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Developmental Biology

मानव Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से नैदानिक संगत Corneal अंग उपकला स्टेम कोशिकाओं के कुशल और स्केलेबल निर्देशित भेदभाव

Published: October 24, 2018 doi: 10.3791/58279
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल एक्सो-और फीडर सेल मुक्त संस्कृति की स्थिति के तहत मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से corneal अंग उपकला स्टेम कोशिकाओं में अंतर के लिए एक सरल दो कदम विधि का परिचय. कोशिका संस्कृति के तरीकों यहां प्रस्तुत लागत कुशल, नैदानिक गुणवत्ता कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन corneal सेल थेरेपी के उपयोग के लिए लागू है ।

Abstract

Corneal अंग उपकला स्टेम कोशिकाओं (LESCs) लगातार Corneal उपकला नवीकरण के लिए जिंमेदार हैं, और इस प्रकार Corneal homeostasis और दृश्य स्पष्टता को बनाए रखने. मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC)-व्युत्पंन LESCs corneal सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी के लिए एक होनहार सेल स्रोत प्रदान करते हैं । अपरिभाषित, xenogeneic संस्कृति और भेदभाव की स्थिति के कारण अनुसंधान के परिणामों में भिन्नता है और hPSC-व्युत्पन्न चिकित्सकीय के नैदानिक अनुवाद में बाधा. इस प्रोटोकॉल एक्सो-और फीडर सेल मुक्त शर्तों के तहत hPSC-LESC भेदभाव के लिए एक reproducible और कुशल विधि प्रदान करता है । सबसे पहले, रिकॉमबिनेंट laminin पर विभेदित hPSC की monolayer संस्कृति-५२१ (LN-५२१) और परिभाषित hPSC मध्यम अंतर के लिए उच्च गुणवत्ता शुरू सामग्री के मजबूत उत्पादन के लिए एक नींव के रूप में कार्य करता है । दूसरे, एक तेजी से और सरल hPSC-LESC भेदभाव विधि केवल 24 दिनों में LESC आबादी पैदावार । इस विधि छोटे अणुओं के साथ निलंबन में चार दिन की सतह ectodermal प्रेरण शामिल हैं, अनुयाई संस्कृति चरण के बाद LN-521/परिभाषित corneal उपकला विभेद माध्यम में कोलेजन IV संयोजन मैट्रिक्स. Cryostoring और विस्तारित भेदभाव आगे कोशिका आबादी को शुद्ध और सेल थेरेपी उत्पादों के लिए बड़ी मात्रा में कोशिकाओं की बैंकिंग सक्षम बनाता है । परिणामस्वरूप उच्च गुणवत्ता hPSC-LESCs corneal सतह पुनर्निर्माण के लिए एक संभावित उपंयास उपचार रणनीति के लिए अंग स्टेम सेल की कमी (LSCD) के इलाज प्रदान करते हैं ।

Introduction

नेत्र सतह पर पारदर्शी कॉर्निया रेटिना में प्रवेश करने के लिए प्रकाश की अनुमति देता है और आंख के अपवर्तन शक्ति के बहुमत प्रदान करता है । सबसे बाहरी परत, स्तरीकृत corneal उपकला, लगातार अंग उपकला स्टेम कोशिकाओं (LESCs) द्वारा पुनर्जीवित किया जाता है. LESCs corneoscleral जंक्शन1,2में अंग niches के बेसल परत में रहते हैं । LESCs कमी विशिष्ट और अद्वितीय मार्करों, तो उनकी पहचान ख्यात मार्करों का एक सेट का एक और अधिक व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता है । उपकला प्रतिलेखन कारक p63, और विशेष रूप से N-टर्मिनली p63 (ΔNp63α) के अल्फा isoform की प्रतिलिपि कटा हुआ, एक प्रासंगिक सकारात्मक LESC मार्कर3,4के रूप में प्रस्तावित किया गया है. LESCs के असममित विभाजन उन्हें स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी centripetally और पूर्वकाल में माइग्रेट कि संतान का उत्पादन. corneal सतह की ओर कोशिकाओं की प्रगति के रूप में वे धीरे से अपने उपजी खो देते हैं और अंत में टर्मिनली सतही स्क्वैमस कोशिकाओं है कि लगातार corneal सतह से खो रहे हैं करने के लिए अंतर.

corneal परतों में से किसी को नुकसान गंभीर दृश्य हानि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और corneal दोषों इस प्रकार दुनिया भर में दृष्टि नुकसान के प्रमुख कारणों में से एक हैं । (LSCD), limbus रोग या आघात के द्वारा नष्ट कर दिया है जो conjunctivalization और opacification corneal सतह और दृष्टि5,6के बाद के नुकसान की ओर जाता है । ऑटोलॉगस या allogeneic अंग भ्रष्टाचार का उपयोग सेल प्रतिस्थापन थेरेपी LSCD4,7,8,9के साथ रोगियों के लिए एक उपचार रणनीति प्रदान करता है । हालांकि, कटाई ऑटोलॉगस भ्रष्टाचार स्वस्थ आंखों के लिए जटिलताओं का खतरा भालू, और दाता ऊतक कम आपूर्ति में है । मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs), विशेष रूप से मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESCs) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs), corneal उपकला कोशिकाओं सहित नैदानिक प्रासंगिक कोशिका प्रकार के एक असीमित स्रोत के रूप में सेवा कर सकते हैं. इसलिए, hPSC-व्युत्पंन LESCs (hPSC-LESCs) नेत्र कोशिका प्रतिस्थापन थेरेपी के लिए एक आकर्षक नए सेल स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

परंपरागत रूप से, दोनों विभेदित hPSC संस्कृति विधियों और उनके विभेदक प्रोटोकॉल LESCs को अपरिभाषित फीडर कोशिकाओं, पशु सीरा, वातानुकूलित मीडिया, या एमनियोटिक झिल्ली के उपयोग पर भरोसा किया है10,11, 12 , 13 , 14 , 15. हाल ही में, सुरक्षित सेल थेरेपी उत्पादों की ओर प्रयास अधिक मानकीकृत और एक्सो मुक्त संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल के लिए खोज के लिए प्रेरित किया है । एक परिणाम के रूप में, कई परिभाषित और एक्सो-विभेदित hPSCs के दीर्घकालिक संस्कृति के लिए मुक्त तरीके अब व्यावसायिक रूप से16,17,18उपलब्ध हैं । एक सातत्य के रूप में, विभेदक आणविक cues पर निर्भर प्रोटोकॉल का निर्देशन करने के लिए corneal उपकला भाग्य hPSCs गाइड हाल ही में पेश किया गया है19,20,21,22, 23. अभी तक इन प्रोटोकॉल के कई या तो अपरिभाषित, फीडर शुरू सामग्री, या जटिल, xenogeneic भिंनता के लिए विकास कारक कॉकटेल के रूप में hPSCs आधारित इस्तेमाल किया ।

इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए एक मजबूत, अनुकूलित, एक्सो और फीडर मुक्त hPSC संस्कृति विधि और corneal LESCs के बाद भेदभाव प्रदान करना है । Monolayer संस्कृति pluripotent hPSCs पर laminin-५२१ (LN-५२१) मैट्रिक्स में परिभाषित, एल्ब्युमिन-मुक्त hPSC मध्यम (विशेष रूप से आवश्यक 8 फ्लेक्स) भेदभाव के लिए सजातीय शुरू सामग्री के तेजी से उत्पादन की अनुमति देता है । इसके बाद एक सरल, दो कदम अंतर रणनीति गाइड निलंबन में सतह ectodermal भाग्य की ओर hPSCs, LESCs को अनुयाई भेदभाव के बाद । एक सेल जनसंख्या जहां > ६५% एक्सप्रेस ΔNp63α 24 दिनों के भीतर प्राप्त की है । एक्सो-और फीडर मुक्त प्रोटोकॉल कई hPSC लाइनों के साथ परीक्षण किया गया है (दोनों hESCs और hiPSCs), सेल लाइन विशिष्ट अनुकूलन के लिए किसी भी आवश्यकता के बिना । सप्ताहांत के लिए प्रोटोकॉल मुक्त रखरखाव, passaging, cryostoring और hPSC-LESC phenotyping यहां वर्णित नैदानिक या अनुसंधान प्रयोजनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले LESCs के बड़े बैचों का उत्पादन सक्षम करें ।

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Protocol

यूनिवर्सिटी ऑफ हेरा फेरी मानव भ्रूण पर अनुसंधान करने के लिए नेशनल अथॉरिटी फॉर Medicolegal अफेयर्स फिनलैंड (Dnro 1426/32/300/05) की मंजूरी है । इस संस्थान में Pirkanmaa अस्पताल जिला की नैतिक समिति का भी सहायक कथन है जो आमलोगों, संस्कृति और अंतर hESC रेखाओं (Skottman/R05116) और hiPSC अनुसंधान (नेत्र/Skottman) में R14023 रेखाओं का उपयोग करने के लिए है । इस अध्ययन के लिए कोई नई कक्ष रेखाएं प्राप्त नहीं हुईं ।

नोट: प्रोटोकॉल वर्णित विशिष्ट, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध hPSC और corneal उपकला भेदभाव मीडिया पर आधारित है । निर्माता/सप्लायर की जानकारी और कैटलॉग नंबर के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

1. एक्सो की स्थापना-और फीडर-मुक्त hPSC संस्कृति

  1. तैयारी
    1. कोट 24-मानव रिकॉमबिनेंट laminin-५२१ (LN-५२१) के साथ अच्छी तरह से प्लेटें । पहली फीडर मुक्त (एफएफ) बीतने के लिए, का उपयोग करें LN-५२१ १.०९ µ g/cm2, और ०.५५ µ g/cm2 की एकाग्रता में निंनलिखित अंश के लिए । का सुझाव दिया LN-५२१ सांद्रता सफल एफएफ संस्कृति के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा, लेकिन कम किया जा सकता है ।
      1. गल LN-५२१ शीशी धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर के रूप में निर्माता द्वारा निर्देश दिया ।
        नोट: उचित रूप से संभाला LN-५२१ समाधान गल के बाद 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
      2. कोटिंग समाधान तैयार करने के लिए, LN-५२१ स्टॉक समाधान की उचित मात्रा 1x Dulbecco के फॉस्फेट के साथ-बफर खारा (DPBS) सीए2 युक्त + और मिलीग्राम2 + ३०० µ एल की कुल मात्रा के प्रति अच्छी तरह से पतला ।
      3. कुओं के लिए कोटिंग समाधान प्लास्टिक, parafilm के साथ अच्छी तरह से थाली सील, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी । लेपित प्लेटों 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
        (वैकल्पिक): वैकल्पिक रूप से, एक तेजी से कोटिंग प्रोटोकॉल के लिए, ३७ ° c, 5% CO2पर 2 h के लिए कोटिंग समाधान के साथ अच्छी तरह से प्लेटें ।
    2. hPSC संस्कृति मध्यम (विशेष रूप से आवश्यक 8 फ्लेक्स) प्रदान की पूरक के साथ बेसल माध्यम पूरक द्वारा तैयार, के रूप में निर्माता द्वारा निर्देश दिया । ५० U/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin जोड़ें । ध्यान दें कि निर्माण प्रकाश और उच्च तापमान के प्रति संवेदनशील है । पूरक गल और कमरे के तापमान (आरटी), प्रकाश से सुरक्षित पर मीडिया गर्म । पूरकता की तारीख से दो सप्ताह के भीतर पूरक hPSC माध्यम का प्रयोग करें ।
  2. LN-५२१ पर एफएफ संस्कृति को hPSC स्थानांतरण
    1. पूर्व गर्म सभी आवश्यक सामग्री और reagent प्रवाह हूड में आरटी के लिए रिएजेंटों ।
    2. फीडर परतों पर मानक संस्कृति प्रणाली से पारित hPSCs (उदाहरण के लिए निष्क्रिय मानव चमड़ी (hFF) या माउस भ्रूण fibroblasts), या अंय एफएफ संस्कृति मानक पद्धति का उपयोग कर प्रणाली । उदाहरण के लिए, hPSC hFF फीडर कोशिकाओं पर प्रसंस्कृत कालोनियों एक स्केलपेल और टुकड़े तो एक सुई टिप के साथ अलग से छोटे टुकड़ों को विच्छेदित किया जा सकता है । मानव एफएफ संस्कृति प्रणालियों का उपयोग पीएससी संस्कृति के साथ या पूर्व एंजाइम उपचार के बिना क्लस्टर passaging विधि का उपयोग कर स्थानांतरित किया जा सकता है ।
