Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Производство гена удалений в Escherichia coli , P1 трансдукция с подакцизных антибиотикорезистентности кассеты

doi: 10.3791/58267 Published: September 1, 2018

Summary

Здесь мы представляем собой протокол для использования уже существующих антибиотикам сопротивление кассета удаления конструкции как основу для принятия удаления мутантов в других штаммов E. coli . Такие перегласовки удаления могут быть мобилизованы и вставлен в соответствующий Локус штамм получателей с помощью P1 бактериофага трансдукции.

Abstract

Первый подход для изучения функции неизвестных генов бактерий является создание плей офф этого гена. Здесь мы описываем надежный и быстрый протокол для передачи мутации гена удаления из одного штамма кишечной палочки в другой с помощью обобщенного трансдукции бактериофага P1. Этот метод требует, чтобы мутация выбора (например, на основе гена сбоев с помощью антибиотиков кассеты вставок). Таких антибиотиков кассеты могут быть мобилизованы из штамма доноров и введена в получателей штамм интерес к быстро и легко создавать ген мутанта удаления. Антибиотик кассеты могут быть разработаны включить Флиппазы признание сайты, которые позволяют иссечение кассеты по участкам рекомбиназа производить чистую нокаут с только ~ 100-base пара длинный шрам последовательности генома. Мы продемонстрировать протокола путем стучать вне Джин Тама , кодирования фактор Ассамблеи, занимающихся биогенеза autotransporter и проверить эффект от этого плей офф на биогенеза и функции двух адгезины trimeric autotransporter. Хотя гена удаления трансдукции P1 имеет свои ограничения, легкость и скорость ее реализации сделать его привлекательной альтернативой для других методов удаления ген.

Introduction

Первый общий подход для изучения функции гена — для выполнения нокаут-мутагенеза и наблюдать результате фенотип. Это также называется обратной генетики. Бактерия E. coli была рабочая лошадка молекулярной биологии за последние 70 лет или так, благодаря простоте его культивирования и его ответственностью генетические манипуляции1. Несколько методов были разработаны производить Джин удалений в E. coli, включая маркер обмен мутагенеза2,3 и, совсем недавно, recombineering, используя λ красный или Rac ET систем4,5 , 6.

В широко используется система кодирования последовательностей отдельных генов заменяются антибиотикорезистентности кассету, которая позже может быть подакцизным хромосома5,7. Кодирования последовательности заменяются, например кассета сопротивления канамицин (Кан), который окружен Флиппазы (FLP) признание целевой (ФРТ) сайты с обеих сторон. FRT сайты признаны рекомбиназа ФЛП, которая опосредует участкам рекомбинация между сайтами ФРТ, ведущих к удаления кассеты Кан. Таким образом может быть достигнуто полное удаление данного гена кодирующая последовательность, оставив только минимальный шрам последовательность приблизительно 100 пар оснований (ВР) (рис. 1).

Чуть более десяти лет назад так называемый Keio коллекция была разработана. Это бактериальный Библиотека, на базе стандартного лаборатории штамм E. coli K12, где почти все несущественные гены индивидуально были удалены λ красный рекомбинации7,8. Клоны в этой коллекции имеют один кодирующая последовательность, заменены подакцизных кассеты сопротивления Кан. Коллекции Keio оказалась полезным инструментом для многих приложений9. Одним из таких приложений является производство удаления мутантов в других штаммов E. coli . Кан кассету с клон данного исключения могут быть мобилизованы путем обычно преобразователя бактериофагов, таких как P110,11,12,,1314. Фаговые складе, подготовленных от такого напряжения может затем использоваться для заразить получателя штамм E. coli интерес, где с частотой низкий, но надежный Кан кассеты содержащих региона могут быть включены в геноме получателя, гомологичная рекомбинация (Рисунок 2). Transductants могут быть выбраны для роста на Кан содержащих носителе. После этого если удаление антибиотикорезистентности кассеты, ФЛП рекомбиназа могут поставляться штамм transductant в транс. После отверждения ФЛП содержащих плазмида, который носит маркер сопротивления ампициллин (Amp), Кан и Amp чувствительных клоны проверяются для, и правильный иссечение одичал тип кодирования последовательности и кассеты с Кан проверяются колонии PCR.

Здесь представлен подробный протокол, описывающих каждый из этапов в производстве нокаут-штамм E. coli , основанный на изложенной выше стратегии. В качестве примера показано удаление Джин Тама . Тама кодирует белок β-баррель внешней мембраны, который является частью транспорта и сборки модуля (TAM), который участвует в биогенеза некоторых белков autotransporter и пили15,16,17. Этот штамм нокаут-затем был использован для изучения эффекта удаления Тама биогенеза два trimeric autotransporter адгезинов (ТААС), Yersinia адгезина яда и иммуноглобулина E. coli (Ig)-привязка ТАА EibD 18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. штаммы и плазмиды

