Summary
Aquí presentamos un protocolo para el uso de preexistentes antibiótico resistencia-cassette borrado construcciones como base para la fabricación de mutantes de deleción en otras cepas de e. coli . Tales mutaciones de la canceladura pueden ser movilizados e inserta en el correspondiente locus de una cepa receptora mediante transducción de bacteriófago P1.
Abstract
Una primera aproximación al estudio de la función de un gen desconocido en bacterias es crear un knock-out de este gen. Aquí, describimos un protocolo robusto y rápido para la transferencia de mutaciones de la canceladura de genes de una cepa de Escherichia coli a otra mediante la transducción generalizada con el bacteriófago P1. Este método requiere que la mutación sea seleccionable (p. ej., basado en interrupciones del gen mediante inserciones de cassette antibiótico). Tales cintas antibióticas pueden movilizar de una cepa donante e introducen en una cepa receptora de interés rápidamente y generan fácilmente un mutante de canceladura del gene. El cassette de antibiótico puede diseñarse incluir flippase sitios de reconocimiento que permiten la supresión de la cinta por un recombinase específico para producir un knock-out limpiado con sólo una secuencia de ~ 100-base-par-larga cicatriz en el genoma. Demostrar el Protocolo por la anulación del factor conjunto implicado en la biogénesis autotransporter la codificación del gene de tamA y probar el efecto de esta eliminatoria en la biogénesis y la función de dos autotransporter trímero adhesinas. Aunque la canceladura del gene por transducción P1 tiene sus limitaciones, la facilidad y rapidez de su aplicación hacen una alternativa atractiva a otros métodos de canceladura del gene.
Introduction
Una primera aproximación común para estudiar la función de un gen es realizar mutagénesis de knock-out y observar el fenotipo resultante. Esto también se llama genética reversa. La bacteria e. coli ha sido el caballo de batalla de la biología molecular durante los últimos años 70 o así, debido a la facilidad de su cultivo y su receptividad a la manipulación genética1. Varios métodos han sido desarrollados para producir deleciones del gen en e. coli, incluyendo marcador cambio mutagénesis2,3 y, más recientemente, recombineering usando la λ rojo o ET Rac sistemas4,5 , 6.
En un sistema ampliamente utilizado, secuencias de codificación de genes individuales se sustituyen por una cinta de resistencia a los antibióticos que más adelante puede ser suprimida del cromosoma5,7. Las secuencias de codificación son sustituidas, por ejemplo por una cinta de resistencia kanamicina (Kan), que es flanqueada por los sitios de destino (FRT) flippase (FLP) reconocimiento a ambos lados. Los sitios FRT son reconocidos por el recombinase FLP, que media específica recombinación entre los sitios FRT conduce a la supresión de la cassette de Kan. De esta manera, se logra un borrado completo de la secuencia de codificación de un gen determinado, dejando sólo una secuencia mínima cicatriz de aproximadamente 100 pares de bases (PB) (figura 1).
A poco más de una década atrás, se desarrolló la llamada colección de Keio. Se trata de una biblioteca bacteriana basada en un estándar de laboratorio cepa K12 de e. coli , donde casi todos los genes no esenciales fueron borrados individualmente por λ recombinación rojo7,8. Los clones dentro de cada colección tienen una secuencia de codificación substituida con una cinta de resistencia los Kan. La colección de Keio ha demostrado para ser una herramienta útil para muchas aplicaciones9. Un tal uso es la producción de mutantes de deleción en otras cepas de e. coli . El cassette de Kan de un clon de eliminación dada puede ser movilizado por transducción generalmente de bacteriófagos, como P110,11,12,13,14. Un stock de fagos preparado a partir de tal tensión puede utilizarse para infectar a un recipiente e. coli cepa de interés, donde en una frecuencia baja pero confiable el Kan región que contiene el cassette puede ser incorporado en el genoma receptor por recombinación homóloga (Figura 2). Transductants pueden ser seleccionados para el crecimiento en el medio que contiene Kan. Después de esto, si se desea el retiro de la cinta de resistencia a los antibióticos, el recombinase FLP se puede suministrar a la cepa transductant en trans. Después de curar el plásmido que contiene el FLP, que lleva un marcador de resistencia a ampicilina (Amp), clones de Kan y sensible a Amp son evaluados para, y la supresión correcta de la secuencia de codificación de tipo salvaje y el cassette de Kan son verificados por PCR de Colonia.
Aquí, se presenta un protocolo detallado, describiendo cada uno de los pasos en la producción de un knock-out cepa de e. coli , basado en la estrategia que se ha señalado anteriormente. Por ejemplo, se demostró una canceladura del gene del tamA . tamA codifica una proteína de β-barril de membrana externa que es una parte del transporte y montaje módulo (TAM), que participa en la biogénesis de ciertas proteínas autotransporter y pili15,16,17. Esta cepa knock-out entonces fue utilizada para examinar el efecto de la supresión de tamA en la biogénesis de dos autotransporter trímero adhesinas (TAAs), la adhesina de Yersinia YadA y la inmunoglobulina (Ig) de la e. coli -vinculante EibD TAA 18,19.
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Protocol
1. las cepas y plásmidos
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Cepas bacterianas
- Uso de la e. coli cepas BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20y BL21ΔABCF21. Para más información ver la Tabla de materiales .
