Summary
Qui, presentiamo un protocollo per stabilire il modello depressivi del mouse, osservare i cambiamenti di comportamento connessi con sforzo delicato imprevedibile cronico (CUMS) e valutare l'effetto di anti-depressione di Xiaoyaosan.
Abstract
Oltre all'uso standardizzato di farmaci antidepressivi e psicoterapia, l'utilizzo della medicina tradizionale cinese ha portato ad un miglioramento globale dei pazienti con disturbo depressivo maggiore (MDD). Pertanto, lo scopo di questo studio era di stabilire il modello depressivi del mouse, osservare i cambiamenti di comportamento connessi con sforzo delicato imprevedibile cronico (CUMS) e quindi valutare l'effetto di anti-depressione di Xiaoyaosan. Topi sono stati divisi a caso in quattro gruppi: un gruppo di controllo, un gruppo di modello, un gruppo di trattamento con Xiaoyaosan e un gruppo di trattamento con fluoxetina. Tutti i topi sono stati mantenuti singolarmente in gabbie e depressione è stato indotto nei topi di esporli a progettato diverse manipolazioni del CUMS per 21 giorni, come descritto nel protocollo. I topi nel gruppo di controllo e gruppo di modello hanno ricevuto 0,5 mL di acqua distillata, mentre i topi nei gruppi di trattamento hanno ricevuto entrambi Xiaoyaosan (0,25 g/kg/giorno) o fluoxetina (2,6 mg/kg/giorno). Le droghe usate nello studio erano dato intragastrically giornalmente durante le tre settimane intere. Per stimare i comportamenti simil-depressivi, una serie di parametri tra cui lo stato di cappotto, peso corporeo, aprire il punteggio del test di campo, e punteggio del test di saccarosio preferenza sono stato registrato. Analisi dei dati ha mostrato che i comportamenti del modello di topi sono stati cambiati significativamente rispetto ai comportamenti dei topi nel gruppo di controllo, che sono stati migliorati dal trattamento di Xiaoyaosan e la fluoxetina. I risultati attuali hanno dimostrato gli effetti di anti-depressione di Xiaoyaosan sui comportamenti dei topi indotti su CUMS e ha rivelato che composti dalla prescrizione di Xiaoyaosan possono essere utili nel trattamento della depressione, considerando i loro effetti benefici sulla comportamenti simil-depressivi.
Introduction
MDD è una malattia mentale cronica, altamente ricorrente che presenta con persistente umore basso, depressione, bassa autostima, ritardo mentale, perdita di interesse, disturbi del sonno, profondamente pessimistiche o suicida tendenze; ha causato gravi danni alla salute umana e stabilizzazione sociale1. È diventato una delle causa primaria del mondo della disabilità, e può essere una delle principali cause principali di malattia nel 2030 secondo l'organizzazione mondiale della sanità2,3. Attualmente, psicoterapia e farmaci antidepressivi sono considerati di essere la prima scelta per il trattamento di MDD. Tuttavia, un numero enorme di pazienti diagnosticati con MDD non rispondono alla terapia o farmaco continuo, e sono elencati come avendo depressione trattamento-resistente4.
Xiaoyaosan è un classico cinese composto5 che è stato ampiamente usato per trattare malattie psicologiche per migliaia di anni a partire dalla dinastia Song in Cina6. Si compone di 8 erbe cinesi: Radix Bupleuri, Radix Paeoniae Alba, Radix Angelicae Sinensis, Poria, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, Radix Glycyrrhizae, Rhizoma Zingiberis Recens e Herba Menthae. Xiaoyaosan contiene più costituenti, ha più bersagli e utilizza molteplici vie7. Xiaoyaosan è stato comunemente indicato per essere una formula sicura ed efficace per il trattamento di vari disturbi correlati al mentale di malattie, e studi moderni hanno anche messo a fuoco sul meccanismo anti-depressione di questo composto8,9, 10. La patogenesi della MDD non è ancora chiara, anche se esistono molteplici ipotesi, tra cui l'ipotesi della monoammina, l'ipotesi di recettori del neurotrasmettitore, l'ipotesi di cambiamento di funzione neuroendocrina, l'ipotesi di anomalia del sistema immunitario, ecc. Diversi studi hanno dimostrato che l'effetto antidepressivo di Xiaoyaosan ha un collegamento con le basi materiali delle ipotesi sopra11,12e i relativi manifesti di azione terapeutica come miglioramento al tipo di depressiva comportamenti13.