  1. Штаммы бактерий
    1. Используйте E. coli штаммов BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20и21BL21ΔABCF. Посмотреть Таблицу материалы для получения дополнительной информации.
  2. Бактериофаги
    1. Использование фага P1Вир для общего трансдукции. Хранить Фаговые как жидкий запас с нескольких капель хлороформа (см. шаг 2.2). Для получения дополнительной информации см. Таблицу материалов.
  3. Плазмиды
    1. Используйте следующие плазмид в настоящем протоколе: pCP2022, pIBA2-YadA23и24pEibD10. Как управления плазмид используйте pASK-IBA2 и pET22b (см. Таблицу материалы).
  4. Условия роста
    1. Распространение бактерий в lysogeny бульон (LB) средний25 с энергичной встряхивания (180 – 200 об/мин) при 37 ° C или 30 ° C в случае BL21ΔABCF и штаммов, содержащие pCP20.
    2. Выполните плазмида отверждения на 43 ° C.
    3. Для средне-твердых дополнение LB с 1% агар (w/v).
    4. Для топ агар дополнение LB с 0,7% агар и 10 мм CaCl2 и автоклав среды. Используйте средство SOC для восстановления после электропорации26.
    5. Используйте следующие концентрации антибиотиков: 100 мкг/мл для Amp и 25 мкг/мл для Kan.

2. Подготовка Фаговые Lysate

  1. Инфекция штамма доноров
    1. Расти штамм доноров JW4197 в 5 мл среды LB, дополнены с 10 мм CaCl2 и, при необходимости, с Кан (25 мкг/мл) для оптической плотности на 600 Нм (600OD) ~ 1.0. Измерьте значение600 ОД, с помощью спектрофотометра.
    2. Сделать серию разрежения имеющегося Фаговые P1 в среде LB: Рекомендуемые разведений между 10-3 до 10-7.
    3. Микс 200 мкл бактериальных подвеска и 100 мкл данного Фаговые разрежения в 15 мл пластиковых пробирок или эквивалент. Подготовьте столько трубы как Фаговые разведениях. Инкубируйте трубы для 20 минут при 37 ° C без встряхивания.
    4. Добавить ~ 3 мл расплавленного Топ агар (~ 50 ° C) с 10 мм CaCl2 к трубкам, перемешать содержимое путем vortexing трубы вскоре и залить смеси на подогретую фунтов пластин сделать даже слои.
    5. Инкубировать пластины на ночь при 37 ° C.
  2. Лизатных подготовка
    1. Следующий день выберите тарелку с полу вырожденная роста Фаговые бляшки. На полу вырожденная тарелку, ясно примерно половину площади поверхности пластины (рис. 3).
    2. Скрип Топ агар слой от пластины, с помощью цикла прививок или аналогичный инструмент и место Топ агар в пластиковых пробирок. Добавить 1-2 мл фунтов и капля хлороформе и вихревой трубки энергично для ~ 1 мин добавить хлороформ в зонта.
    3. Центрифуга трубки для 15 мин 4000 x g или быстрее в гранулах в агар и бактериальной клетки.
    4. Переместите супернатант свежие microcentrifuge трубки, избегая над любой мусор из гранул. Добавьте 2 капли хлороформе и хранить lysate 4 – 10 ° c. Добавление хлороформ в зонта. Не заморозить Фаговые lysate, поскольку это приведет к значительному сокращению числа инфекционных частиц.
  3. Определение lysate титр
    1. Растут BW25113 в LB, дополненные 10 мм CaCl2 при 37 ° C до культуры достигает ОД600 ~ 1.0.
    2. Подготовьте ряд разбавление Фаговые lysate в фунтов (например, 10-6– 10-9).
      Примечание: Будьте осторожны накапайте образца от верхней части lysate во избежание передачи хлороформ в разведениях.
    3. Микс 200 мкл бактериальных подвеска и 100 мкл данного Фаговые разрежения в 15 мл пластиковых пробирок или эквивалент. Подготовьте столько трубы как Фаговые разведениях. Инкубируйте трубы для 20 минут при 37 ° C без встряхивания.
    4. Добавить ~ 3 мл расплавленного Топ агар (~ 50 ° C) с 10 мм CaCl2 к трубкам, перемешать содержимое путем vortexing трубы вскоре и вылить смесь на подогретую LB пластины, чтобы сделать даже слои.
    5. Инкубировать пластины на ночь при 37 ° C.
    6. На следующий день подсчитать количество бляшек (ясно регионов в бактериальных мат) для каждой пластины и рассчитать титр lysate с использованием следующей формулы:
      Equation 1
      Пример: На плитах с разведениях 10-7, 10-8и 10-9, есть 231, 27 и 2 таблички, соответственно. 100 мкл каждого разведения был использован для инфекции, и поскольку титр выражается как бляшкообразующих единицах (ОРП) / мл, коэффициент покрытия составляет 10. Эти числа вводятся в формулу:
      Equation 2
      Таким образом титр составляет приблизительно 2 x 1010 инфекционных Фаговые частицы/мл.