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Bacteriófagos
- Utilice el fago P1vir para la transducción general. Almacenar el phage como un líquido con unas gotas de cloroformo (ver paso 2.2). Para obtener más información, vea Tabla de materiales.
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Plásmidos
- Utilice el siguiente plásmidos en este protocolo: pCP2022, pIBA2-YadA23y pEibD1024. Plásmidos de control, utilizar IBA2 pASK y pET22b (véase Tabla de materiales).
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Condiciones de crecimiento
- Propagar las bacterias en un medio25 de lisogenia caldo (LB) con vigoroso (180 – 200 rpm) a 37 ° C o 30 ° C en el caso de las cepas que contienen pCP20 y BL21ΔABCF.
- Realizar plásmido curado a 43 ° C.
- De un medio sólido, suplemento LB con agar al 1% (p/v).
- Para top agar, suplemento LB con 0,7% de agar y 10 mM de CaCl2 y autoclave el medio. Medio SOC de uso para la recuperación después de la electroporación26.
- Utilizar las siguientes concentraciones de antibióticos: 100 μg/mL de Amp y 25 μg/mL para el Kan.
2. preparación de un lisado de fagos
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Infección de la cepa donante
- Crecer la cepa donante JW4197 en 5 mL de medio LB suplementada con 10 mM de CaCl2 y opcionalmente con Kan (25 μg/mL) a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Mide el valor de OD600 usando un espectrofotómetro.
- Hacer una serie de diluciones de un stock de fagos P1 existente en el medio LB: recomienda diluciones son entre 10-3 a 10-7.
- Mezcla 200 μL de la suspensión bacteriana y 100 μL de una dilución de phage dado en un tubo de centrífuga de 15 mL o equivalente. Preparar tantos tubos como diluciones de fago. Incubar los tubos durante 20 min a 37 ° C sin agitación.
- Añadir 3 mL de agar superior fundida (~ 50 ° C) suplementado con 10 mM de CaCl2 en los tubos, homogeneizar el contenido con un vórtex los tubos poco y vierta la mezcla en placas LB precalentadas para hacer capas incluso.
- Incubar las placas durante la noche a 37 ° C.
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Preparación de lisado
- Al día siguiente elegir un plato con un semi-confluente crecimiento de placas de fagos. En un plato semi confluente, aproximadamente la mitad la superficie de la placa es evidente (figura 3).
- Raspar la capa de agar superior de dicha placa con un asa de inoculación o una herramienta similar y colocar el agar superior en un tubo de centrífuga. Añadir 1-2 mL de LB y una gota de cloroformo y agitar el tubo vigorosamente durante ~ 1 min agregar el cloroformo en una campana de humos.
- Centrifugar el tubo durante 15 min a 4.000 x g o más rápido para que sedimenten las células bacterianas y agar.
- Pasar el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco, evitando transportar cualquier residuo de la pastilla. Añadir 2 gotas de cloroformo y almacenar el lisado a 4 – 10 ° C. Añadir cloroformo en una campana de humos. No congele el phage lisado, esto resultará en una reducción significativa del número de partículas infecciosas.
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Determinar el título del lisado
- Crecer BW25113 en LB suplementado con 10 mM de CaCl2 a 37 ° C hasta que el cultivo alcanza un OD600 de ~ 1.0.
- Preparar una serie de diluciones de los fagos lisado en LB (p. ej., 10-6-10-9).
Nota: Tenga cuidado al pipetear la muestra desde la parte superior del lisado para evitar transferencia de cloroformo a las diluciones. - Mezcla 200 μL de la suspensión bacteriana y 100 μL de una dilución de phage dado en un tubo de centrífuga de 15 mL o equivalente. Preparar tantos tubos como diluciones de fago. Incubar los tubos durante 20 min a 37 ° C sin agitación.
- Añadir 3 mL de agar superior fundida (~ 50 ° C) suplementado con 10 mM de CaCl2 en los tubos, homogeneizar el contenido con un vórtex los tubos poco y vierta la mezcla en placas LB precalentadas para hacer capas incluso.
- Incubar las placas durante la noche a 37 ° C.
- Al día siguiente cuenta el número de placas (regiones claras en la placa bacteriana) para cada placa y calcular el título del lisado mediante la fórmula siguiente:
Ejemplo: En las placas de las diluciones 10-710-8y 10-9, hay 231, 27 y 2 placas, respectivamente. 100 μL de cada dilución se utilizó para la infección, y porque el título se expresa como placa formando unidades (pfu) / mL, el factor de la galjanoplastia es 10. Estos números se introducen en la fórmula:
Así, el título es aproximadamente 2 x 1010 infecciosas fagos partículas/mL.
3. P1 transducción
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Preparación de las células del receptoras
- Crecer la cepa receptora BL21ΔABCF en LB complementado a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Use un espectrofotómetro para medir el valor de OD600 .
- Calcular el volumen del lisado de fagos para alcanzar una multiplicidad de valor de infección (MOI) de 0,5. Para calcular el MOI, estimar el número de bacterias basado en OD600 de la cultura. Asume que un valor de600 OD de 1.0 corresponde a ~ 109 UFC/mL. Calcular el volumen requerido basado en el conocido título del lisado.