Inoltre, con la prevalenza della depressione, la società moderna ha sofferto di riduzioni della forza lavoro, i pensionamenti anticipati e trattamenti costosi14. Trattamento costoso ha bisogno di attenzione medica rigorosa, che significa una gamma di costi medici aumentati e precisa previsione di precisi risultati indesiderati, come pure effetti collaterali15. L'erba cinese Xiaoyaosan ha componenti accessibili, effetti unici e lievi effetti collaterali. Sua applicazione può giocare un ruolo nel ridurre l'onere del trattamento medico moderno. Di conseguenza, per fornire una base più teorica per l'applicazione di Xiaoyaosan, una terapia alternativa clinica dovrebbe essere offerto per il trattamento della depressione, l'incidenza di che aumenta di anno in anno e dovrebbe migliorare la salute umana allo stesso tempo. Questo articolo descrive un protocollo che coinvolge l'uso di Xiaoyaosan al fine di prevenire i comportamenti simil-depressivi che stabilisce il modello depressivo del mouse. Il campo aperto test e test di preferenza di saccarosio sono stati utilizzati per verificare gli effetti antidepressivi di Xiaoyaosan.
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato dal comitato di etica animale dell'Università di Pechino di medicina cinese ed è stato in conformità con tutte le linee guida per la cura e l'uso di laboratorio animali della Cina. Non c'era nessuna situazione di morte accidentale durante la procedura sperimentale, e nessun animale dovevano essere eutanasia in questo studio.
1. preparazione di farmaci per l'esperimento
Nota: Erbe cinesi sono state acquistate e poi autenticate dal Dr. B. Liu dell'Università di medicina cinese Beijing. Xiaoyaosan contiene i seguenti otto farmaci tradizionali cinesi in un rapporto di 6:6:6:6:3:6:2:2: Radix Angelicae Sinensis, Radix Paeoniae Alba, Poria, Radix Bupleuri, Radix Glycyrrhizae, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, Herba Menthae e Rhizoma Zingiberis Recens.
- Preparare Xiaoyaosan come descritto in precedenza16.
Nota: Abbiamo estratto questi composti nella sala di preparazione di medicina cinese di China-Japan Friendship Hospital, e la resa di estrazione era 18,8%. - Verificare la qualità di Xiaoyaosan di spettrometria della cromatografia-massa liquida ad alte prestazioni analisi (LC-MS/MS)17.
2. preparazione dei topi per la procedura sperimentale
Nota: Per la procedura sperimentale, sono stati selezionati 60 topi C57BL/6J maschio sani 12 settimane di età, con ogni mouse peso compreso tra 18 e 22 g.
- Tenere i topi singolarmente in gabbie in una tipica camera animale di laboratorio specifico patogeno Free (SPF) (22 ± 1 ° C, ciclo di buio/luce 12 h/12 h, umidità relativa: 30-40%) per una settimana prima della procedura CUMS.
- Dividere in modo casuale tutti i topi in un gruppo di controllo, un gruppo di modello, un gruppo di trattamento di Xiaoyaosan o un gruppo di trattamento del fluoxetine secondo il loro peso corporeo. Ogni gruppo dispone di 15 topi.
- Prima dell'inizio dell'esperimento, numerare i topi in ogni gruppo sulla loro coda utilizzando una penna di marcatura.
- Tutti i topi utilizzando un test di preferenza di saccarosio di cinque giorni di prova (Vedi punto 5) e una prova di campo aperto (vedere il passaggio 6).
3. induzione di depressione in topi
Nota: Per indurre la depressione, i topi del gruppo di modello e due gruppi di trattamento hanno subito CUMS per 21 giorni18. Il piano può essere modificato secondo la situazione pratica, ma il principio che il fattore di stress stesso non può essere usato continuamente deve essere seguito.