3. P1 трансдукция

  1. Подготовка получателей клетки
    1. Расти получателей штамм BL21ΔABCF в дополнение к оптической плотности в 600 фунтов Нм (600OD) ~ 1.0. Используйте спектрофотометр для измерения значение600 ОД.
    2. Рассчитайте объем Фаговые lysate необходимо достичь разносторонность инфекции (МВД) значение 0.5. Чтобы вычислить МВД, оцените количество бактерий, основанный на од600 культуры. Предположим, что значение600 ОД 1.0 соответствует9 ~ 10 кое/мл. Расчет необходимого объема на основе известных титр lysate.
      Пример (основанный на титр, рассчитанные в примере после шага 2.3.6):
      Equation 3
    3. Добавить2 CaCl получателя штамм культуры до 10 мм и перемешать. Возьмите 1 мл культуры для трансдукции.
  2. Выполнение трансдукция
    1. Добавьте соответствующий объем Фаговые lysate 1 мл получателей культуры (включая CaCl2 10 мм), рассчитанные на шаге 3.1.2 и осторожно перемешать.
      Примечание: Будьте внимательны Пипетка образец из верхней части lysate чтобы избежать переноса хлороформ в смеси.
    2. Статически Инкубируйте смесь для 20 минут при 37 ° C.
    3. Остановите инфекцию, добавив цитрат натрия, рН 5,5, до 100 мм.
    4. Центрифуга бактерий (5000 x g на 2 мин) и удалить супернатант затем Ресуспензируйте их в 1 мл свежего LB дополнена натрия цитрат 100 мм, pH 5.5.
    5. Мыть дважды больше как шаг 3.2.4 для обеспечения удаления бесплатно бактериофаги и кальция клетки.
    6. Ресуспензируйте бактерий в 1 мл свежего LB дополнена натрия цитрат 100 мм, pH 5.5. Инкубируйте бактерий на 30 ° C в течение 1 ч при встряхивании (> 100 об/мин).
    7. Собирать бактерии центрифугированием (5000 x g на 2 мин) и Ресуспензируйте их в ~ 100 мкл фунтов с натрия цитрат 100 мм, pH 5.5.
    8. Распространение бактерий на плите LB дополнена Кан на 25 мкг/мл и 10 мм цитрат натрия, рН 5,5 и расти бактерий при 30 ° C до колонии появляются (~ 24 h).
  3. Выбор transductants
    1. После колонии выросли на пластину отбора, restreak их на LB + Кан для одного колоний и растут при температуре 30 ° C до одной колонии появляются.

4. Вырезание Кан кассеты

  1. Преобразование с рекомбинацией плазмиды
    1. Сделайте electrocompetent штамм Кан устойчивостью BL21ΔABCF.
      1. Расти штамм от одной колонии в свежих фунтов (5 мл), дополнены Кан (25 мкг/мл) при 30 ° C до тех пор, пока ОД600 ~0.5 – 0,7.
      2. С этого момента выполняют следующие шаги при температуре 4 ° C или на льду. Центрифуга для бактерий (5000 x g 10 мин) и удалить супернатант.
      3. Помыть лепешка ячейки с ледяной дистиллированной водой дважды, повторив предыдущий шаг центрифугирования и, наконец, Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл ледяной 10% глицерина.
    2. Охладиться 1 мм электропорации кюветы на льду.
    3. Добавить 1 pg плазмидной ДНК (pCP20) в суспензии клеток, осторожно перемешать подвеска и передать его охлаждением электропорации кювет.
    4. Установите electroporator 1,8 кв и electroporate клетки.
    5. Спасти трансформированных клеток, добавив 1 мл среды SOC и выращивать их в течение 1 ч при температуре 30 ° C.
    6. Тарелка µL 100 клеток на LB + Amp плиты и расти клеток при 30 ° C на ночь.
  2. Индукция рекомбинации
    1. Выбрать один колоний от LB + Amp пластины и прививать свежие LB, минуя все антибиотики.
    2. Растут на ночь, чтобы побудить выражение ФЛП рекомбиназа клетки на не разрешительной температуры (43 ° C).
  3. Выбор рекомбинантов
    1. Сделать серийных разведений и пластины 50 мкл 105-106 разрежения на неселективной пластины и вырастить его на ночь на 30 ° C.

5. Проверка удаления гена

  1. Проверка потери плазмиды и успешных рекомбинации
    1. Полоска одной колонии от плиты, подготовленную на этапе 4.3.1 на LB + Кан, LB + Amp и ФУНТ пластин без антибиотиков, в этом порядке. Для оказания помощи в полос, используйте сетку колонии (см. дополнительный файл 1). Растут плиты при 30 ° C до колонии появляются (~ 24 h).
    2. Выберите 10 – 20 клоны, которые выросли на неселективной пластины, но не растут на выборочной СМИ для дальнейшей проверки.
  2. Дополнительная проверка колонии PCR
    1. Выполните колонии PCR с праймерами, окаймляющие Тама кодирования последовательности (см. Таблицу материалы).
    2. Подготовка мастер смесь ПЦР. Количество смеси необходимо зависит количество колоний для проверки (см. пример в таблице 1). Смешать реактивы на льду, добавить полимеразы последнего.
    3. Тщательно перемешать смесь ПЦР мастер, а затем отказаться от 20 мкл в пробирки ПЦР полосы. Выберите небольшое количество каждой колонии, чтобы проверяться с помощью стерильной пипеткой кончика и добавить его в трубку. Не забудьте включить исходный штамм получателей для сравнения. При необходимости также включают штамм доноров.
    4. Запуск реакции PCR (см. таблицу 2 для программы, используемой).
    5. Подготовка геля агарозы 1%.
      1. Для 50 мл геля измерения 0,5 г агарозы и добавьте 50 мл буфер TAE (40 мм трис, уксусная кислота 20 мм и 1 мм ЭДТА, рН 8,0). Нагрейте смесь в микроволновой печи до тех пор, пока все агарозы распущен.
      2. После того, как распалась агарозы, прохладном решение примерно 50 ° C, а затем добавьте 5 мкл ДНК, окрашивание красителя. Раствор тщательно перемешать и залить его в каппу в камере литья. Вставьте одну или несколько строк хорошо Комбс так, что есть достаточно скважин для всех образцов, а также размер молекулярных маркеров. Разрешить гель для 30 мин.
    6. После завершения выполнения ПЦР мкл 4 6 x ДНК загрузки краситель для каждого образца. Место в зале электрофореза геля и добавьте буфер TAE до лунки покрыты.
    7. Применяют 10 – 15 мкл из каждой реакции PCR в колодец в геле. Также 5 мкл молекулярного размера маркера. Затем запустите гель для 30 мин на 75 V.
    8. После завершения запуска изображение гель с помощью томографа голубой свет.