Ejemplo (basado en la concentración calculada en el ejemplo después paso 2.3.6):
- Añadir CaCl2 a la cultura receptora cepa a 10 mM y mezclar. Tomar 1 mL del cultivo para la transducción.
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Realizar la transducción de señales
- Añadir el volumen adecuado de lisado de fagos a 1 mL de la cultura receptora (incluyendo CaCl2 a 10 mM) calculado en el paso 3.1.2 y mezclar suavemente.
Nota: Tenga cuidado al pipetear la muestra desde la parte superior del lisado para evitar transferencia de cloroformo a la mezcla. - Estáticamente, incubar la mezcla por 20 min a 37 ° C.
- Detener la infección mediante la adición de citrato de sodio, pH 5.5, a 100 mM.
- Centrifugue las bacterias (5.000 x g durante 2 min) Quite el sobrenadante y resuspender en 1 mL de LB fresco suplementado con citrato de sodio 100 mM, pH 5,5.
- Lavan las células dos veces más que en el paso 3.2.4 para la eliminación de calcio y phages gratis.
- Resuspender las bacterias en 1 mL de LB fresco suplementado con citrato de sodio 100 mM, pH 5,5. Incubar las bacterias a 30 ° C por 1 h con agitación (> 100 rpm).
- Recoger las bacterias por centrifugación (5.000 x g durante 2 min) y resuspender en ~ 100 μL de LB con citrato de sodio 100 mM, pH 5,5.
- Trasmitir las bacterias en una placa LB suplementado con Kan en 25 μg/mL y citrato de sodio 10 mM, pH 5,5 y crecer las bacterias a 30 ° C hasta que las colonias (~ 24 h).
- Añadir el volumen adecuado de lisado de fagos a 1 mL de la cultura receptora (incluyendo CaCl2 a 10 mM) calculado en el paso 3.1.2 y mezclar suavemente.
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Selección de las transductants
- Una vez que las colonias han crecido en la placa de selección, les restreak LB + Kan solo colonias y crecen a 30 ° C hasta que las colonias solo aparecen.
4. suprimir el cassette de Kan
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La transformación con el plásmido de recombinación
- Realizar el espectro de tensión de BL21ΔABCF Kan-resistente.
- Crece la tensión de una sola Colonia en fresco LB (5 mL) complementado con Kan (25 μg/mL) a 30 ° C hasta que el OD600 ~0.5 – 0,7.
- De aquí en adelante, llevar a cabo los siguientes pasos a 4 ° C o en hielo. Centrifugue las bacterias (5.000 x g por 10 min) y eliminar el sobrenadante.
- Lavar el precipitado con agua destilada helada de células dos veces repitiendo el paso anterior de centrifugación y, finalmente, Resuspender el precipitado de células en 100 μl de helada glicerol al 10%.
- Enfriar cubetas de electroporación de 1 mm en el hielo.
- Añadir 1 pg de ADN (pCP20) plásmido a la suspensión de células, mezclar suavemente la suspensión y transferir a una cubeta de electroporación refrescado.
- Establecer la electroporator a 1,8 kV y electroporate las células.
- Rescatar las células transformadas agregando 1 mL de medio SOC y creciendo por 1 h a 30 ° C.
- Placa de 100 μl de las células en LB + Amp placas y crecen las células en 30 ° C durante la noche.
- Realizar el espectro de tensión de BL21ΔABCF Kan-resistente.
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Inducción de la recombinación
- Colonias solo Pick LB + amplificador de la placa e inoculan fresco LB omitiendo todos los antibióticos.
- Crecen las células a la temperatura no permisiva (43 ° C) durante la noche para inducir la expresión de recombinase FLP.
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Selección de recombinantes
- Hacer diluciones seriadas y 50 μl de una dilución de6 5-10 10 en placas no selectivo de la placa y crecer durante la noche a 30 ° C.
5. verificación de la canceladura del Gene
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Verificación de la pérdida del plásmido y recombinación exitosa
- Racha solo las colonias de las placas de preparado en el paso 4.3.1 en Kan, LB, LB + Amp y las placas LB sin antibióticos, en este orden. Para ayudar en las rayas, utilice una rejilla de Colonia (véase la archivo adicional 1). Crecen las placas a 30 ° C hasta que las colonias (~ 24 h).
- Recoger 10-20 clones que han crecido en la placa no selectivo pero no crecen en medios selectivos para mayor verificación.
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Verificación adicional de colony PCR
- Realizar una colonia PCR con cebadores que flanquean el tamA secuencia de codificación (véase Tabla de materiales).
- Preparar una mezcla PCR master. La cantidad de mezcla necesitada depende del número de colonias a ser probado (ver ejemplo en tabla 1). Mezclar los reactivos en el hielo, añadir la polimerasa de la última.
- Homogeneizar la mezcla PCR master y dispensar 20 μl en tubos de una tira PCR. Recoger una pequeña cantidad de cada colonia para ser proyectada utilizando una pipeta estéril y añadir a un tubo. No olvide incluir la cepa receptora original para la comparación. Opcionalmente, también incluyen la cepa donante.
- Ejecutar una reacción de PCR (ver tabla 2 para el programa utilizado).