-
Esporre i topi al giorno per due dei seguenti sette fattori di sforzo per 21 giorni consecutivi19. Il nostro piano di modellazione è progettato come segue:
- Il lunedì, esporre topi per deprivazione alimentare (vuoto il feed di ogni gabbia per 24 h, 8:00 a 8:00) e la privazione dell'acqua (rimuovere la bottiglia bevente di ogni gabbia per 24 h, 8:00 a 8:00).
- Martedì, esporre topi per lo sforzo del fermo (trattenga topi in una piccola vasca di plastica per 3 h, 8:00 a 11:00) e gabbie vuote (rimuovere l'imbottitura in ogni gabbia per h 11, 8:00 alle 19:00 p.m.).
- Il mercoledì, esporre topi per gabbie bagnati e sporchi (versare l'acqua in ogni gabbia e mantenere umido per 24 h, 8:00 a 8:00) e affollata gabbie (mettere cinque topi in una gabbia per 24 h, 8:00 alle 08:00 del mattino).
- Il giovedì, esporre topi per lo sforzo del fermo e piscina ghiacciata20,21 (forza ogni mouse per nuotare in un acquario di vetro trasparente con acqua ghiacciata per 5 min).
- Il venerdì, esporre topi di gabbie bagnate e sporche e la privazione di cibo.
- Il sabato, esporre topi per lo sforzo del fermo e gabbie affollate.
- Domenica, esporre topi di gabbie vuote e piscina ghiacciata.
- Registrare il cappotto dello stato e del peso corporeo ogni settimana fino alla fine della modellazione (giorno 21). Calcolare il punteggio totale dello stato cappotto come la somma dei punteggi da sette diverse parti del corpo: testa, collo, dorsale cappotto, cappotto ventrale, zampe anteriori, coda e zampe posteriori. Un punteggio di uno indica un cappotto ben curato, e un punteggio pari a zero indica un cappotto arruffato22.
- Eseguire un test di preferenza di saccarosio di cinque giorni (Vedi punto 5) e una prova di campo aperto (vedere il passaggio 6) alla fine dell'esperimento.
4. amministrazione di Xiaoyaosan
Nota: La dose di Xiaoyaosan (0,25 g/kg/giorno) è stato selezionato sulla base della sua efficacia soddisfacente come descritto in precedenza9.
- Durante l'esperimento, utilizzare acqua distillata per preparare le sospensioni Xiaoyaosan e fluoxetina e assicurarsi di utilizzare immediatamente.
- Dare 0,5 mL di acqua distillata per i topi nel gruppo di controllo e gruppo di modello di amministrazione intragastrica ogni giorno prima di modellazione. Nel frattempo, dare Xiaoyaosan (0,25 g/kg/giorno) o fluoxetina (2,6 mg/kg/giorno) per i topi in due gruppi di trattamento.
5. saccarosio preferenza Test
Nota: Nessuna privazione di acqua o cibo è stata applicata prima del test. Il protocollo è stato effettuato come precedentemente segnalato23.
- I primi due giorni, casa individualmente i topi con due bottiglie riempite con acqua del rubinetto.
- Nei prossimi due giorni, dare i topi due bottiglie riempite con 1% di soluzione di saccarosio.
- L'ultimo giorno, dare i topi due bottiglie per 24 h, una con acqua di rubinetto e l'altra con 1% di soluzione di saccarosio. Per eliminare una preferenza di lato dei topi nel comportamento del bere, cambiare la posizione delle due bottiglie dopo 12 h.
- Registrare il volume (mL) di soluzione di saccarosio consumato sia acqua di rubinetto. Calcolare la preferenza di saccarosio come segue: preferenza di saccarosio (%) = consumo di saccarosio/totale consumo liquido × 100%.
6. campo prova
- Eseguire la prova in loco aperta in una stanza scarsamente illuminata e tranquilla con una quattro lati nera lusterless scatola di legno. Dividere il pavimento in 25 quadrati uguali da linee blu.
- Pulire la casella campo aperto con 5% di alcol prima l'accesso di ogni mouse. Quindi, posizionare il mouse al centro del campo aperto delicatamente.