6. другие методы

  1. Выражение протеина
    Примечание: Выражение тест белков (болтовня и EibD) были подробно описаны в других местах2423,. Это краткий обзор основных шагов.
    1. Преобразование BL21ΔABCF ΔТама with необходимые плазмид (pIBA2-YadA и pEibD10 и соответствующего управления плазмид) и выберите для трансформантов на LB + Amp.
    2. Для выражения протеина, прививать 100 мл с 1 мл раствора на ночь культуры бактерий, преобразованные LB средний + Amp и расти на 30 ° C до этапа середине журнала, в котором время, стимулировать производство белка с либо anhydrotetracycline (на 100 нг/мл) или Изопропиловый thiogalactoside (на 0,5 мм).
    3. После того, как 2 h индукции на 30 ° C, измерения мутности культур и собирать количество ячеек, соответствующих 50 мл на од600 = 1.0 центрифугированием культур для 15 мин на 4000 x g. Помыть лепешка 1 x 10 мм HEPES, рН 7,4, а затем либо храните его при 20 ° C или процесса он также как и шаг 6.2.
  2. Экстракция внешней мембраны
    Примечание: Наружной мембраны добыча осуществляется как описано в деталях Лео et al. 27. ниже кратко излагаются основные шаги.
    1. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл 10 мм HEPES, рН 7,4, дополнены MgCl 10 мм2 и НКД2, лизоцим (0,1 мг/мл) и щепотку DNase I.
    2. Лизируйте клетки (например, с помощью било шарик).
    3. Центрифуга клетки вскоре (2 мин на 15600 x g) чтобы удалить ячейки мусор и переместить супернатант свежие трубки.
    4. Центрифуга клетки для 30 мин на 16000 x g, после чего, Ресуспензируйте гранулы в 400 мкл 1% N-лауроил sarcosine в 10 мм HEPES, рН 7,4.
    5. Клетки с агитации за 30 мин при комнатной температуре, после чего инкубировать, центрифуга их на 30 минут, как указано выше.
    6. Вымойте полупрозрачных гранул 1 x с 200 мкл 10 мм HEPES, рН 7,4, а затем Ресуспензируйте в 30 мкл 10 мм HEPES и добавить 10 мкл 4 x буфер образца SDS-PAGE.
  3. Деятельность анализов
    Примечание: Выполните SDS-PAGE и деятельность анализов для яда и EibD как описано28. Ниже кратко излагаются основные шаги.
  4. SDS-PAGE
    1. Тепло образцов на 50 ° C за 5 мин до их загрузки на геле полиакриламида, чтобы избежать денатурации белков.
    2. После разделения в SDS-PAGE передать белки винилидена фторид (PVDF) мембраны.
    3. После передачи блокировать мембраны с 2% сухого обезжиренного молока порошок в PBS.
  5. YadA коллаген далеко Западная помарка
    1. После блокирования, добавить говядину коллаген типа, которую я разведен в блокирующем буфере до концентрации 10 мкг/мл и Проинкубируйте мембрану за 1 час.
    2. Промойте мембрану 2 x с PBS + 0,05% Tween20 (PBS-T).
    3. Добавьте основное антитело (моноклонального анти коллаген COL-1) мембраны, разбавленным стоматологов в блокирующем буфере.
    4. После инкубации мембран для 1 h, мыть 2 x, как указано в шаге 6.3.2.2, а затем добавить вторичные антитела [Коза анти мыши IgG хрен пероксидазы (ПХ) конъюгата], разбавленным мэм в блокирующем буфере.
    5. Проинкубируйте мембрану за 1 ч, затем промыть 2 x с PBS-T. Добавьте расширение Хемилюминесцентный субстрат мембрана в соответствии с инструкциями производителя и обнаружить группы с помощью CCD камеры.
  6. EibD-IgG пробирного привязки
    1. После блокирования, добавьте вторичное антитело (коза анти кролик ПХ), разбавленный стоматологов в блокирующем буфере.
    2. Проинкубируйте мембрану за 1 ч, затем промыть 2 x с PBS. Хемилюминесцентный обнаружения как указано в шаге 6.3.2.5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Поколение Тама нокаут-о BL21ΔABCF:

Стратегия, изложенная выше ранее использовался для создания производных штамм BL21(DE3), Стандартный лабораторный штамм, используемых для производства белка, который оптимизирован для производства белка наружной мембраны и называется BL21ΔABCF21. Этот штамм не хватает четырех генов, кодирующих обильные внешний мембранных белков и, следовательно, способен производить более участием выраженной наружной мембранных белков чем одичал тип деформации. Чтобы проверить ли там участвует в биогенеза TAA, Джин Тама был удален в этом фоне.