- Preparar un gel de agarosa al 1%.
- Para un gel de 50 mL, medir de 0.5 g de agarosa y añadir 50 mL de buffer TAE (40 mM Tris, ácido acético al 20 mM y 1 mM EDTA, pH 8.0). Calienta la mezcla en el microondas hasta que se disuelva la agarosa todos.
- Una vez que la agarosa se disuelva, enfriar la solución a aproximadamente 50 ° C y luego añadir 5 μL de ADN tinción colorante. Mezcle bien la solución y verterla en una bandeja de gel en una cámara de fundición. Introduzca una o más filas de peines bien hay pozos suficientes para todas las muestras, así como marcadores de tamaño molecular. Permita que el gel para 30 minutos.
- Una vez finalizado el plazo de la polimerización en cadena, añadir 4 μL de 6 x tinte carga de ADN a cada muestra. Colocar el gel en la cámara de electroforesis y añadir Tampón TAE hasta que los pozos están cubiertos.
- Aplicar 10-15 μl de cada reacción de PCR a un pozo en el gel. También añadir 5 μl del marcador de tamaño molecular. A continuación, ejecute el gel durante 30 minutos a 75 V.
- Una vez finalizado el plazo, el gel utilizando a un sensor de luz azul de la imagen.
6. otras técnicas
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Expresión de la proteína
Nota: La expresión de proteínas de la prueba (YadA y EibD) ha sido descrito en detalle en otra parte23,24. Este es un breve resumen de los pasos principales.- Transformar BL21ΔABCF ΔtamA with la plásmidos necesaria (YadA pIBA2 y pEibD10 y la plásmidos de control correspondiente) y seleccione transformantes en LB + Amp.
- Para la expresión de la proteína, inocular 100 mL de medio LB + Amp con 1 mL de un cultivo durante la noche de bacterias transformadas y crecer a 30 ° C hasta la fase de registro medio, momento en el que, inducir la producción de proteína con cualquiera de los dos anhydrotetracycline (a 100 ng/mL) o thiogalactoside de isopropilo (a 0,5 mM).
- Después de 2 h de la inducción a 30 ° C, medir la turbidez de los cultivos y recolectar un número de células correspondientes a 50 mL en OD600 = 1.0 por centrifugación de los cultivos durante 15 min a 4.000 x g. Lavar el sedimento 1 x con 10 mM HEPES, pH 7,4 y luego o bien almacenarlo a-20 ° C o proceso adicional como en el paso 6.2.
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Extracción de la membrana externa
Nota: La extracción de la membrana externa se realiza como se describe en detalle por León et al. 27. a continuación se resumen los pasos principales.- Resuspender el precipitado de células en 1 mL de 10 mM HEPES, pH 7,4, complementado con 10 mM MgCl2 MnCl2, lisozima (0,1 mg/mL) y una pizca de ADNasa I.
- Lyse las células (e.g., usando un batidor de grano).
- Centrifugar las células poco (2 min a 15.600 x g) para eliminar restos celulares y trasladar el sobrenadante a un tubo nuevo.
- Centrifugar las células durante 30 min a 16.000 x g, después de lo cual, Resuspender el pellet en 400 μL de 1% N-lauroil sarcosina en 10 mM HEPES, pH 7,4.
- Incubar las células con agitación durante 30 min a temperatura ambiente, después de lo cual, centrifugar por 30 min como el anterior.
- Lave el translúcido pellet 1 x con 200 μL de 10 mM HEPES, pH 7,4, resuspender en 30 μL de 10 mM HEPES y añade 10 μL de tampón de SDS-PAGE 4.
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Ensayos de actividad
Nota: Realizar los análisis de SDS-PAGE y actividad para YadA y EibD descrito28. A continuación se resumen los pasos principales. -
SDS-PAGE
- Calentar las muestras a 50 ° C durante 5 minutos antes de cargar en un gel de poliacrilamida, para evitar la desnaturalización de las proteínas.
- Después de la separación en SDS-PAGE, transferir las proteínas a una membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno.
- Después de la transferencia, bloquear la membrana con 2% de polvo de leche desnatada en PBS.
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YadA-colágeno lejos-de western blot
- Después de los bloqueos, añadir colágeno bovino tipo que diluido en solución amortiguadora de bloqueo a una concentración de 10 μg/mL e incubar la membrana para 1 h.
- Lavar la membrana 2 x con PBS + 0.05% Tween20 (PBS-T).
- Añadir el anticuerpo primario (monoclonal anti colágeno COL-1) a la membrana, 1:2,000 diluido en solución amortiguadora de bloqueo.
- Después de incubar la membrana durante 1 hora, lavar 2 x como se menciona en el paso 6.3.2.2 y luego añadir el anticuerpo secundario [cabra anti-ratón IgG conjugado-rábano peroxidasa (HRP)], diluido 1: 10,000 en solución amortiguadora de bloqueo.
- Incubar la membrana durante 1 hora, luego lavar x 2 con PBS-T. Añadir un sustrato quimioluminiscente mejorado a la membrana según las instrucciones del fabricante y detectar la banda usando una cámara CCD.
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IgG por EibD ensayo obligatorio
- Después de los bloqueos, añadir un anticuerpo secundario (cabra anti-conejo HRP), diluido 1:2,000 en solución amortiguadora de bloqueo.