- Sospendere un ad alta definizione fotocamera digitale circa 200 cm proprio sopra il campo e registrare il comportamento di ogni mouse per 5 min.
- Valutare il video comportamentale di topi mediante il software di sistema di video-monitoraggio e registrare i dati del totale in esecuzione di distanza e il numero di voci nella zona centro.
- Analizzare i dati della distanza totale spostato e il numero di voci nella zona centro di software statistico.
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Representative Results
Si noti che i risultati sono stati pubblicati in precedenza da Dr. Xiu-Fang Ding, et al. 18
I dati sono stati espressi come media ± errore standard della media (SEM). Un one-way ANOVA o un test non parametrico è stato utilizzato per dati generali sulla base del test di normalità e il test di omogeneità della varianza. Il test di LSD è stato utilizzato per i confronti tra gruppi. Inoltre, il processo di misurazione ripetuta del modello lineare generale (GLM) è stato utilizzato per condurre analisi di varianza unidirezionale per ripetuti dati misurati (cappotto Punteggio e peso corporeo), e un processo di analisi multivariata della varianza è stato adottato per effettuare confronti tra i gruppi in ogni momento (metodo LSD) del punto.
Lo stato fisico dei topi indotti su CUMS
Dopo aver esposto i topi per tre settimane di CUMS per induzione della depressione, è stata indotta una distrofia progressiva dello stato cappotto nel gruppo modello; la distrofia non presentava dopo due settimane di stress, ma ha peggiorato alla fine della procedura CUMS (tre settimane), e il Punteggio di cappotto significativamente diminuita rispetto a quella del gruppo di controllo (F (3, 56) = 25.08, p = 0,000). Lo stato del cappotto dei topi è stata notevolmente migliorato dopo il trattamento continuo con Xiaoyaosan o fluoxetine rispetto al gruppo di modello (F (3, 56) = 25.08, entrambi p = 0,001, Figura 1a). Secondo i dati settimanali del peso del corpo di ogni gruppo, è stata manifestata una riduzione significativa del peso corporeo entro la terza settimana (F (3, 56) = 16.149, p = 0,000, Figura 1b), mentre il trattamento Xiaoyaosan o fluoxetina ha aumentato significativamente il corpo peso rispetto al gruppo di modello (F (3, 56) = 16.149, entrambi p = 0,001).
Il test di preferenza di saccarosio
Prima l'esposizione di sforzo, topi in tutti i gruppi hanno avuti una simile preferenza di saccarosio (condizione basale, Figura 2a). Tuttavia, è stato osservato un calo significativo nella preferenza di saccarosio dopo tre settimane di procedura di stress nel gruppo modello (F (3, 56) = 41.379, p = 0.000, Figura 2b). Trattamento Xiaoyaosan e fluoxetine invertito efficacemente questi cambiamenti e ha aumentato significativamente la preferenza di saccarosio rispetto al gruppo di modello (F (3, 56) = 41.379, entrambi p = 0,000).
La prova sul campo aperto
Prima l'esposizione di sforzo, tutti i topi hanno esibito un simile stato comportamentale (condizioni di base. Figura 2C e 2d). Tuttavia, dopo l'esposizione di sforzo per tre settimane, la distanza totale si trasferì in cinque minuti significativamente ha differito fra i gruppi. La distanza totale spostata dai topi nel gruppo modello era significativamente più bassa (F (3, 56) = 4.216, p = 0,003, Figura 2f) rispetto a quella del gruppo di controllo. Inoltre, il numero di voci nella zona centrale è stato anche significativamente differente fra i gruppi. Il numero di voci nella zona centrale del gruppo di modello ha fatto diminuire significativamente (F (3, 56) = 2.809, p = 0,013, Figura 2e) rispetto al gruppo di controllo. Trattamento della fluoxetina ha impedito questi cambiamenti nel trend di locomozione e ha migliorato significativamente la distanza totale e il numero di voci nella zona centrale (F (3, 56) = 4.216, p = 0,029; F (3, 56) = 2.809, p = 0,004). Un fenomeno simile inoltre è stato osservato nel gruppo del trattamento Xiaoyaosan (F (3, 56) = 4.216, p = 0,014; F (3, 56) = 2.809, p = 0,029).