P1 lysate был подготовлен Keio коллекции штамм JW4179, где Джин Тама (ранее называемые yftM) кодирования последовательность заменяется Кан сопротивления кассету. Затем трансдукция эксперимента была выполнена с BL21ΔABCF как получателя деформации. Были получены несколько Кан устойчивостью колонии, после чего два были выбраны для иссечения Кан кассеты. Плазмида pCP20, кодирование рекомбиназа ФЛП, была введена в эти клоны и, впоследствии, вылечить растет на 43 ° C в отсутствие антибиотиком выбора. Количество клонов были экранированы для чувствительность усилителя (который является маркером pCP20) и Кан, и были получены несколько клонов, чувствительных к обоим. Эти клоны были проверены колонии PCR используя праймеры фланговые Тама кодирования последовательности и обнаружил, что Джин Тама успешно удален (рис. 4).

Тама роль в TAA биогенеза:

Было показано, что Тама участвовать в биогенеза некоторых классических autotransporters16 и обратные autotransporter intimin15. Чтобы проверить ли Тама имеет важное значение для биогенеза ТААС, BL21ΔABCF ΔТама была преобразована с плазмид, кодирование двух испытаний белков, Yersinia принимает YadA и E. coli Ig связывающий белок EibD. Эти белки известны выразить в E. coli и были использованы в качестве модели для TAA биогенеза в более ранних исследований23,28.

После вызывая производства белка, внешней мембраны дроби выражение культур были изолированы и проанализированы SDS-PAGE. Образцы не были вареные продемонстрировать trimerization белков. Тримеры запустить размеров выше 100 кДа, мономеры ожидать размеров 45 кДа (яда) и 51 кДа (EibD), в то время как. Были замечены не значительные различия между уровнями выражение в BL21ΔABCF и BL21ΔABCF ΔТама, хотя YadA, как представляется, быть произведены на несколько более низких уровнях в ΔТама штамм (Рисунок 5A). Однако напротив, как представляется, в случае EibD.

Для изучения ли отсутствие Тама может повлиять на правильный складные или транспортных белков, их способности связать к лигандам был испытан. Для YadA это было достигнуто путем коллаген далеко Западная помарка (Рисунок 5B). YadA, в обоих штаммов, неизбежно коллагена на том же уровне, продемонстрировав, что белок правильно сложить и функциональной. Аналогичным образом IgG привязки деятельность EibD в двух штаммов коррелирует с выражение уровня (рис. 4 c). Эти результаты показывают, что удаление Тама не имеют значительное влияние на TAA биогенеза, по крайней мере не для этих двух моделей ТААС.

Figure 1
Рисунок 1: поколение стук аутов с подакцизных антибиотик кассет. Для производства гена стук аутов, ген интереса (ген B в этом примере) заменяется на кассету сопротивления Кан, обрамленная FRT мест. Кассета FRT-Кан, в свою очередь, в окружении короткий (~ 50 bp) тянется последовательности гомологичных в верхнем и нижнем течении регионы гена б. Кодирующая последовательность гена B обменивается на кассету FRT-Кан, λ красный рекомбинации. После того, как это достигается, кассета Кан, сама могут быть удалены путем введения рекомбиназа ФЛП, который будет посредничать участкам рекомбинация между сайтами ФРТ. Это акцизы Кан кассеты, оставляя минимальный (~ 100 bp) шрам последовательности в локусе B. Для подробной информации см. Баба и др. 7. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Джин удаления P1 трансдукции. Донора штамм (бежевый) осуществляет Кан кассету, которая заменила гена интереса (желтый) на хромосоме (синий). Донор заражен бактериофага P1. Фаговые умножает усталость доноров, производить большое количество потомков. Большинство из них одичал тип (красный генома), но часть преобразователя бактериофаги, которые включили часть доноров штамм хромосомы, вместо того, чтобы Фаговые ДНК (синий геном). Часть из них будет содержать Кан кассеты (желтый геном). В конце концов зараженные клетки лизирует и выпускает бактериофагов в среду. Они используются для подготовки lysate. В эксперименте трансдукции получателей штамм (светло-голубой) заражен lysate готовится из штамма доноров. В меньшинстве случаев получатель заражена преобразования фага, перевозящих Кан кассеты (показано ниже). Если районы, примыкающие к кассете Кан проходят гомологичная рекомбинация, Кан кассеты включен в получателей хромосомы, заменив эндогенного аллель, что приводит к Кан стойкие клоны, которые могут быть выбраны для. Добавление рекомбиназа ФЛП на излечимых плазмида акцизов Кан кассеты, оставляя только короткий шрам последовательности (здесь показан желтым), который восстанавливает клон Кан чувствительных фенотип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: примеры пластин после инфекции P1. (A) Эта группа показывает пластины с отдельными бляшек. (B) Эта группа показывает полу вырожденная пластины. (C) Эта группа показывает чрезмерно зараженных плиты, где почти все бактерии были лизированы, фаг. Некоторые стойкие колонии выросли из агар верхнего слоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Удаление Тама кодирования последовательности. Удаления аллеля tamA::kan было введено в штамм BL21ΔABCF P1 трансдукции. После иссечения Кан кассеты, последовательность шрам (~ 100 bp) это все, что остается в локусе Тама . Это была подтверждена ПЦР, используя праймеры, окаймляющие удаления сайта. В BL21ΔABCF и его родительский сорт, BL21(DE3), ПЦР дает продукт длина Тама кодирования последовательности (ожидаемый размер составляет 1,7 kilobase пар). В BL21ΔABCF, где был вырезан Кан кассеты, продукт соответствует ожидаемой шрам последовательности (145 bp). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Выражение ТААС путем удаления штамм Тама . (A) Эта панель показывает SDS-PAGE наружной мембраны, приготовленный из клетки, выражая ТААС (болтовня или EibD) и Векторный контроль (pIBA2 и pET22). Штаммы являются BL21ΔABCF и его производные штамм не хватает тама (ΔtamA). (B) Эта группа показывает пятно крайний западный коллаген YadA образцов. YadA образцы и pIBA2 элементы от группы A были переданы PVDF мембрану и инкубировали с коллаген типа I. Они были затем исследовали с антитела анти коллагена и обнаружен ECL. (C) Эта группа показывает assay привязки антитела для EibD образцов. Образцы EibD и pET22 элементы управления из панели A были переданы PVDF мембрану и инкубировали с ПХ конъюгированных вторичные антитела и затем обнаружен ECL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Реагент 1 x микс 7 x-микс
ПЦР класс воды 17 МКЛ 119 МКЛ
10 x буфер полимеразы 2 МКЛ 14 МКЛ
10 мм deoxyribonucleotide микс 0.4 МКЛ 2.8 МКЛ
Грунтовка вперед 100 мкм 0.2 МКЛ 1.4 МКЛ
Обратный грунт 100 мкм 0.2 МКЛ 1.4 МКЛ
Полимераза дна Taq 0.2 МКЛ 1.4 МКЛ
Итого 20 МКЛ 140 МКЛ