    3. 24 कुओं से LN-५२१ कोटिंग समाधान निकालें और अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म hPSC मध्यम जोड़ें ।
      नोट: कुओं के रूप में शुष्क करने की अनुमति नहीं है LN-५२१ सुखाने पर निष्क्रिय हो जाएगा ।
    4. एक पिपेट के साथ hPSC मध्यम में LN-५२१ लेपित 24 कुओं के लिए कॉलोनी टुकड़ों/ स्थानांतरण 20-30 प्रति कॉलोनी टुकड़े ठीक है, भीड़ से बचने के कुओं ।
    5. hPSC मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ मध्यम बदलें दिन के बाद स्थानांतरण और उसके बाद हर दूसरे दिन । संस्कृतियों passaging 3 के लिए तैयार कर रहे है-4 दिन बाद के रूप में hPSCs बाहर चिकनी, भेद आकृति विज्ञान के साथ कालोनियों के लिए बड़े हो गए हैं । संदर्भ के लिए, चित्र 1b (प्रथम छवि) देखें । पहले एफएफ बीतने के लिए, कालोनियों के लिए एक पूरी तरह से धाराप्रवाह monolayer बढ़ने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए, लेकिन संस्कृतियों जब कालोनियों 1 मिमी के एक अनुमानित आकार तक पहुंच जाना चाहिए ।
  3. Passaging और एफएफ hPSC संस्कृति का रखरखाव
    1. पूर्व गर्म सभी आवश्यक सामग्री और reagent प्रवाह हूड में आरटी के लिए रिएजेंटों ।
    2. दूसरी एफएफ बीतने के बाद से, यात्रा एफएफ hPSCs जब संस्कृति 80-100% प्रवाह तक पहुंच गया है । मार्ग एफएफ hPSCs के लिए नई LN-५२१ लेपित 24-अच्छी तरह से एक सेल passaging दो बार एक सप्ताह का उपयोग कर प्लेटें (सोमवार और गुरुवार को) को विभेदक आकृति विज्ञान के साथ उच्च गुणवत्ता संस्कृतियों को बनाए रखने और सप्ताहांत मुक्त खिला आहार प्राप्त करने के लिए । विवरण के लिए, कृपया18,24,25को देखें ।
      1. एक बार 2 सीए के बिना 1x DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ एफएफ hPSCs कुल्ला+ और2 मिलीग्राम +।
      2. एक्सो के साथ अलग एफएफ hPSCs-नि: शुल्क trypsin-EDTA (विशेष रूप से TrypLE का चयन करें एंजाइम) ३७ ° c, 5% सह2पर ५०० µ एल के प्रति अच्छी तरह से मशीन द्वारा । इष्टतम मशीन समय के लिए, कोशिकाओं को गोल करने के लिए नहीं बल्कि अलग करने की अनुमति दें । यह आमतौर पर ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 में 3 मिनट लगते है (5 मिनट से अधिक नहीं है) ।
      3. एक्सो मुक्त trypsin-EDTA निकालें और तुरंत परिभाषित trypsin अवरोध करनेवाला के प्रति अच्छी तरह से ५०० µ एल जोड़ें ।
      4. अलग एफएफ hPSCs द्वारा सावधान, अभी तक गहन pipetting एक ही सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए । एक ४० µm सेल छलनी के माध्यम से एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब पूर्व गर्म hPSC माध्यम युक्त में एफएफ hPSC निलंबन स्थानांतरण ।
      5. hPSC मीडियम की 1 मिलीलीटर के साथ कुओं को धो लें और 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब पर वाशिंग मीडियम जोड़ें ।
      6. ३०० x जी में 5 मिनट के लिए एकल सेल निलंबन केंद्रापसारक, महाप्राण सेल गोली, और 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म hPSC मध्यम में resuspend ।
      7. hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं गिनती ।
      8. LN-५२१ कोटिंग समाधान (०.५५ µ g/cm2) 24-कुओं से निकालें और hPSC माध्यम के रूप में 1.2.3 में जोड़ें ।
      9. प्लेट एफएफ hPSCs पर ०.५५ µ g/cm2 LN-५२१ लेपित 24-कुओं का एक सेल घनत्व पर ४०,००० – ५०,००० कोशिकाओं/
      10. मध्यम ताजा hPSC माध्यम के साथ बदलें passaging के बाद दिन, और हर दूसरे दिन के बाद रविवार को छोड़कर ।
    3. कोशिकाओं passaging के बाद विभेद 3-4 दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार हैं, जब संस्कृति तक पहुंच गया है > 85% प्रवाह । hPSCs की उच्च गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, पिछले काम करता है में विस्तार से वर्णित लक्षण वर्णन विधियों को देखें18,24,25। यह केवल संस्कृति hPSCs अप करने के लिए सिफारिश की है एफएफ प्रणाली में 15 स्तर तक एकल कोशिका passaging का उपयोग करने के लिए karyotypic परिवर्तन से बचें । केवल उच्च गुणवत्ता, भेदभाव के लिए शुरू सामग्री के रूप में विभेदित hPSCs का उपयोग करें ।

2. निर्देशित विभेद और hPSC की Cryopreservation-व्युत्पन्न LESCs

  1. तैयारी
    1. तैयार एक्सो-मुक्त बेसल प्रेरण मध्यम (बेसल प्रेरण माध्यम): पूरक है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (विशेष रूप से नॉकआउट DMEM) के साथ 15% एक्सो-मुक्त सीरम प्रतिस्थापन (spesifically सीटीएस पीटकर SR XenoFree), 2 मिमी L-glutamine, ०.१ मिमी 2- mercaptoethanol, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, और ५० U/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin । दो सप्ताह के भीतर बेसल प्रेरण माध्यम का प्रयोग करें ।
    2. सस्पेंशन कल्चर में corneal इंडक्शन के लिए मीडिया तैयार करें ।
      1. 1 दिन: अनुपूरक 5 माइक्रोन blebbistatin के साथ बेसल प्रेरण मध्यम ।
      2. 2 दिन: पूरक बेसल प्रेरण मध्यम के साथ 10 µ एम SB-५०५१२४ और ५० एनजी/एमएल मानव बुनियादी fibroblast विकास फैक्टर (bFGF) ।
      3. दिन 3-4: पूरक बेसल प्रेरण मध्यम के साथ 25 एनजी/एमएल बोन morphogenetic प्रोटीन 4 (BMP-4) ।
    3. अनुयाई संस्कृति के लिए corneal उपकला विभेद माध्यम (भेदभाव मध्यम, विशेष रूप से सीएनटी-30) तैयार: निर्माता के निर्देशों के अनुसार बेसल मध्यम करने के लिए पूरक जोड़ें और ५० U/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin जोड़ें ।
      नोट: विभेदक मध्यम निर्माण प्रकाश के प्रति संवेदनशील है । पूरकता की तारीख के 6 सप्ताह के भीतर पूरक भेदभाव मध्यम का उपयोग करें ।
    4. कोट १०० मिमी ऊतक संस्कृति व्यंजन अनुयाई विभेदन के लिए (२.३ चरण देखें) 5 µ g/cm2 मानव अपरा कोलेजन प्रकार iv (कर्नल IV) और ०.५ µ g/cm2 LN-५२१ के मिश्रण के साथ 2 सीए युक्त DPBS में पतला+ और मिलीग्राम2 +, कुल में डिश प्रति 5 मिलीलीटर की कोटिंग मात्रा । तैयार और 1.1.1.3 में वर्णित के रूप में कर्नल IV और LN-५२१ के साथ कोटिंग्स की दुकान ।
  2. मैं कदम: Corneal प्रेरण निलंबन संस्कृति में
    1. पूर्व गर्म सभी आवश्यक सामग्री और reagent प्रवाह हूड में आरटी के लिए रिएजेंटों ।
    2. अलग एफएफ hPSCs एक्सो के साथ एकल सेल निलंबन के लिए-मुक्त trypsin-EDTA कदम में निर्देश के रूप में 1.3.2.1 – 1.3.2.6 । कोशिकाओं गिनती, और वितरित 2-3x106 कम अनुलग्नक प्रति कोशिकाओं 6-अच्छी तरह से प्लेट अच्छी तरह से, बेसल प्रेरण के 3 मिलीलीटर के कुल मात्रा में 5 माइक्रोन blebbistatin के साथ पूरक के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात EB गठन प्रेरित करने के लिए, 5% सह2 (दिन 1).
    3. अगले दिन (2 दिन), मध्यम निकालें और बेसल प्रेरण 10 µ एम SB-५०५१२४ और ५० एनजी/एमएल bFGF के साथ पूरक की 3 मिलीलीटर के साथ बदलें ।
    4. निम्नलिखित दो दिनों (दिन 3 – 4) पर, मध्यम निकालें और बेसल प्रेरण 25 एनजी/एमएल बीएमपी-4 के साथ पूरक की 3 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें ।
  3. द्वितीय चरण: अनुयाई संस्कृति में Corneal विभेद
    1. पूर्व गर्म सभी आवश्यक सामग्री और reagent प्रवाह हूड में आरटी के लिए रिएजेंटों ।
    2. 5 दिन, प्लेट पर EBs नीचे १०० mm टिशू कल्चर 5 µ g/cm2 कर्नल IV और ०.५ µ g/cm2 LN-५२१ के साथ लेपित व्यंजन पर नीचे ।
      1. १०० mm ऊतक संस्कृति व्यंजन से कोटिंग समाधान निकालें और पकवान प्रति पूर्व गर्म भेदभाव मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
        नोट: पकवान के रूप में LN-५२१ सुखाने पर निष्क्रिय हो जाएगा शुष्क करने की अनुमति नहीं है ।
      2. EBs एक 6 अच्छी तरह से थाली से दो ३ १०० mm ऊतक संस्कृति व्यंजन (लगभग ५० EBs प्रति सेमी2) pipetting द्वारा स्थानांतरण । EBs समान रूप से कोमल मिलाते हुए वितरित करें ।
    3. ३७ ° c, 5% CO2पर अनुयाई संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखने, ताजा भेदभाव मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ मध्यम की जगह तीन बार प्रति सप्ताह (सोमवार, बुधवार और शुक्रवार) के लिए अगले 2.5-3 सप्ताह के लिए । चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग सही उपकला आकृति के उद्भव के लिए नियमित रूप से कोशिकाओं की जाँच करें.
  4. तृतीय चरण: क्रायो-बैंकिंग hPSC-व्युत्पंन LESCs
    1. पूर्व ठंडा किया जाना चाहिए कि cryopreservation माध्यम के लिए छोड़कर लामिना प्रवाह हुड में आरटी करने के लिए सभी आवश्यक सामग्री और रिएजेंटों के लिए पहले से गर्म ।
    2. अलग hPSC-एक्सो-नि: शुल्क trypsin-EDTA के साथ LESCs व्युत्पंन और कोशिकाओं गिनती, के रूप में hPSCs कदम 1.3.2.1 में एफएफ के लिए निर्देश-1.3.2.6, लेकिन भेदभाव मध्यम का उपयोग कर ।
      नोट: के लिए hPSC-व्युत्पंन LESCs, एक्सो के साथ इष्टतम समय-मुक्त trypsin-EDTA अब (के बारे में 5 मिनट) है । १०० mm डिश प्रति एक्सो-फ्री trypsin-EDTA और परिभाषित trypsin अवरोधक के 3 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    3. कोशिकाओं की गिनती के बाद, 5 मिनट के लिए दोहराने केंद्रापसारक ३०० x जी, महाप्राण मध्यम और पूर्व में सेल गोली फिर से स्थगित-ठंडा, एक्सो मुक्त hPSC cryopreservation मध्यम । cryotubes में सिंगल सेल सस्पेंशन को प्लास्टिक ताकि प्रत्येक cryotube में 1 एमएल cryopreservation मीडियम में ०.५ से 1 x 106 सेल शामिल हों ।
    4. एक ठंड कंटेनर में ट्यूबों प्लेस और तुरंत हस्तांतरण (5 मिनट के भीतर) के लिए-८० ° c रातोंरात ।
    5. अगले दिन, ट्यूबों लंबे समय तक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरण ।
  5. चतुर्थ चरण: गल द cryopreserved hPSC-LESCs
    1. गल से पहले, कोट पकवान/5 µ g/cm2 स्तंभ IV और ०.५ µ g/cm2 LN-५२१ के साथ प्लेटें/
    2. पूर्व गर्म सभी आवश्यक सामग्री और reagent प्रवाह हूड में आरटी के लिए रिएजेंटों ।
    3. बर्तन/कुओं से कोटिंग समाधान निकालें और पूर्व गर्म भेदभाव मध्यम के उचित मात्रा में जोड़ें ।
      नोट: पकवान के रूप में LN-५२१ सुखाने पर निष्क्रिय हो जाएगा शुष्क करने की अनुमति नहीं है ।
    4. जल्दी आरटी पर कोशिकाओं गल और तुरंत एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब पूर्व गर्म भेदभाव मध्यम के 5 मिलीलीटर युक्त करने के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण ।
    5. ३०० x जी, महाप्राण में 5 मिनट के लिए सेल निलंबन केंद्रापसारक, और अंतर मध्यम में गोली resuspend किसी भी cryopreservation माध्यम को दूर ।
    6. थाली बर्तन पर कोशिकाओं/5 µ g/cm2 स्तंभ IV और ०.५ µ g/cm2 LN-५२१ के साथ लेपित, विभेदक मध्यम में ४०,०००-५०,००० कोशिकाओं के घनत्व पर/ ३७ ° c, 5% सह2पर कोशिकाओं को बनाए रखने, अंतर मध्यम तीन बार एक सप्ताह की जगह ।

3. Phenotyping की hPSC-व्युत्पन्न LESCs

  1. गुणात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण
    1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए, कोट 24-या 12-अच्छी तरह से प्लेट कुओं के साथ 5 µ g/cm2 कर्नल IV और ०.५ µ g/cm2 LN-५२१ और प्लेट/गल hPSC-LESCs विभेद माध्यम में ४० 000 के घनत्व पर-50 000 कोशिकाओं/
    2. जब संस्कृतियों के प्रवाह तक पहुंच चुके हैं, 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक: 2 Ca के बिना 1x DPBS के साथ दो बार धोने+ और2 मिलीग्राम +और 4% पीएफए के साथ आर टी में 15-20 मिनट की मशीन । इसके बाद, किसी भी पीएफए अवशेषों को दूर करने के लिए 1x DPBS के साथ दो बार धोएं । प्रति अच्छी तरह से समाधान का 0.5-1 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
      नोट: फिक्स्ड कोशिकाओं को धुंधला करने से पहले एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x DPBS में संग्रहित किया जा सकता है ।
      चेतावनी: पीएफए विषाक्त और संक्षारक है । एक धुएं डाकू में पीएफए संभाल और सुरक्षात्मक कपड़े पहनते हैं, नेत्र संरक्षण, और दस्ताने ।
    3. 1x DPBS में ०.१% ट्राइटन X-१०० के साथ 10-15 मिनट के लिए महाप्राण 1x DPBS और permeabilize सेल झिल्ली ।
    4. महाप्राण ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० और खंड पर 1x BSA में 3% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (DPBS) के साथ 1 एच के लिए मशीन द्वारा गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बंधन साइटों को एंटीबॉडी 1x में ०.५% BSA में प्राथमिक DPBS कमजोरियां तैयार करें ।
      नोट: अनुशंसित प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए 1 तालिका देखें.
    5. महाप्राण 3% BSA और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात उचित पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन ।
    6. 1x DPBS के साथ 5 मिनट के लिए 3x धो लें । 1x DPBS में ०.५% BSA में द्वितीयक एंटीबॉडी कमजोरियां तैयार करें ।
      नोट: अनुशंसित द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए तालिका 1 देखें.
    7. महाप्राण 1x DPBS और उपयुक्त, उचित रूप से पतला 1 ज के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी, प्रकाश से रक्षा के साथ गर्मी ।
      नोट: पर इस कदम से, प्रकाश से संरक्षित नमूनों रखने के क्रम में फ्लोरोसेंट रंगों की लुप्त होती को रोकने के लिए.
    8. 1x DPBS के साथ 5 मिनट के लिए 3x धो लें और अंत में 4 ', 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) और प्रतिदीप्ति बढ़ते मीडिया के साथ माउंट के साथ counterstain नाभिक । DAPI निर्माता के निर्देशों के अनुसार अलग से इस्तेमाल किया जा सकता है या बढ़ते माध्यम में शामिल थे । प्लेस गोल coverslips (व्यास 19 मिमी और 12 के लिए 13 मिमी-और 24 अच्छी तरह से प्लेटें, क्रमशः) प्रत्येक अच्छी तरह से में. माउंटेड नमूनों के सूखने और भंडारण के संबंध में निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
    9. छवि एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ सना हुआ कोशिकाओं ।
  2. मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण
    1. वस्तु चश्मे पर hPSC-व्युत्पन्न LESCs के cytospin नमूने तैयार करें.
      1. एक्सो-free trypsin-EDTA के साथ hPSC-व्युत्पन्न LESCs को अलग करें और चरण 2.4.2 में निर्देश के अनुसार कक्षों को गिनने दें.
      2. गिनती के बाद, पूर्व ठंडा 1x DPBS जोड़ें और 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर ३०० x g । दिए गए cytocentrifuge के निर्माता के निर्देशों के अनुसार नमूना मात्रा और कोशिका एकाग्रता को समायोजित करें, जैसे ५०,००० – १००,००० कोशिकाओं का एक नमूना मात्रा में १५० µ l
      3. कोशिकाओं को नीचे स्पिन एक cytocentrifuge उदाहरण के साथ वस्तु चश्मे के लिए 28 x जी में 5 मिनट और 15-20 मिनट के लिए तुरंत तय पर 1x DPBS में 4% पीएफए के साथ RT पर । अनुशंसित कताई समय और गति के लिए, दिए गए cytocentrifuge के निर्देश पुस्तिका का संदर्भ लें ।
    2. कदम 3.1.3 में वर्णित के रूप में cytospin नमूने धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें – 3.1.8 तरल अवरोधक पेन का उपयोग करने के लिए एक hydrophobic सर्कल के साथ नमूनों के चारों ओर और किफायती अभ्यास के लिए एक छोटी बूंद में दाग आचरण । बहाकर स्लाइड धारकों के साथ कंटेनरों में प्रदर्शन किया जा सकता है, ताकि अतिरिक्त एंटीबॉडी और ंयूनतम पृष्ठभूमि धुंधला के कुशल हटाने को सुनिश्चित करने के लिए । DAPI के साथ Counterstain नाभिक और प्रतिदीप्ति बढ़ते मीडिया के साथ दाग नमूने माउंट, coverslips के साथ कवर । माउंटेड नमूनों के सूखने और भंडारण के संबंध में निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
    3. पर कब्जा 5-बेतरतीब ढंग से चयनित एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के 10x इज़ाफ़ा उदा का उपयोग स्थानों से नमूना प्रति 10 छवियों ।
    4. कुल (DAPI पॉजिटिव) कोशिकाओं के संबंध में सकारात्मक रूप से सना हुआ कोशिकाओं के प्रतिशत का अनुमान, ImageJ छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर (https://imagej.nih.gov/ij/) उपकरण के साथ उदा । अधिमानतः विश्लेषण > 500 नमूने प्रति कोशिकाओं ।
      1. ImageJ सॉफ्टवेयर में विश्लेषण किया जा करने के लिए छवि खोलें । छवि और डिफ़ॉल्ट गाऊसी कलंक के साथ फिल्टर डुप्लिकेट शोर को दूर करने के लिए ।
      2. एक थ्रेशोल्ड बनाएं । थ्रेशोल्ड मानों को धनात्मक रूप से सना हुआ कक्ष नाभिक के इष्टतम चयन पर समायोजित करें और लागू करें. डुप्लिकेट की गई छवि अब बाइनरी दृश्य में कनवर्ट हो जाती है ।
      3. द्विआधारी प्रसंस्करण उपकरण "भरने छेद" और "वाटरशेड", जो स्वचालित रूप से एक नाभिक का प्रतिनिधित्व विलय क्षेत्रों अलग होगा के साथ द्विआधारी छवि प्रक्रिया ।
      4. आदेश लागू करने पर खुलेगा जो रॉय प्रबंधक विंडो के लिए हितों (ROIs) के क्षेत्रों की सूची स्वचालित रूप से "विश्लेषण कण" उपकरण का उपयोग करें । बाइनरी छवि को बंद करें ।
      5. रॉय प्रबंधक में "Show all" चुनकर मूल छवि में ROIs को विज़ुअलाइज़ करना. सना हुआ कक्ष नाभिक के सही चयन की पुष्टि करें, और यदि आवश्यक हो, मैंयुअल रूप से निकालें और व्यक्तिगत चयन जोड़ें ।
  3. प्रवाह cytometry विश्लेषण
    1. p63α अभिव्यक्ति स्तर की पुष्टि करने के लिए, प्रवाह cytometry के लिए कक्षों को दाग ।
      1. एक्सो-free trypsin-EDTA के साथ hPSC-व्युत्पन्न LESCs को अलग करें और चरण 2.4.2 में निर्देश के अनुसार कक्षों को गिनने दें.
      2. 1 मिलीलीटर पूर्व ठंडा 1x DPBS के साथ दो बार कोशिकाओं को धो और ३०० x g. Fix और 4 ° c पर 20 मिनट के लिए तैयार करने के लिए उपयोग निर्धारण/permeabilization समाधान के साथ permeabilize पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । तदुपरांत 1 मिलीलीटर पूर्व ठंडा 1x permeabilizing वॉश बफर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
        नोट: इस कदम से, 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर कोशिकाओं रखें, जब तक अंयथा संकेत दिया ।
      3. चेतावनी: निर्धारण/permeabilization समाधान ४.२% formaldehyde शामिल हैं । एक धुएं डाकू में खतरनाक समाधान संभाल और सुरक्षात्मक कपड़े, नेत्र संरक्षण, और दस्ताने पहनते हैं ।
      4. 5 मिलीलीटर के ट्यूबों में नमूनों को विभाजित । प्रत्येक नमूना 100000-200000 कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए और नमूना मात्रा 1x धोने बफर के लगभग १०० µ एल करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ।
      5. fluorochrome संयुग्मित p63-α FACS एंटीबॉडी के 2 µ एल जोड़ें (अनुशंसित एंटीबॉडी के लिए, उपकरण और सामग्री की तालिका देखें) नमूना ट्यूबों में । एक नमूना नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए दाग छोड़ दें । भंवर नमूने और आरटी पर 1 एच के लिए मशीन, प्रकाश से रक्षा की ।
      6. दो बार पहले से 1 मिलीलीटर-ठंडा 1x धोने बफर के साथ कोशिकाओं को धोने और अंत में, बफर के ३०० µ एल के साथ छर्रों resuspend । बर्फ पर ट्यूबों की दुकान, प्रकाश से सुरक्षित ।
    2. एक प्रवाह cytometer के साथ नमूनों का विश्लेषण । सही सेल जनसंख्या के गेटिंग के लिए दाग नकारात्मक नियंत्रण नमूना का प्रयोग करें, और फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि संकेत को छोड़कर के लिए । १०,००० p63-α-सना हुआ कोशिकाओं की एक ंयूनतम विश्लेषण । विस्तृत तकनीकी कार्यांवयन के लिए, कृपया दिए गए प्रवाह cytometer के उपयोगकर्ता मैनुअल को देखें ।

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Representative Results

hPSCs से hPSC-LESCs

cryostoring hPSC के लिए एफएफ hPSCs के भेदभाव उत्प्रेरण से पूरी प्रक्रिया-LESCs ३.५ सप्ताह के आसपास लेता है । इसके प्रमुख कदम पर प्रकाश डाला भेदभाव विधि का योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्र 1aमें प्रस्तुत किया है । चित्रा 1b प्रोटोकॉल के विभिंन चरणों में कोशिका आबादी के ठेठ morphologies से पता चलता है । प्रस्तुत डेटा Regea08/017 hESC लाइन और उता. 04607. WT hiPSC रेखा, दोनों व्युत्पंन और हेरा फेरी, फिनलैंड, पहले26,27,28के रूप में वर्णित विश्वविद्यालय में विशेषता के साथ प्राप्त कर रहे हैं ।

LN-५२१ पर hPSC माध्यम में, विभेदित, उच्च गुणवत्ता एफएफ hPSCs पहले तेज किनारों के साथ अलग कालोनियों फार्म, जो संगम पर सजातीय monolayers को विलय (आंकड़ा 1b, पहली छवि) । कई व्यक्तिगत व्युत्पंन और आनुवंशिक रूप से अलग hESC और hiPSC लाइनें सफलतापूर्वक अनुकूलित और इस प्रणाली के साथ संस्कृति थे । एफएफ hPSC आबादी लगभग गुणा 3-प्रत्येक मार्ग के भीतर गुना, मजबूत साधन प्रदान करने के लिए एक्सो उत्पंन-और फीडर मुफ्त25भेदभाव के लिए सामग्री शुरू । EB माध्यम में 24 एच प्रेरण आम तौर पर तंग, अलग आकार (आंकड़ा 1b, दूसरी छवि) के नियमित EBs के निलंबन का उत्पादन । (2 दिन-4) निलंबन में सतह ectodermal प्रेरण के दौरान, EB आकृति विज्ञान नाटकीय रूप से परिवर्तन नहीं होना चाहिए । औपनिवेशिक विकास के बाद जल्द ही प्रकट होता है EBs पर चढ़ाया जाता है कर्नल IV/LN-521 संयोजन में अंतर मध्यम (आंकड़ा 1b, तीसरे और चौथे चित्र), और के भीतर 21 – 25 विभेद के दिन कोशिकाओं के रूप में धाराप्रवाह सजातीय परतों के साथ उपकला कोशिकाओं (आंकड़ा 1b, पांचवीं छवि) के लिए विशिष्ट बहुभुज आकृति विज्ञान. बाद में उपयोग के लिए कक्षों को cryostored किया जा सकता है । व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान अच्छी तरह से hPSC-LESCs (आंकड़ा 1b, पिछले छवि) गल के बाद संरक्षित कर रहे हैं ।

आमतौर पर, 3 x 106 एफएफ hPSCs एक 6 के लिए मढ़वाया अच्छी तरह से प्लेट उपज पर्याप्त EBs 2 में अनुयाई संस्कृति के लिए चढ़ाया जा करने के लिए-3 सेल संस्कृति व्यंजन (१०० mm) । प्रत्येक १०० mm डिश से, 1 से १.५ x 106 कोशिकाओं cryobanking के लिए दिन 22 से काटा जा सकता है-भेदभाव के 25 । औसत पर, प्रत्येक अंतर एफएफ hPSC 25 दिन (चित्रा 2) द्वारा ०.७ कोशिकाओं को उत्पंन करता है ।

hPSC-व्युत्पन्न LESCs का सत्यापन

विशिष्ट LESC मार्कर प्रोटीन के अभाव में, सही कोशिका phenotype मार्करों का एक सेट है कि pluripotency जुड़े प्रोटीन और स्वीकार LESC मार्करों की अभिव्यक्ति में वृद्धि की अभिव्यक्ति में कमी का प्रदर्शन के साथ की पुष्टि की है । भिंनता के दिन 24 में, hPSC के विशाल बहुमत-LESCs एक्सप्रेस युग्मित बॉक्स प्रोटीन PAX6 (PAX6), आंख के विकास के प्रमुख नियामक, साथ ही साथ p63α, व्यापक रूप से मांयता प्राप्त LESC मार्कर । कटा हुआ p63-isoform ΔNp63 p63α पॉजिटिव कोशिकाओं के अधिकांश में सह-व्यक्त की है, सबसे कॉर्निया विशेष ΔNp63α-सकारात्मक सेल phenotype की पुष्टि । बेसल उपकला मार्करों और ख्यात LESC मार्करों cytokeratin (ck)-15 और ck-14 भाग में व्यक्त कर रहे हैं, जबकि pluripotent स्टेम सेल मार्कर OCT3/4 और परिपक्व corneal उपकला मार्कर CK-12 इस बिंदु पर undetect हैं. यह unipotent अंग उपकला progenitors की ओर एफएफ hPSCs के भेदभाव को इंगित करता है, लेकिन अभी तक नहीं परिपक्व corneal उपकला कोशिकाओं में टर्मिनल भेदभाव. (चित्र 3ए) hPSC-LESCs सफलतापूर्वक cryostorage से वसूली के बाद अपने phenotype बनाए रखने ( आंकड़ा 3ए के लिए तुलनीय डेटा) ।

भेदभाव के 24 दिनों के बाद, ΔNp63 ६६.२% (n = 33, Regea08/017 hESC-LESCs के एसडी ९.३%) में व्यक्त किया गया था, और ६५.७% में (n = 10, एसडी ४.१%) उता. 04607. WT hiPSC-LESCs (quantified नमूनों से cytospin, चित्र बी. ए.). cryostorage से वसूली के बाद, ८२.२% (n = 10, hESC के एसडी ५.७%)-LESCs और ९०.५% (एन = 10, एसडी = 3.7%) of hiPSC-LESCs व्यक्त ΔNp63 (अच्छी तरह से प्लेटों से quantified दिन पर 26-28, चित्र बी) ।

p63α अभिव्यक्ति आगे Regea08/017 hESC-LESCs के लिए प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ की पुष्टि की थी । अंतर के 25 दिन में, हौसले से विभेदित hPSC-LESCs के ६२% p63α के लिए सकारात्मक थे । दो दिन cryostorage से वसूली के बाद (कुल 28 दिन), कोशिकाओं के ८१% थे p63α पॉजिटिव (आंकड़ा 3सी) ।

Figure 1
चित्रा 1: hPSC के योजनाबद्ध चित्रण-LESC भेदभाव प्रोटोकॉल (ए) और विशिष्ट कोशिका morphologies प्रक्रिया (ख) के विभिंन चरणों में मनाया । EBs उच्च गुणवत्ता के एक एकल सेल निलंबन से गठित कर रहे हैं, पहले 24 घंटे के दौरान विभेदित hPSCs तीन दिन छोटे अणु प्रेरण निलंबन में सतह बाह्य त्वक स्तर की ओर अनुयाई विभेद चरण के बाद किया जाता है । भेदभाव के 24 दिन तक, कोशिकाओं के बहुमत विशिष्ट LESC की तरह आकृति विज्ञान दिखाते हैं । प्रतिनिधि छवियों से पहले और भेदभाव के दौरान Regea08/017 hESC लाइन के लिए दिखाया गया है । ब्लैक स्केल बार = २०० µm, पैनल में सभी छवियों के लिए मांय । संक्षिप्त नाम: Blebb.: blebbistatin, sb: sb-५०५१२४ छोटे अणु अवरोध करनेवाला, bFGF: बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक, BMP-4: अस्थि morphogenetic प्रोटीन 4, LN-५२१: मानव रिकॉमबिनेंट laminin ५२१, कर्नल IV: मानव अपरा कोलेजन प्रकार iv, hPSC: मानव pluripotent स्टेम सेल, EB: embryoid शरीर, LESC: अंग उपकला स्टेम कोशिकाओं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: अपेक्षित सेल यील्ड । Boxplots भेदभाव के 22-25 दिन पर cryostoring के लिए प्राप्त की कोशिकाओं की संख्या दिखा रहा है, 0 दिन पर EB गठन कदम के लिए, विभेदित hPSCs चढ़ाया की संख्या से विभाजित । प्रत्येक pluripotent Regea08/017 hESC से औसतन ०.७२ (sd ०.४) कक्षों का उत्पादन किया गया, जबकि ०.७८ (sd ०.६७) कक्षों को प्रत्येक उता. 04607. WT hiPSC से उत्पादित किया गया. n: विभेदक प्रयोगों की संख्या । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. hPSC-व्युत्पन्न LESCs की अपेक्षित phenotype. इम्यूनोफ्लोरेसेंस एंटीबॉडी लेबलिंग (क) नेत्र विकास नियामक PAX6 की एक समान अभिव्यक्ति दिखा रहा है और स्वीकार किया LESC मार्करों p63α और इसके ΔNp63 isoform, साथ ही साथ दो अन्य सुझाव LESC मार्करों-CK15 और 14. Pluripotency मार्कर OCT3/4 और परिपक्व corneal उपकला मार्कर CK-12 नकारात्मक हैं. प्रतिनिधि अगर Regea08/017 hESC-LESCs के लिए 24 दिन में भेदभाव के लिए दिखाया गया है । स्केल पट्टियां = १०० µm । (ख) हौसले से विभेदित और cryostored hPSC-LESCs से ΔNp63 कोशिका गिनती यह दर्शाता है कि कोशिकाओं को बनाए रखने ही नहीं है, लेकिन ΔNp63 के बाद बढ़ा cryostorage अभिव्यक्ति दिखाओ । सेल गिनती परिणाम दिखाएं > ताजा विभेदित hPSC के 65% LESCs cryobanking प्रक्रिया से पहले ΔNp63 के लिए सकारात्मक दाग, और > 80% सफल वसूली के बाद । n = अलग विभेदक प्रयोगों की संख्या (६०० प्रति नमूना गिना कक्षों की न्यूनतम और > 1600 कोशिकाओं प्रति समय बिंदु) (ग) प्रवाह cytometry विश्लेषण ६२% हौसले से विभेदित hPSC-LESCs और p63α के लिए सकारात्मक गल कोशिकाओं का ८१% दिखा रहा है, लाइन Regea08/017 के लिए सेल गिनती परिणाम की पुष्टि । * बी सी में संकेत गल कोशिकाओं । सकारात्मक नमूना के लिए लाल हिस्टोग्राम और नकारात्मक (दाग) नमूना के लिए काले । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एंटीबॉडी होस्ट पतलापन
यदि के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी
PAX6 खरगोश 1:200
p63α माउस 1:200
ΔNp63α खरगोश 1:200
CK-15 माउस 1:200
CK-14 माउस 1:200
CK-12 बकरी 1:200
OCT3 ४/ बकरी 1:200
माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए अगर
Alexa Fluor ५६८ विरोधी बकरी आइजी गधा 1:800
Alexa Fluor ५६८ विरोधी माउस ़ गधा 1:800
Alexa Fluor ४८८ विरोधी खरगोश ़ गधा 1:800
Alexa Fluor ४८८ विरोधी माउस ़ गधा 1:800

तालिका 1: अनुशंसित प्राथमिक और माध्यमिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी (यदि) hPSC-व्युत्पंन LESCs के लेबल । निर्माताओं के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का अपेक्षित परिणाम लगभग ३.५ सप्ताह के भीतर एफएफ hPSC के एक एकल सेल निलंबन से LESCs के सफल और मजबूत पीढ़ी है । corneal उपकला सतह बाह्य त्वक स्तर29से विकसित के रूप में, प्रोटोकॉल का पहला कदम इस वंश की ओर स्टीयरिंग hPSCs का उद्देश्य. वृद्धि कारक बीटा (TGF-β) विरोधी SB-५०५१२४ को बदलने के साथ एक छोटी 24 एच प्रेरण, और bFGF ectodermal विभेद को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, ४८ एच mesodermal बीएमपी-4 क्यू के बाद सतह बाह्य त्वक स्तर की ओर कोशिकाओं धक्का करने के लिए. निंनलिखित अनुयाई विभेदक कदम पर कर्नल IV/LN-521 संयोजन मैट्रिक्स के साथ रासायनिक परिभाषित भेदभाव मध्यम आगे LESCs के प्रति विभेद गाइड करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

प्रारंभिक सामग्री के उच्च गुणवत्ता (एफएफ hPSCs) सफल भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है । केवल संगम के निकट एफएफ hPSC संस्कृतियों और करीब १००% के लिए विभेदित phenotype इस्तेमाल किया जाना चाहिए । नियमित hPSC केरयोटाइपिंग की सिफारिश की है, के रूप में एकल कोशिका passaging karyotypic विषमता है कि विकास और भेदभाव के लाभ के लिए नेतृत्व hPSCs कर सकते है30। trypsin के लिए लंबे समय तक जोखिम अपर्याप्त EB गठन या hPSC मौत पैदा कर सकता है । प्रोटोकॉल पांच व्यक्तिगत व्युत्पंन और आनुवंशिक रूप से अलग hPSC लाइनों, दोनों hESC और hiPSC लाइनों के साथ परीक्षण किया गया था । छोटे अणु सांद्रता या प्रेरण समय के लिए सेल लाइन विशिष्ट संशोधनों के लिए कोई ज़रूरत नहीं थी । हालांकि, प्रोटोकॉल, अत्यधिक कोशिका मृत्यु या fibroblastic, न्यूरॉन या अन्य आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं की उपस्थिति के प्रारंभिक अनुकूलन के दौरान अवांछित वंश के लिए विभेदक संकेत दिया. ऐसी स्थिति में, विधि ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता हो सकती है । संस्कृति पोत प्रारूपों एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करते है और सिफारिश की आकार से बढ़ाया जा सकता है ।

hPSC संस्कृति से पूरे प्रोटोकॉल LESC भेदभाव और cryopreservation को परिभाषित किया गया है, अच्छा विनिर्माण अभ्यास के लिए आसान संक्रमण की अनुमति (जीएमपी) सेल थेरेपी उत्पादों के उत्पादन के लिए । वाणिज्यिक मीडिया और रिएजेंट के रूप में मजबूत विकास, निर्माण और गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रियाओं से गुजरना, वे hPSC संस्कृति और भेदभाव के लिए एक सुसंगत, समान गुणवत्ता मंच प्रदान करते हैं । निर्धारित शर्तों को कम बैच-to-बैच भिंनता है, जो मौजूदा hPSC पर एक लाभ प्रदान करता है-LESC भेदभाव प्रोटोकॉल10,11,12,13,14, 20 , 22 , 23. तेजी से और अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल भी तीन आयामी corneal organoids जो सेल लाइनों और प्रयोगशालाओं में मानकीकरण मुश्किल है पर एक लाभ प्रदान करता है, और मजबूत तरीके वांछित सेल प्रकार शुद्ध करने के लिए की आवश्यकता31 ,३२. इसके अतिरिक्त, उच्च कुशल प्रोटोकॉल मजबूत करने के लिए अनुसंधान प्रयोजनों के लिए LESCs उत्पादन का मतलब है, जैसे रोग मॉडलिंग, आनुवंशिक इंजीनियरिंग, दवा स्क्रीनिंग, और विषाक्तता परीक्षण प्रदान करता है । इसके अलावा, मंच आसानी से ठीक किया जा सकता है-रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (RPE कोशिकाओं)25के रूप में अन्य नेत्र उपकला कोशिका प्रकार के भेदभाव के लिए देखते.

सफल अंग कोशिका प्रतिस्थापन थेरेपी केवल कुछ हजार p63-सकारात्मक LESCs4, आंख के अनुसार की आवश्यकता है, लेकिन गुणवत्ता आश्वासन अतिरिक्त सेल आबादी और इसलिए बड़े पैमाने पर उत्पादन की आवश्यकता है । Cryobanking प्रत्यारोपण के लिए आसानी से उपलब्ध सेल शेयरों की तैयारी, साथ ही साथ गुणवत्ता और सुरक्षा परीक्षण के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, hPSC-LESC शुद्धता cryostoring के बाद सुधार, और आगे passaging और लंबे समय तक संस्कृति25के बाद, के रूप में बढ़ा ΔNp63 अभिव्यक्ति द्वारा सुझाव दिया ।

संक्षेप में, इस मजबूत विधि एक्सो-और फीडर सेल मुक्त संस्कृति की स्थिति के तहत ३.५ सप्ताह के भीतर hPSCs से ΔNp63α-सकारात्मक कोशिकाओं उत्पंन करता है । सेल संस्कृति के तरीकों यहां प्रस्तुत उच्च गुणवत्ता LESCs के उत्पादन को नेत्र कोशिका चिकित्सा का उपयोग करने के लिए लागू सक्षम करें ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन में फिनलैंड की अकादमी (ग्रांट नंबर २९७८८६), Tekes के ह्यूमन स्पेयर पार्ट्स प्रोग्राम, फिनिश फंडिंग एजेंसी फॉर टेक्नोलॉजी एंड इनोवेशन, फिनिश आई और टिशू बैंक फाउंडेशन और फिनिश सांस्कृतिक फाउंडेशन द्वारा समर्थन किया गया था । लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और सेल संस्कृति के लिए योगदान के लिए जैव चिकित्सा प्रयोगशाला तकनीशियन Outi Melin, हैना Pekkanen, एम्मा Vikstedt, और Outi Heikkilä धंयवाद । प्रोफेसर Katriina Aalto-Setälä BioMediTech इमेजिंग के लिए उपकरण उपलब्ध कराने के लिए hiPSC लाइन इस्तेमाल किया और प्रतिदीप्ति इमेजिंग कोर सुविधा प्रदान करने के लिए स्वीकार कर लिया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/Reagent
1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ Gibco #14040-091
1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ Lonza #17-512F/12
100 mm cell culture dish Corning CellBIND #3296 Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation
12-well plate Corning CellBIND #3336 Culture vessel format for IF samples
24-well plate Corning CellBIND #3337 Culture vessel format for IF samples
2-mercaptoethanol Gibco #31350-010
6-well plate, Ultra-Low attachment Corning Costar #3471 Culture vessel format for induction in suspension culture
Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig ThermoFisher Scientific #A-21202 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig ThermoFisher Scientific #A-21206 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-goat Ig ThermoFisher Scientific #A-11057 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig ThermoFisher Scientific #A-10037 Secondary antibody for IF
Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) PeproTech Inc. #AF-100-18B Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution BD Biosciences #554722 Fixation and permeabilization solution for flow cytometry
BD Perm/Wash Buffer BD Biosciences #554723 Washing buffer for flow cytometry
Blebbistatin Sigma-Aldrich #B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) PeproTech Inc. #120-05A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #A8022-100G
Cytokeratin 12 antibody Santa Cruz Biotechnology #SC-17099 Primary antibody for IF
Cytokeratin 14 antibody R&D Systems #MAB3164 Primary antibody for IF
Cytokeratin 15 antibody ThermoFisher Scientific #MS-1068-P Primary antibody for IF
CnT-30 CELLnTEC Advanced Cell Systems AG #Cnt-30 Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation
Collagen type IV (human) Sigma-Aldrich #C5533 Human placental collagen type IV
CoolCell LX Freezing Container Sigma-Aldrich #BCS-405
CryoPure tubes Sarsted #72.380 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation
Defined Trypsin Inhibitor Gibco #R-007-100
Essential 8 Flex Medium Kit Thermo Fisher Scientific #A2858501
GlutaMAX Gibco #35050061
Laminin 521 Biolamina #Ln521 Human recombinant laminin 521
ΔNp63α antibody BioCare Medical #4892 Primary antibody for IF
OCT3/4 antibody R&D Systems #AF1759 Primary antibody for IF
p63α antibody Cell Signaling Technology #ACI3066A Primary antibody for IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) Cell Signaling Technology #56687 p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry
PAX6 antibody Sigma-Aldrich #HPA030775 Primary antibody for IF
Penicillin/Streptomycin Lonza #17-602E
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich #158127 Cell fixative for IF
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific #P36931 DAPI mountant for hard mounting for IF
PSC Cryopreservation Kit Thermo Fisher Scientific #A2644601
TrypLE Select Enzyme Gibco #12563-011
KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco #10829018
KnockOut SR XenoFree CTS Gibco #10828028
MEM non-essential amino acids Gibco #11140050
SB-505124 Sigma-Aldrich #S4696
Triton X-100 Sigma-Aldrich #T8787 Permeabilization agent for IF
VectaShield Vector Laboratories #H-1200 DAPI mountant for liquid mounting for IF
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II Tharmac
Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 BD Biosciences
Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 Olympus

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References

  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
  3. Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
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विकास जीवविज्ञान अंक १४० मानव भ्रूण स्टेम सेल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल corneal अंग उपकला स्टेम सेल एक्सो-मुक्त फीडर-मुक्त छोटे अणु प्रेरण corneal विभेद निर्देशित
मानव Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से नैदानिक संगत Corneal अंग उपकला स्टेम कोशिकाओं के कुशल और स्केलेबल निर्देशित भेदभाव
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Hongisto, H., Vattulainen, M.,… More

Hongisto, H., Vattulainen, M., Ilmarinen, T., Mikhailova, A., Skottman, H. Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (140), e58279, doi:10.3791/58279 (2018).

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