Figura 1 : Gli effetti del Xiaoyaosan sui cambiamenti indotti su CUMS in stato fisico topi. I topi cappotto dello stato (a) e peso corporeo (b) sono stati misurati ogni settimana durante il periodo di stress. I dati sono stati espressi come la media ± SEM, n = 15 per gruppo. ** p < 0,001 contro controllo; ΔΔ p < 0,001 rispetto al modello. Questa figura è stata modificata da Ding, et al. 18 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Effetti di Xiaoyaosan sui comportamenti di tipo di depressiva indotta da CUMS. È stata condotta una batteria di test comportamentali, e sono stati misurati i seguenti parametri: saccarosio preferenza (a, b), il numero di voci in zona centro (c, e) e la distanza totale spostato (attività locomotoria) (d, f). I dati sono stati espressi come la media ± SEM, n = 15 per gruppo. * p < 0,05, *p < 0.01 e *p < 0,001 contro controllo; Δ p < 0,05, ΔΔp < 0.01 e ΔΔΔp < 0,001 contro il modello. Questa figura è stata modificata da Ding, et al. 18 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il modello CUMS utilizzato in questo studio è un metodo comune per stabilire il modello di diatesi stress di depressione24. La maggior parte delle manifestazioni di CUMS possono essere ripristinate da farmaci antidepressivi, che hanno indicato che questo metodo di modello ha una forte validità predittiva25. Da questo metodo, gli animali ricevono stimoli stressanti imprevedibili cronici e sviluppano sintomi di depressione, compresa la diminuzione posto preferenza condizionata, anedonia e comportamenti di tipo emotivo alterato26. Qui, in questo protocollo, il continuo utilizzo del Xiaoyaosan o fluoxetina può migliorare i comportamenti simil-depressivi di topi modello CUMS-induced in base ai risultati ottenuti nell'esperimento; la fluoxetina è come un farmaco di controllo positivo di dimostrare l'effetto di intervento di Xiaoyaosan.
La valutazione del cappotto punteggio, a differenza di campo aperto test, prova di nuoto, forzata o novità soppressa alimentazione prova, è una misura che non è associata alla depressione in esseri umani, ma è il metodo più diffuso, affidabile e ben-convalidato per il modello depressivo di mouse27. Nello studio presente, una distrofia progressiva dello stato cappotto nel gruppo del modello è stata indotta e non presentava dopo due settimane di stress ma ha peggiorato alla fine della procedura CUMS (tre settimane), mentre il peso corporeo non era significativamente differente tra i gruppi dopo una settimana di esposizione lo stress. Tuttavia, la differenza di peso corporeo in ogni gruppo ha cominciato ad emergere dopo la modellazione per due settimane, portando così a una diminuzione successiva entro la fine di tre settimane. I risultati indicano che questi cambiamenti in stato fisico dei topi indotti su CUMS potrebbero essere invertiti dal trattamento Xiaoyaosan e la fluoxetina, suggerendo che Xiaoyaosan potrebbe migliorare gli stati fisici dei topi depressi.
Per più ulteriormente convalidare il modello CUMS e verificare l'effetto del composto utilizzato nel presente protocollo, sono stati utilizzati per valutare i possibili comportamenti depressivi in topi indotti CUMS un test di preferenza di saccarosio e un campo aperto. La riduzione di anedonia nella preferenza di saccarosio è stato usato per valutare lo stato depressivo-come nei roditori, mentre la prova di campo aperto, come un animale test psicologico, è comunemente usato per valutare la funzione dell'apparato locomotore e l'emotività di roditori28. Il risultato ha mostrato che 3 settimane dell'esposizione di sforzo ha avuto un'influenza evidente alla preferenza di saccarosio dei topi, e l'anedonia è stato invertito da trattamenti per la Xiaoyaosan e la fluoxetina. Il test di campo aperto è comunemente utilizzato per valutare la funzione dell'apparato locomotore ed emotività in laboratorio animali29. In questo studio, esso era usato per analizzare i comportamenti depressivi. I risultati del test campo aperto ha mostrato che la distanza totale spostata dai topi nel gruppo modello era notevolmente inferiore a quello del gruppo di controllo. Inoltre, il numero di voci nella zona centrale del gruppo di modello di topi è stato notevolmente inferiore a quello del gruppo di trattamento dei topi, che ha suggerito che topi indotti CUMS visualizzato comportamenti simil-depressivi. Lo studio ha anche mostrato che Xiaoyaosan e fluoxetine potrebbe migliorare le modifiche presentate nella prova del aperto campo.