Таблица 1: колонии PCR Мастер микс. Количество смеси зависит количество колоний проверяться. Кроме того Подготовьте управления реакции (исходный штамм получателя). Например если скрининг пять клоны, шесть реакции необходимы, включая элемент управления. Это стоит подготовка дополнительных реакции, чтобы убедиться, что есть достаточно смеси ПЦР для всех образцов (повторные закупорить усиливает небольшие погрешности дозирования). В этом примере готовят смесь 7 x (5 колоний, 1 управления и 1 дополнительной реакции).

Шаг Температура Время Примечания
1. 94 ° C 3 мин
2. 94 ° C 30 s
3. 50 ° C 30 s
4. 70 ° C 2 мин 1 мин/kb быть усилена, круглый вверх
Вернуться к шагу 2 24 раз
5. 70 ° C 5 мин
6. 12 ° C Навсегда окончательное удержание

Таблица 2: Колонии PCR программы.

Дополнительный файл 1: пример колонии сетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Трансдукция P1 является быстрый, надежный и надежный метод для генерации гена удалений в E. coli. Здесь это подтверждается преобразователя Тама удаления мутант из штамма доноров Keio BL21-производные получателю. Основные этапы в процессе трансдукции являются производство преобразователя lysate, трансдукция сам, иссечение Кан сопротивления кассету и проверка нокаут-методом ПЦР. В целом этот процесс занимает примерно одну неделю и требует не методы молекулярной биологии использоваться, за исключением окончательного ПЦР для проверки. Таким образом P1 трансдукции могут соревноваться в затраченные усилия и время с λ красный рекомбинации и гораздо быстрее, чем традиционные маркер обмен мутагенеза.

Представленные протокол является очень надежной и позволяет для изменения многих из шагов. Есть, однако, несколько критических параметров. Для P1 инфекции необходимо добавить ионов кальция в среду. Кальций необходим для адсорбции Фаговые на бактерии, и неспособность добавить достаточно кальция средний значительно снизит эффективность инфекции. Некоторые бактериальных штаммов, такие, как BL21ΔABCF, как правило, чтобы совокупные присутствии CaCl221. В таких случаях бактерии могут быть выращены без CaCl2, которые могут быть добавлены к приостановлению незадолго до инфекции. Однако для более обычных штаммов, 10 мм CaCl2 могут быть включены в среднего роста с самого начала.

И наоборот важно удалить свободного кальция из среды после трансдукции. Цитрат хелатором ионов кальция, и потому, что они необходимы для адсорбции P1 для клеток хозяина, удаление свободного кальция из среды далее предотвращает инфекции. Если кальций не удаляется, бактериофаги будет далее заразить клетки во всей культуре, в лучшем случае снижения эффективности трансдукции и в худшем случае лизировать всей культуры, в том числе transductants.