- Incubar la membrana durante 1 hora, luego lavar x 2 con PBS. Realizar la detección quimioluminiscente como se menciona en el paso 6.3.2.5.
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Representative Results
Generación de un tamA Knock-out de BL21ΔABCF:
La estrategia mencionada anteriormente se ha utilizado para producir una cepa derivada de BL21(DE3), una cepa de laboratorio estándar utilizada para la producción de la proteína, que es optimizada para producción de proteínas de membrana externa y llamada BL21ΔABCF21. Esta cepa carece de cuatro genes que codifican para proteínas de membrana externa abundante y, en consecuencia, es capaz de producir proteínas de membrana externa más heterologously expresados que la cepa de tipo salvaje. Para probar si el TAM participa en la biogénesis TAA, el gene de tamA fue suprimido en este fondo.
Un lisado P1 fue preparada de la cepa de colección de Keio JW4179, donde el gene de tamA (anteriormente llamado yftM) la secuencia de codificación se sustituye por una cinta de resistencia de Kan. Entonces, un experimento de transducción de señales se realizó con BL21ΔABCF como la cepa receptora. Se obtuvieron varias colonias resistentes a Kan, después de los cuales dos fueron elegidos para la supresión de la cassette de Kan. El plásmido pCP20, codificación del recombinase FLP, fue introducido en estos clones y, posteriormente, curada por crecimiento a 43 º C en ausencia de una selección de antibióticos. Un número de clones fueron defendido por sensibilidad al amplificador (que es un marcador de pCP20) y Kan, y se obtuvieron varios clones sensibles a ambos. Estos clones fueron verificados por Colonia PCR utilizando cebadores que flanquean el tamA secuencia de codificación y encontraron que el gen tamA había eliminado con éxito (figura 4).
Papel de TamA en la biogénesis de la TAA:
TamA ha demostrado para estar implicado en la biogénesis de algunos clásicos autotransporters16 y la inversa autotransporter intimin15. Para probar si TamA es importante para la biogénesis de TAAs, BL21ΔABCF ΔtamA se transformó con los plásmidos que codifican dos proteínas de la prueba, la adhesina de Yersinia YadA y la e. coli Ig-proteína EibD. Estas proteínas se conocen bien en e. coli y se han utilizado como modelos para la biogénesis de la TAA en anteriores estudios23,28.
Después de inducir la producción de proteínas, las fracciones de la membrana externa de las culturas de expresión fueron aisladas y analizadas por SDS-PAGE. Las muestras no fueron hervidas para demostrar trimerization de las proteínas. Los trimers ejecutan en tamaños superiores a 100 kDa, mientras que los monómeros esperaba tamaños de 45 kDa (YadA) y 51 kDa (EibD). Se observó ninguna diferencia importante entre los niveles de expresión en BL21ΔABCF y BL21ΔABCF ΔtamA, aunque YadA parece producirse a niveles algo más bajos en la cepa Δ detamA (figura 5A). Sin embargo, lo opuesto parece ser el caso de EibD.
Para examinar si la falta de TamA podría influir en el correcto plegamiento o transporte de las proteínas, se ha probado su capacidad para unirse a ligandos. Para YadA, esto fue logrado por un colágeno lejos-de western blot (figura 5B). YadA, en ambas cepas, destino colágeno a un nivel similar, demostrando que las proteínas correctamente plegadas y funcional. Del mismo modo, las actividades de la Unión de IgG de EibD en las dos cepas correlacionan con el nivel de expresión (figura 4). Estos resultados demuestran que la supresión de tamA no tiene un efecto significativo sobre la biogénesis TAA, no al menos para estos dos modelo TAAs.