In accordo con i risultati simili discussi negli studi precedenti, questa carta ha mostrato che CUMS provoca una diminuzione nel consumo di saccarosio e attività locomotrice. L'utilizzo continuo di Xiaoyaosan era efficace per la prevenzione e il trattamento della depressione CUMS-indotta in topi. Molti studi hanno esaminato la depressione, una conoscenza avanzata di un modello animale potrebbe essere la chiave per chiarire il meccanismo di depressione30. Il metodo CUMS descritto nel presente protocollo efficacemente può visualizzare lo stato di depressione di topi. A differenza di sforzo delicato cronico (CMS) o immobilizzazione cronica stress (CIS) metodo31,32, il punto chiave di CUMS si trova nella selezione di imprevedibili fattori di stress e l'applicazione razionale di valutazione del modello. Per confermare ulteriormente il metodo e il risultato mostrato in questo protocollo, lavori futuri dovrebbero includere la selezione di ulteriori fattori di stress e metodi di valutazione per metodo CUMS e la rilevazione degli effetti a più lungo termine di Xiaoyaosan per 28-48 giorni di CUMS.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (n. 81630104; n. 81473597) e i fondi di ricerca fondamentali per le Università centrale (n. 2018-JYBZZ-XS005). Il protocollo e i risultati hanno dimostrati in questa carta proviene dall'articolo Coinvolgimento di normalizzato gliale fibrillare acida l'espressione della proteina negli ippocampi in effetti Antidepressant-Like di Xiaoyaosan sui topi cronicamente stressato dal Dr. Xiu-Fang Ding, et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chinese Herbs | Tongrentang (Bozhou, AnHui) Decoction Pieces Limited Company | - | The drugs were extracted by the Chinese medicine preparation room of the China-Japan Friendship Hospital, distilled water was used to prepare the suspension of Xiaoyaosan, and the dose was 0.25 g/kg/d. |
| Fluoxetine | PATHEON FRANCE | 5545A | The distilled water was used to prepare the suspension of fluoxetine, and the dose 2.6 mg/kg/d. |
| C57BL/6j mice | Beijing Vital River of the Charles River Company | SCXK 2011-0004 | 60 healthy male C57BL/6J mice aged 12 weeks were purchased from Beijing Vital River of the Charles River Company. |
| Mouse cage | Styling Biotechnology | 34853016 | 318×202×135 mm |
| Distilled Water | - | - | The water was used througout the experiment. |
| Sucrose | Sigma | - | The sucrose was used in the sucrose preference test to prepare 1% sucrose solution. |
| ACS-2EAS Electronic Balance | Beijing Hengzhongheng Electronic Technology Co., Ltd. | - | It was used to weigh the avoirdupois of mice at different stages. |
| Wooden Black Lusterless Box | - | - | (40 cm x 40 cm x 15 cm), divided into 25 equal squares by blue lines. |
| WV-CP470 Camera | Panasonic, Japan | - | A HD digital camera which was used for recording the whole process of the open field test. |
| Etho Vision 3.0 Software | Noldus, Wageningen, Holland | - | A video-tracking system which was used to evaluate the locomotor function and emotionality of mice. |
| SPSS Statistics 21.0 Software | IBM | - | SPSS 21.0 software was used to analyze the data, one-way ANOVA or non-parametric test was used for general data based on normality test and homogeneity test for variance, and LSD method was adopted for the comparisons between groups. |
| Graphpad Prism 6.0 Software | Graphpad Software,Inc.USA | - | Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs. |
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