Другим важным шагом культивирование бактерий, перевозящих плазмида pCP20. pCP20 является условно репликации плазмид, который не реплицируется при температуре 37 ° C или выше; Таким образом, создать плазмиды в клетках, инкубаций с этой плазмида должно быть выполненной при 30 ° C (или ниже), температура, разрешительной для репликации pCP20. Для лечения pCP20, используется высокая температура (43 ° C). Некоторые штаммы не растут хорошо при этой температуре; в таких случаях 37 ° C должно быть достаточно, хотя плазмиды отверждения будет несколько менее эффективным при этой температуре.

При обшивки бактерий для проверки антибиотика чувствительности, важен порядок пластины мелирование. Протокол призывает клонов будет сначала прожилками на антибиотик содержащих пластины и наконец на неселективной носителе. Таким образом, следователь может быть уверен, что любое отсутствие роста на выборочной СМИ будет из-за антибиотиков чувствительность и вместо того, чтобы к потенциальной нехватки материалов переведены на тарелках. После протокол, без рост на LB + Кан пластины проверяет иссечение Кан сопротивления кассеты; рост не на LB + Amp пластины проверяет потери рекомбинации плазмида pCP20; штаммы, растущих на пластину фунтов (который не расти в том же штриховая эксперимент на выбор пластины) будет содержать положительное рекомбинантов.

Большинство других шагов позволяют значительную свободу действий. В протоколе как они представлены, BL21ΔABCF культивированный на 30 ° C, как этот штамм не растут хорошо при 37 ° C. Однако штаммов E. coli без дефектов роста может быть культивировали при 37 ° C (за исключением тех случаев, когда превращается с pCP20).

Количество бактерий, используется для лечения инфекций может изменяться до некоторой степени. Отношения между ОД600 и жизнеспособной счетчик примерно линейного между значением600 ОД 0.1 и 1.0, где бывший соответствует приблизительно 108 кое/мл и последних9 ~ 10 кое/мл. Однако эта связь может варьироваться в некоторой степени в зависимости от штамма в вопросе, среднего роста и других факторов. Рекомендуется, что отношения между ОД600 и жизнеспособные граф должны создаваться для каждой лаборатории и деформации, особенно для расчета значений MOI. Количество бактерий, используемая в экспериментах по инфекции не имеет особо важное значение, и 10 кое/мл9 представляет раннего неподвижной фазой, которая представляет собой разумный компромисс между плотность клеток и доля жизнеспособных клеток в культуре. Если меньшее количество жизнеспособных бактерий используются для трансдукции, количество бактериофаги просто необходимо соответствующим образом скорректировать. МВД, сама также может быть изменено в некоторой степени. Протокол призывает MOI значение 0,5, хотя ничего между 0,1 и 0,5 должно привести к хорошей эффективности. В MOI 0.5 отношение бактериофаги бактерий составляет 1:2 (т.е., половина количество бактериофаги, по сравнению с количество бактерий). В этом примере в протоколе, ОД600 культуры является 1.0, и 1 мл культуры используется для трансдукции; Таким образом количество бактериофаги требует является 5 x 10-8. MOI значение 0,5 дает высокий уровень инфекции, но уменьшает количество бактерий, которые заражены вдвойне, уменьшающих эффективность трансдукции как одичал тип (инфекционных) бактериофаги далеко превосходят преобразования бактериофаги. Двойная инфекция с производимве ФАГ и инфекционных ФАГ приведет к ячейке лизиса, таким образом устраняя этот transductant из числа выживших. Таким образом MOI 0.5 не должен быть превышен.

Протокол также позволяет для некоторых клавиш. Вместо того, чтобы подготовка лизатов из плит, некоторые авторы выступают за подготовке Фаговые лизатов в жидкость средних29. Это может сэкономить время, как ночь инкубации шаг не требуется. Аналогично титрования lysate фага не может быть необходимым. Как отмечалось выше, МВД не является очень критической, и разумной эффективности может быть достигнуто, просто предполагая титр 1010 ОРП/мл для стандартного lysate.

Несмотря на простоту технику P1 трансдукции не является универсально применимым, и несколько условий должны быть выполнены для того, чтобы быть полезным. Во-первых штамм доноров с выбора нокаут-аллеля должны быть доступны. Обычно это достигается с помощью удаления где кассета антибиотикорезистентности заменил гена интереса. Коллекции Keio особенно полезны в этой связи, как это предлагает библиотеку готовых к использованию антибиотиков на основе кассеты гена стук-аутов, охватывающих почти все несущественные генов в E. coli K12. Эта коллекция является особенно полезной для выбивания сохранены генов в большинство штаммов E. coli (то есть, составляющие ядро генома E. coli ). Для менее общих генов, таких как факторы вирулентности патогенных кишечной палочки штаммов или редкие метаболический путь генов, мутации может потребоваться создать de novo. В таких случаях трансдукции P1 также не может быть методом выбора. В дополнение к важно генов гены, которые требуются для P1 инфекции, такие как Галу, мутации которого ведут к P1 сопротивления30, бедных объекты для удаления P1 трансдукции. Еще одно замечание при использовании коллекции Кэйо, в частности, является несколько штаммы нести дублирование целевого гена, где только одна копия была нарушена Кан сопротивления кассеты8. В таких случаях гена интереса может быть необходимым; следователи, рекомендуется проверить обновленные аннотации для таких генов8. Однако учитывая эти ограничения, P1 трансдукции позволяет исключить большинство генов штаммов E. coli лаборатории. Например различия между BW25113 и BL21(DE3) являются небольшими и затрагивают лишь небольшое количество белка кодирование генов31.