Figura 1: generación de knock-outs con los casetes antibióticos. Para la producción de los genes knock-outs, un gen de interés (Gene B en este ejemplo) se sustituye por una cinta de resistencia Kan flanqueada por sitios FRT. El casete de la FRT-Kan, a su vez, está flanqueado por corto (~ 50 bp) se extiende de secuencia homóloga a las regiones de aguas arriba y aguas abajo del Gene B. La secuencia de codificación del Gene B se intercambia para el cassette de la FRT-Kan por λ rojo recombinación. Una vez que esto se logra, puede eliminarse el cassette de Kan sí mismo introduciendo el recombinase FLP, que se median una recombinación específica del sitio entre los sitios FRT. Esto accisas el cassette de Kan, dejando un mínimo (~ 100 bp) secuencia en el locus B la cicatriz. Para más detalles, véase Baba et al. 7. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: canceladura del Gene por transducción P1. El donante del protector (beige) lleva un cassette de Kan que ha sustituido el gen de interés (amarillo) en el cromosoma (azul). El donante está infectado con el bacteriófago P1. El fago se multiplica en la cepa donante, produciendo una gran cantidad de progenie. La mayoría son tipo salvaje (genoma rojo), pero una fracción son transductoras phages que han incorporado una parte de lo donantes cepa cromosoma en lugar de fago ADN (genoma azul). Una proporción de estos contiene el cassette de Kan (genoma amarillo). Finalmente, la célula huésped infectada descompone mediante lisis y libera los phages en el medio. Estos se utilizan para preparar un lisado. En el experimento de transducción de señales, la cepa receptora (azul claro) está infectada con el lisado preparado a partir de la cepa donante. En una minoría de casos, el destinatario está infectado por un fago transductoras llevar el casete de Kan (mostrado aquí). Si las regiones adyacentes a la cinta de Kan sufren recombinación homóloga, el cassette de Kan se incorpora en el cromosoma receptor reemplazando el alelo endógeno, lo que resulta en clones Kan-resistentes que pueden ser seleccionadas para. La adición del recombinase FLP en un plásmido curable accisas el cassette de Kan, dejando sólo una cicatriz corta secuencia (que se muestra aquí en amarillo), que vuelve el clon al fenotipo sensible a Kan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: ejemplos de placas después de una infección P1. (A) este panel muestra una placa con las placas individuales. (B) este panel muestra una placa semi-confluente. (C) este panel muestra una placa demasiado infectada, donde casi todas las bacterias han sido sometidas a lisis por fagos. Algunas colonias resistentes han crecido fuera de la capa de agar superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Eliminación de la tamA secuencia de codificación. El alelo de la canceladura de tamA::kan fue introducido en la cepa BL21ΔABCF por transducción de P1. Después de la supresión de la cassette de Kan, una secuencia de cicatriz (~ 100 bp) es todo lo que queda en el lugar geométrico de tamA . Esto fue verificado por PCR utilizando cebadores que flanquean el sitio de eliminación. En BL21ΔABCF y su cepa parental, BL21(DE3), la PCR da un producto de la longitud de la tamA (el tamaño esperado es 1,7 pares de kilobases) de la secuencia de codificación. En BL21ΔABCF, donde el cassette de Kan ha sido suprimido, el producto corresponde a la secuencia esperada de la cicatriz (145 bp). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Expresión de TAAs por una cepa de eliminación tamA . (A) este panel muestra el SDS-PAGE de membranas externas de las células que expresan el TAAs (YadA o EibD) y controles del vector (pIBA2 y pET22). Las cepas son BL21ΔABCF y su derivado cepa carente de TamA (ΔtamA). (B) este panel muestra un colágeno lejos-inmunoblot de YadA muestras. Las muestras de YadA y pIBA2 controles de panel A fueron transferidos a una membrana PVDF y se incubaron con colágeno de tipo I. Luego probó con un anticuerpo anti-colágeno y detectados por ECL. (C) este panel muestra un ensayo de unión de anticuerpo para EibD muestras. El EibD muestras y pET22 controles de panel A fueron transferidos a una membrana PVDF e incubados con un anticuerpo secundario conjugado con HRP y entonces detectados por ECL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo de | mezcla de x 1 | mezcla de x 7 |
| Agua grado PCR | 17 ΜL | ΜL DE 119 |
| 10 x buffer de la polimerasa | 2 ΜL | 14 ΜL |
| mezcla de desoxirribonucleótidos de 10 mM | 0.4 ΜL | ΜL DE 2,8 |
| Primer avance de 100 μm | 0.2 ΜL | 1,4 ΜL |
| Primer revés de 100 μm | 0.2 ΜL | 1,4 ΜL |
| Taq ADN polimerasa | 0.2 ΜL | 1,4 ΜL |
| Total | 20 ΜL | 140 ΜL |
Tabla 1: Colonia PCR master mix. La cantidad de mezcla depende del número de colonias que se proyectarán. Además, preparar una reacción de control (tensión receptora original). Por ejemplo, si cinco clones de detección, seis reacciones son necesarias, incluyendo el control. Merece la pena preparar una reacción adicional para asegurarse de que hay bastante mezcla PCR para todas las muestras (repetido pipeteo amplifica pequeños errores de pipeteo). En este ejemplo, preparar una mezcla de 7 x (5 colonias, 1 control y 1 reacción extra).
| Paso | Temperatura | Tiempo | Notas |
| 1. | 94 ° C | 3 min | |
| 2. | 94 ° C | 30 s | |
| 3. | 50 ° C | 30 s | |
| 4. | 70 ° C | 2 min | 1 min/kb para ser amplificados, redondear |
| Regresar 2 24 veces | |||
| 5. | 70 ° C | 5 min | |
| 6. | 12 ° C | Para siempre | espera final |
Tabla 2: Colonia PCR programa.
Archivo complementario 1: un ejemplo de red Colonia. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Transducción de P1 es un método rápido, robusto y fiable para la generación de canceladuras del gene de e. coli. Esto se demuestra aquí por transducción de un mutante de eliminación de tamA de una cepa de Keio donante a un beneficiario derivado BL21. Las principales etapas en el proceso de transducción de señales son la producción de la transducción de lisado, la transducción de sí mismo, la supresión de los cassettes de resistencia de Kan y la verificación del knock-out por PCR. En total, el proceso toma aproximadamente una semana y no requiere que ningún método de biología molecular para ser utilizado, aparte de la final de la PCR para la verificación. Por lo tanto, P1 transducción puede competir en tiempo con λ y esfuerzo gastado recombinación rojo y es mucho más rápido que la mutagénesis de cambio marcador tradicional.
El protocolo presentado es muy robusto y permite la modificación de muchos de los pasos. Sin embargo, hay algunos parámetros críticos. Para las infecciones de P1, es necesario añadir los iones del calcio al medio. El calcio es necesario para la adsorción del fago a la bacteria, y si no añade suficiente calcio al medio reducirá significativamente la eficiencia de la infección. Algunas bacterias de cepas como BL21ΔABCF tienden a agregado en presencia de CaCl221. En tales casos, la bacteria se puede cultivar sin CaCl2, que puede ser agregado a la suspensión poco antes de la infección. Sin embargo, para las cepas más convencionales, 10 mM CaCl2 pueden incluirse en el medio de crecimiento desde el principio.
Por el contrario, es importante eliminar el calcio libre desde el medio después de la transducción. El citrato es un quelante de iones calcio, y porque éstos son necesarios para la adsorción de P1 a las células del huésped, quitando el calcio libre desde el medio además previene infecciones. Si el calcio no se elimina, los phages infectará otras células a través de la cultura, en el mejor reduciendo la eficiencia de la transducción y lisis en el peor de los casos la cultura entera, incluyendo las transductants.
Otro paso fundamental es cultivar las bacterias con el plásmido pCP20. pCP20 es un plásmido replicación condicional que no se reproduce a temperaturas de 37 ° C o más; así, para establecer el plásmido en las células, las incubaciones con este plásmido deben ser realizado a 30 ° C (o menos), una temperatura permisiva para la replicación del pCP20. Para curar la pCP20, se utiliza una temperatura alta (43 ° C). Algunas cepas no crecen bien a esta temperatura; en tales casos, 37 ° C debería ser suficiente, aunque el curado del plásmido será algo menos eficiente a esta temperatura.
Cuando las bacterias para probar la sensibilidad a antibióticos de la galjanoplastia, el orden de rayar la placa es importante. El protocolo requiere clones que se trata primero el antibiótico que contiene las placas y finalmente en medio no selectivo. De esta manera, el investigador puede estar seguro de que cualquier falta de crecimiento en medios selectivos será debido a la sensibilidad antibiótica y en lugar de a una potencial falta de material transferido en las placas. Siguiendo el protocolo, no hay crecimiento en la LB + Kan placa valida la supresión de los cassettes de resistencia Kan; no hay crecimiento en la LB + Amp placa valida la pérdida de la pCP20 de plásmidos recombinación; las cepas crecen en la placa LB (que no creció en el mismo experimento veteado en las placas de selección) contendrá el positivo recombinantes.
La mayoría de los otros pasos permite un margen considerable. En el protocolo presentado, BL21ΔABCF es cultivadas a 30 ° C, como esta variedad no crece bien a 37 ° C. Sin embargo, las cepas de e. coli sin defectos de crecimiento pueden ser cultivadas a 37 ° C (excepto cuando se transforma con pCP20).
El número de bacterias que se utilizan para las infecciones puede variar hasta cierto punto. La relación entre el OD600 y un recuento de viable es aproximadamente lineal entre un valor de600 de OD de 0.1 y 1.0, donde la primera corresponde a aproximadamente 108 UFC/mL y el último a ~ 109 UFC/mL. Sin embargo, esta relación puede variar en cierta medida dependiendo de la cepa en cuestión, el medio de crecimiento y otros factores. Se recomienda que se establezca la relación entre el OD600 y la cuenta viable para cada laboratorio y tensión, particularmente para el cálculo de valores MOI. El número de bacterias en experimentos de infección no es particularmente crítico y 109 UFC/mL representa la fase estacionaria temprana, que es un compromiso razonable entre la densidad celular y la proporción de células viables en la cultura. Si un menor número de bacterias viables se utiliza para la transducción de señales, el número de fagos simplemente debe ajustarse en consecuencia. El Ministerio del interior también se puede variar hasta cierto punto. El protocolo exige un valor MOI de 0,5, aunque cualquier cosa entre 0.1 y 0.5 debe resultar en una buena eficiencia. En una MOI de 0.5, la proporción de phages a las bacterias es 1:2 (es decir, la mitad el número de fagos en comparación con el número de bacterias). En el ejemplo en el protocolo, el OD600 de la cultura es 1.0, y 1 mL del cultivo se utiliza para la transducción; así, el número de fagos necesaria es de 5 x 108. Un valor MOI de 0.5 da un alto nivel de infección, pero reduce el número de bacterias que están doblemente infectadas, que reduciría la eficiencia de la transducción de señales como los phages (infecciosos) de tipo salvaje superan los phages transductoras. Una infección doble con un fago transductoras y un fago infecciosa conduciría a la célula lysis, eliminando así este transductant de la piscina de los sobrevivientes. Por lo tanto, no debe sobrepasarse una MOI de 0.5.
El protocolo también permite algunos atajos. En el lugar de preparación de lisados de las placas, algunos autores abogan por preparación de lisados de fago en medio líquido29. Esto puede ahorrar tiempo, no es necesario un paso de incubación durante la noche. Del mismo modo, valorar el lisado de fagos puede no ser necesario. Como se señaló anteriormente, el Ministerio del interior no es muy crítica y razonable eficacia puede lograrse simplemente si se asume que un título de 1010 pfu/mL para un estándar de lisado.
A pesar de la facilidad de la técnica, P1 transducción no es universalmente aplicable, y varias condiciones deben cumplirse para que pueda ser útil. En primer lugar, una variedad de donantes con un alelo knock-out seleccionable debe estar disponible. Esto se logra generalmente mediante el uso de una canceladura en un casete de resistencia a los antibióticos ha sustituido el gen de interés. La colección de Keio es particularmente útil en este sentido, ya que ofrece una biblioteca lista para usar de antibiótico gen cassette-basado knock-outs que cubre casi todos los genes no esenciales en e. coli K12. Esta colección es particularmente útil para noquear a conservado genes encontrados cepas de e. coli la mayoría (es decir, los componentes del genoma del núcleo de e. coli ). Para genes menos comunes, tales como factores de virulencia de patógenos Escherichia coli cepas o vía metabólica rara genes, la mutación deba ser creado de novo. En tales casos, transducción P1 no puede ser el método de elección. Además de genes esenciales, genes que se requieren para infección P1, como galU, mutaciones que conducen a P1 resistencia30, son pobres blancos para una canceladura por transducción de P1. Otra nota al utilizar la colección de Keio, en concreto, es que algunas tensiones llevan una duplicación del gen específica, donde una única copia fue interrumpida por el Kan resistencia cassette8. En tales casos, el gen de interés puede ser esencial; investigadores recomiendan revisar anotaciones actualizadas para tales genes8. Sin embargo, teniendo en cuenta estas restricciones, transducción P1 permite la eliminación de la mayoría de los genes en cepas de e. coli de laboratorio. Por ejemplo, las diferencias entre BW25113 y BL21(DE3) son pequeñas y afectan sólo un puñado de genes de codificación de la proteína31.
En segundo lugar, es importante destacar que la cepa receptora debe ser capaz de una recombinación homóloga para la transducción de señales trabajar. Una cepa que carece el recombinase que Reca puede, por lo tanto, no serán modificados por este método. Esto excluye las cepas estándar de clonación, DH5α HB101, TOP10, y XL-1 azul. RecA puede mediar recombinaciones entre tramos idénticos tan cortos como 8 bp; sin embargo, una región más larga de la alta semejanza aumentará la probabilidad de recombinación significativamente32,33. Otro problema, particularmente con la clínica de e. coli las cepas, es que largas cadenas de O-antígeno pueden enmascarar los receptores P1, que se encuentra en el oligosacárido núcleo de lipopolisacárido34. Además de estos requisitos para la cepa receptora, la cepa P1 utilizada para transducción de señales debe ser un mutante de vir ; Esta mutación es necesaria para una infección lítica completo35.
Una tercera ADVERTENCIA de transducción de señales es que el gene para ser noqueado debe residir en una región con alta similitud en las regiones que flanquean entre donante y receptoras cepas P1. Si hay una falta de synteny entre las cepas, puede fallar bien el reemplazo blanco del gene de la codificación de la secuencia con el cassette de Kan, debido a las diferencias en el contenido de las regiones flanqueantes. Por lo tanto, antes de embarcarse en la canceladura del gene mediada por P1, los investigadores deben revisar las secuencias de las cepas donantes y receptores para asegurarse de que las secuencias que flanquean son homólogas. Por supuesto, esto sólo es posible si las cepas han sido secuenciadas. En el caso de las cepas con una secuencia desconocida, transducción P1 puede fallar o causar otros problemas, como una conversión del gene en las regiones que flanquean. P1 puede transducir aproximadamente 90 pares de kilobases de ADN; Si hay diferencias en el contenido de genes en las regiones alrededor del gene de la blanco (e.g., pequeñas deleciones o inserciones), es probable que estas se revertirán a la secuencia de donantes. Esto podría tener consecuencias en el fenotipo de la cepa receptora. Por lo tanto, siempre que sea posible, las secuencias de donante y receptor en el gen de interés se deben siempre comparar antes de transducción P1.
En conclusión, la transducción de P1 es una manera rápida de transferir un gen específico knock-out a un número de cepas, una vez que se ha generado la mutación inicial de knock-out. Aunque la técnica tiene sus limitaciones, la facilidad y rapidez de su aplicación hacen una alternativa atractiva a otros métodos de canceladura del gene. P1 sólo infecta e. coli, que normalmente limita su uso a esta especie. Sin embargo, algunas variantes de P1 se han desarrollado un más amplio rango de hospederos y puede infectar a otras especies dentro de la familia Enterobacteriaceaee incluso algunos otros γ-proteobacterial, aunque en reducida eficiencia36, 37. incluso la transducción de ADN clonado de e. coli a Myxococcus xanthus, un δ-proteobacterium, ha sido reportado38. En experimentos futuros, estas variantes podrían ser aumentadas con la mutación de vir para ampliar la gama de receptores cepas utilizadas en la canceladura del gene antibiótico basado en cassette por transducción general.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Se obtuvieron cepas de colección de Keio del proyecto nacional de BioResource (NIG, Japón): e. coli. Agradecemos a Dirk Linke (Departamento de ciencias biológicas, Universidad de Oslo) por su continuo apoyo. Este trabajo fue financiado por el Consejo de investigación de Noruega joven investigador subsidio 249793 (Jack C. Leo).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
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