया गया । हम अपने सतत समर्थन के लिए कटार लिंक (विज्ञान विभाग, ओस्लो विश्वविद्यालय) धंयवाद । यह काम नॉर्वे के युवा शोधकर्ता अनुदान २४९७९३ के अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया (जैक सी लियो को) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGG
ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATT
CTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22

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References

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  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
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जेनेटिक्स अंक १३९ एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट विलोपन mutagenesis FLP recombinase P1 transduction translocation और विधानसभा मॉड्यूल trimeric ट्रांसपोर्टर adhesin
उत्पादत्मक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट्स के साथ P1 Transduction द्वारा <em>ई कोलाई</em> में जीन विलोपन का उत्पादन
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Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J.… More

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).

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