Во-вторых важно подчеркнуть, что штамм получателей должны быть способны гомологичная рекомбинация для трансдукции работать. Штамм не хватает рекомбиназа RecA может, таким образом, не изменять этим методом. Это исключает все стандартные клонирования штаммов, например DH5α, HB101, TOP10 и синий XL-1. RecA может посредничать рекомбинации между идентичными тянется как короче 8 ВР; Однако, больше региона высоких сходство значительно возрастет вероятность рекомбинации32,33. Еще одна проблема, особенно с клинической E. coli штаммов, является, что долго O-антиген цепи могут маскировать рецептора для P1, которая находится в основной олигосахарида липополисахарида34. Помимо этих требований для получателя штамма штамм P1, используемых для трансдукции должно быть Вир мутант; Эта мутация не требуется для полного литические инфекции35.

Третий предостережение от P1 трансдукции является, что ген быть выбит должны находиться в регионе с высокой подобия в фланкируя регионах между донорами и получателями помощи штаммов. Если есть нехватка synteny штаммов, замена целевого гена кодирования последовательности с кассетой Кан также может не, из-за различий в содержании фланкируя регионов. Таким образом перед началом удаления P1-опосредованной гена, следователи должны проверить последовательности штаммов доноров и получателей, чтобы убедиться, что Фланкируя последовательности гомологичных. Конечно это возможно только если виртуализация штаммы. В случае штаммы с неизвестным последовательности P1 трансдукции может либо неудачей или вызвать другие проблемы, такие как преобразование гена в фланкируя регионах. P1 можно передают примерно 90 kilobase пар ДНК; Если существуют различия в содержании гена в регионах вокруг целевого гена (например, малых удаления или вставки), вполне вероятно, что они вернутся к последовательности доноров. Это могло бы иметь непреднамеренные последствия на фенотип штамма получателя. Поэтому где это возможно, последовательности доноров и получателей вокруг гена интереса следует всегда сравнить до P1 трансдукции.

В заключение P1 трансдукции это быстрый способ передачи определенного гена нокаут-количество штаммов после первоначального нокаут-мутация была сформирована. Хотя этот метод имеет свои ограничения, легкость и скорость ее осуществления сделать его привлекательной альтернативой для других методов удаления ген. P1 только заражает E. coli, который обычно ограничивает его использование этого вида. Однако, некоторые варианты P1 были разработаны которые имеют более широкий диапазон хост и могут заразить других видов семейства Enterobacteriaceaeи даже некоторые другие виды γ-proteobacterial, хотя и на снижение эффективности36, 37. даже трансдукции клонированной ДНК от кишечной палочки Myxococcus Ксанф, δ-proteobacterium, был сообщили38. В будущих экспериментах эти варианты могут быть дополнены Вир мутации расширить круг получателей штаммов, используемых в антибиотикотерапии на основе кассеты гена удаления общего трансдукции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Кэйо коллекции штаммов были получены от национального проекта Биоресурс (Ниг, Япония): E. coli. Мы благодарим Дирк Линке (Департамент Biosciences, Университет Осло) за его неизменную поддержку. Эта работа финансировалась исследовательским советом Норвегии молодой исследователь Грант 249793 (Jack C. Leo).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGG
ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATT
CTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171, (9), 4617-4622 (1989).
  3. Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179, (20), 6228-6237 (1997).
  4. Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
  5. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (12), 6640-6645 (2000).
  6. Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26, (5), 325-331 (2001).
  7. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  8. Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
  9. Baba, T., Huan, H. -C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, Clifton, NJ. 183-194 (2008).
  10. Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191, (17), 5549-5552 (2009).
  11. Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9, (4), 379-386 (2007).
  12. Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76, (5), 1035-1042 (2007).
  13. Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199, (16), (2017).
  14. Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14, (6), 237-246 (2008).
  15. Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8, (6), 1690-1705 (2016).
  16. Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, (5), 506-510 (2012).
  17. Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1, (7), 16064 (2016).
  18. Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46, (8-9), 1860-1866 (2009).
  19. Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305, (2), 252-258 (2015).
  20. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189, (1), 113-130 (1986).
  21. Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
  22. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, (1), 9-14 (1995).
  23. Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189, (24), 9011-9019 (2007).
  24. Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19, (7), London, UK. 1021-1030 (1993).
  25. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62, (3), 293-300 (1951).
  26. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, (4), 557-580 (1983).
  27. Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. Clifton, NJ. 157-167 (2015).
  28. Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194, (4), 827-838 (2012).
  29. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., et al. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F. M., et al. Chapter 1, Unit 1.17 (2007).
  30. Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38, (1), 189-191 (1969).
  31. Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394, (4), 644-652 (2009).
  32. Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291, (22), 11572-11580 (2016).
  33. Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, (14), 4768-4772 (1985).
  34. Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75, (4), 1661-1666 (2006).
  35. Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14, (1), 85-109 (1965).
  36. Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38, (4), 754-757 (1979).
  37. Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118, (3), 810-814 (1974).
  38. O'Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155, (1), 317-329 (1983).
Производство гена удалений в <em>Escherichia coli</em> , P1 трансдукция с подакцизных антибиотикорезистентности кассеты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).More

Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter