Summary
Questo protocollo introduce un metodo in due semplici passaggi per la differenziazione delle cellule staminali corneali epiteliali limbal da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza cellula di xeno - e alimentatore. I metodi di coltura cellulare presentati qui abilitare produzione costo-efficiente, su larga scala di celle di qualità clinica applicabili all'utilizzo di terapia corneale delle cellule.
Abstract
Le cellule staminali epiteliali limbal corneale (LESCs) sono responsabili per rinnovare continuamente l'epitelio corneale e mantenendo così l'omeostasi cornea e la chiarezza visiva. Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-derivata LESCs forniscono una promettente fonte di cellule per terapia sostitutiva delle cellule corneali. Indefinito, xenogeniche cultura e differenziazione condizioni causano variazione nei risultati di ricerca e ostacolano la traslazione clinica terapeutica hPSC-derivato. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile ed efficiente per il differenziamento di hPSC-LESC in condizioni senza cellula xeno - e alimentatore. In primo luogo, cultura dello strato monomolecolare di hPSC indifferenziato il ricombinante laminin-521 (LN-521) e definito hPSC medio costituisce la base per la produzione di robusta di alta qualità materiale di partenza per differenziazioni. In secondo luogo, un metodo di differenziazione rapida e semplice hPSC-LESC produce popolazioni LESC in soli 24 giorni. Questo metodo include un'induzione superficie ectodermica di quattro giorni in sospensione con piccole molecole, seguita dalla fase di coltura aderente sulla matrice di combinazione di LN-521/collagene IV nel mezzo di differenziazione epiteliale corneale definiti. Cryostoring e differenziazione estesa ulteriormente purifica la popolazione delle cellule e consente bancari delle cellule in grande quantità per i prodotti di terapia cellulare. La risultante hPSC-LESCs di alta qualità forniscono una potenziale strategia di trattamento novello per la ricostruzione della superficie corneale per il trattamento di mancanza limbal della cellula formativa (LSCD).
Introduction
La cornea trasparente sulla superficie oculare permette alla luce di entrare la retina e fornisce la maggior parte del potere refrattivo dell'occhio. Lo strato più esterno, l'epitelio cornea stratificato, è continuamente rigenerato con le cellule staminali epiteliali limbal (LESCs). Il LESCs risiedono nello strato basale delle nicchie limbal al corneoscleral giunzione1,2. LESCs mancano marcatori specifici e unici, quindi la loro identificazione richiede un'analisi più ampia di una serie di markers putativi. P63 di fattore di trascrizione epiteliale e soprattutto N-terminalmente troncato trascrizione dell'isoforma alfa di p63 (ΔNp63α), è stato proposto come un rilevante positivo LESC segnapunti3,4. Divisione asimmetrica di LESCs permette loro di auto-rinnovarsi, ma anche produrre progenie che migrano centripeto e anteriormente. Come le cellule procede verso la superficie cornea hanno gradualmente perdere loro staminalità e infine terminalmente differenziare a cellule squamose superficiali che vengono continuamente perse dalla superficie cornea.
Danno ad uno qualsiasi degli strati corneali può portare a grave deficit visivo, e i difetti corneali sono dunque una delle principali cause di perdita di visione in tutto il mondo. Nella mancanza limbal della cellula formativa (LSCD), il limbus è distrutto da malattia o trauma che porta a conjunctivalization e opacizzazione della superficie corneale e la conseguente perdita di visione5,6. Terapia di sostituzione cellulare usando gli innesti limbal autologhi o allogenici offre una strategia di trattamento per i pazienti con LSCD4,7,8,9. Tuttavia, raccolta innesti autologhi sopporta un rischio di complicazioni per l'occhio sano e tessuto erogatore scarseggia. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs), in particolare cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs), può servire come una fonte illimitata di cellule clinicamente rilevanti, comprese quelle cellule epiteliali corneali. HPSC-derivato LESCs (hPSC-LESCs) rappresentano quindi una fonte interessante di cellulare nuovo per terapia sostitutiva delle cellule oculari.
Tradizionalmente, sia i metodi di coltura hPSC indifferenziato ed i loro protocolli di differenziazione di LESCs hanno fatto affidamento sull'uso di cellule di alimentatore indefinito, sieri animali, terreni condizionati o membrane amniotiche10,11, 12 , 13 , 14 , 15. recentemente, gli sforzi verso prodotti di terapia cellulare più sicuri hanno spinto alla ricerca di più protocolli standardizzati e xeno-libero Cultura e differenziazione. Di conseguenza, diversi metodi definiti e privo di xeno per coltura a lungo termine di hPSCs indifferenziato ora sono commercialmente disponibili16,17,18. Come un continuum, differenziazione diretto protocolli basandosi su indizi molecolare per guidare l'hPSCs al destino epiteliale cornea sono stati recentemente introdotti19,20,21,22, 23. Ancora molti di questi protocolli utilizzati entrambi hPSCs alimentatore basata indefinita, come materiale, o fattore di crescita del complesso, xenogeniche cocktail per differenziazione di partenza.
Lo scopo del presente protocollo è quello di fornire un robusto, ottimizzato, xeno- e metodo di coltura hPSC privo di alimentatore e successiva differenziazione di LESCs corneale. Cultura dello strato monomolecolare di pluripotent hPSCs il laminin-521 (LN-521) matrice in mezzo hPSC definito, privo di albumina (in particolare essenziale 8 Flex) permette la rapida produzione di materiale omogeneo partenza per differenziazioni. Da allora in poi una semplice strategia di differenziazione in due fasi guide hPSCs verso la superficie ectodermico destino in sospensione, seguita da differenziazione aderente a LESCs. Una popolazione di cellule dove > 65% express ΔNp63α è ottenuta entro 24 giorni. Il protocollo privo di xeno e alimentatore è stato testato con diverse linee di hPSC (hESC e hiPSCs), senza alcun requisito per ottimizzazione specifica cella linea. I protocolli per il week-end senza manutenzione, passaggio, cryostoring e hPSC-LESC phenotyping qui descritte consentono la produzione di grandi lotti di LESCs di alta qualità per cliniche o scopi di ricerca.
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Protocol
Università di Tampere ha l'approvazione dell'autorità nazionale per gli affari medicolegali Finlandia (Dnro 1426/32/300/05) per condurre una ricerca sugli embrioni umani. L'Istituto ha anche dichiarazioni di sostegno del comitato etico del quartiere ospedaliero Pirkanmaa derivare, cultura, e differenziare le linee di hESC (Skottman/R05116) e di utilizzare linee hiPSC nella ricerca oftalmica (Skottman/R14023). Nessun nuove linee di cellule sono state derivate per questo studio.
Nota: Il protocollo descritto si basa su hPSC specifici, disponibili in commercio e media di differenziazione dell'epitelio corneale. Consultare la Tabella dei materiali per i numeri di informazioni e catalogo del produttore/fornitore.
1. stabilire privo di Xeno e alimentatore hPSC cultura
- Preparazioni
- Cappotto a 24 pozzetti con umana ricombinante laminin-521 (LN-521). Per il primo passaggio privo di alimentatore (FF), utilizzare LN-521 a una concentrazione di 1,09 µ g/cm2e a 0,55 µ g/cm2 per i seguenti passaggi. Le concentrazioni di LN-521 suggerite servono come punto di partenza per la riuscita coltura di FF, ma possono essere abbassate.
- Scongelare: LN-521 flaconcino lentamente a 4 ° C, come indicato dal produttore.
Nota: Opportunamente gestito LN-521 soluzione può essere conservata a 4 ° C fino a 3 mesi dopo lo scongelamento. - Per preparare la soluzione di rivestimento, diluire la quantità appropriata della soluzione di riserva di LN-521 con di 1 x Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) contenente Ca2 + e Mg2 + per un volume totale di 300 µ l per pozzetto.
- Dispensare la soluzione di rivestimento dei pozzetti, sigillare la piastra ben con parafilm e incubare per una notte a 4 ° C. Piastre possono essere conservati a 4 ° C fino a 2 settimane.
(Opzionale): in alternativa, per un protocollo di rivestimento rapido, incubare piastre a pozzetti con soluzione di rivestimento per 2 h a 37 ° C, 5% CO2.
- Scongelare: LN-521 flaconcino lentamente a 4 ° C, come indicato dal produttore.
- Preparare hPSC terreno di coltura (in particolare essenziale 8 Flex) completando basale medio con supplemento fornito, come indicato dal produttore. Aggiungere 50 U/mL penicillina-streptomicina. Si noti che la formulazione è sensibile alla luce e ad alte temperature. Scongelare il supplemento e scaldare i media a temperatura ambiente (TA), al riparo dalla luce. Utilizzare il mezzo di hPSC completati entro due settimane dalla data del completamento.
- Cappotto a 24 pozzetti con umana ricombinante laminin-521 (LN-521). Per il primo passaggio privo di alimentatore (FF), utilizzare LN-521 a una concentrazione di 1,09 µ g/cm2e a 0,55 µ g/cm2 per i seguenti passaggi. Le concentrazioni di LN-521 suggerite servono come punto di partenza per la riuscita coltura di FF, ma possono essere abbassate.
- Trasferimento la hPSC cultura FF su LN-521
- Pre-riscaldare tutti i materiali necessari e reagenti per RT nella cappa a flusso laminare.
- Passaggio hPSCs da sistema di coltura standard su strati di alimentatore (ad es. inattivato umani del prepuzio (hFF) o fibroblasti embrionali del mouse), o altri sistemi di cultura FF utilizzando la metodologia standard. Ad esempio, colonie di hPSC coltivati su cellule di alimentatore hFF possono essere sezionati a piccoli pezzi con un bisturi e i pezzi poi staccati con una punta ad ago. Sportelli unici umani coltivati utilizzando sistemi di coltura FF possono essere trasferiti utilizzando cluster passaggio metodo con o senza trattamento enzimatico preliminare.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento di LN-521 dai 24-pozzi e aggiungere 1 mL di terreno pre-riscaldato hPSC per pozzetto.
Nota: Non lasciare i pozzetti a secco come LN-521 sarà inattivare durante l'essiccazione. - Trasferire i cluster di pezzi/cella di Colonia a LN-521 rivestito 24-pozzi in mezzo hPSC con una pipetta. Trasferimento di 20 – 30 pezzi di Colonia per pozzetto, evitando il sovraffollamento dei pozzetti.
- Sostituire il mezzo con 1 mL di terreno di hPSC il giorno dopo il trasferimento e ogni altro giorno da allora in poi. Le culture sono pronte per passaggio 3 – 4 giorni più tardi come hPSCs sono cresciuti fuori alle colonie con morfologia liscia, indifferenziato. Per riferimento, cfr. Figura 1B (prima immagine). Per il primo passaggio di FF, le colonie non dovrebbero essere consentite di crescere di un monostrato confluente completamente, ma le culture devono essere attraversate quando colonie raggiungeranno una dimensione approssimativa di 1 mm.
- Passaggio e la manutenzione di coltura hPSC FF
- Pre-riscaldare tutti i materiali necessari e reagenti per RT nella cappa a flusso laminare.
- Dal secondo passaggio di FF in poi, passaggio l'hPSCs FF quando la cultura ha raggiunto confluency di 80-100%. HPSCs FF passaggio a nuovo LN-521 rivestito 24 pozzetti utilizzando unicellulare passaggio due volte a settimana (il lunedì e giovedì) per mantenere le culture di alta qualità con morfologia indifferenziato e raggiungere regime alimentare privo di fine settimana. Per informazioni dettagliate, fare riferimento a18,24,25.
- Sciacquare l'hPSCs FF due volte con 1 mL di 1 x DPBS senza Ca2 + e Mg2 +.
- Togliere il FF hPSCs con xeno-libero tripsina-EDTA (in particolare TrypLE selezionare enzima) dopo incubazione 500 µ l per pozzetto a 37 ° C, 5% CO2. Per tempo di incubazione ottimali, permettono alle cellule di arrotondare ma non per staccare. Questo di solito prende 3 min a 37 ° C, 5% CO2 (non superare i 5 minuti).
- Rimuovere senza xeno tripsina-EDTA e immediatamente aggiungere 500 µ l di inibitore della tripsina definiti.
- Staccare FF hPSCs pipettando attenta, ma approfondita per ottenere una sospensione di singola cellula. Travasare la sospensione di hPSC FF attraverso un colino di cella di 40 µm in una provetta conica per centrifuga 15 mL contenente mezzo hPSC pre-riscaldato.
- Lavare i pozzetti con 1 mL di terreno di hPSC e aggiungere mezzo lavaggio la provetta conica per centrifuga da 15 mL.
- Centrifugare la sospensione singola cella per 5 min a 300 x g, aspirare il pellet cellulare e risospendere in 1 mL di terreno di hPSC pre-riscaldato.
- Contare le celle con un emocitometro o contatore di cellule automatizzato.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento di LN-521 (0,55 µ g/cm2) dai 24-pozzi e aggiungere mezzo hPSC come 1.2.3.
- Piastra FF hPSCs sulla 0,55 µ g/cm2 LN-521 rivestito 24-pozzi ad una densità di cella di 40.000-50.000 cellule/cm2.
- Sostituire medio con mezzo hPSC freschi il giorno dopo il passaggio e ogni giorno da allora in poi esclusa la domenica.
- Le cellule sono pronte per essere utilizzati per differenziazione 3-4 giorni dopo il passaggio, quando ha raggiunto la cultura > confluency di 85%. Per garantire l'alta qualità dell'hPSCs, fare riferimento ai metodi di caratterizzazione descritti in dettaglio nel precedente opere18,24,25. È consigliabile solo cultura hPSCs fino a livello di passaggio 15 nel sistema FF utilizzando singola cella passaggio per evitare cambiamenti karyotypic. Utilizzare solo hPSCs indifferenziato di alta qualità, come materiale di partenza per differenziazioni.
2. diretto differenziazione e crioconservazione di hPSC-derivati LESCs
- Preparazioni
- Preparare medio basale senza xeno induzione (induzione basale medio): supplemento Dulbecco modificato medio dell'Aquila (specificamente KnockOut DMEM) con sostituzione di 15% siero privo di xeno (particolare CTS KnockOut SR XenoFree), 2 mM L-Glutammina, 0,1 mM 2 - mercaptoetanolo, 1% non essenziali aminoacidi e 50 U/mL penicillina-streptomicina. Utilizzare il mezzo di induzione basale entro due settimane.
- Preparare i supporti per induzione cornea nella coltura di sospensione.
- 1 ° giorno: Supplemento medio basale induzione con 5 μM blebbistatin.
- Giorno 2: Supplemento medio basale induzione con 10 µM SB-505124 e 50 ng/mL fattore di crescita umano di base del fibroblasto (bFGF).
- Giorno 3-4: mezzo di induzione basale integratore con 25 proteina morfogenetica dell'osso ng/mL 4 (BMP-4).
- Preparare mezzo di differenziazione di epitelio corneale (mezzo di differenziazione, in particolare CnT-30) per cultura aderente: aggiungere supplementi al basale medio secondo le istruzioni del produttore e aggiungere 50 U/mL penicillina-streptomicina.
Nota: Formulazione di medie di differenziazione è sensibile alla luce. Utilizzare il mezzo di differenziazione completati entro 6 settimane dalla data di completamento. - Cappotto piatti di coltura del tessuto di 100mm per differenziazione aderente (Vedi punto 2.3) con una miscela di 5 µ g/cm2 placentare umana di collagene tipo IV (col IV) e 0,5 µ g/cm2 LN-521 diluito in 1 x DPBS contenente Ca2 + e Mg2 +, in un totale rivestimento volume di 5 mL per ogni piatto. Preparare e conservare i rivestimenti con col IV e LN-521 come descritto in 1.1.1.3.
-
Fase i: induzione cornea in coltura in sospensione
- Pre-riscaldare tutti i materiali necessari e reagenti per RT nella cappa a flusso laminare.
- Staccare hPSCs FF a sospensione unicellulare con tripsina-EDTA privo di xeno come indicato nella procedura 1.3.2.1–1.3.2.6. Contare le celle e distribuire 2-3 x 106 cellule per attacco basso 6 pozzetti bene, nel volume totale di 3 mL di terreno di induzione basale completato con 5 μM blebbistatin per indurre la formazione di EB durante la notte a 37 ° C, 5% CO2 (giorno 1).
- Il giorno seguente (giorno 2), rimuovere il supporto e sostituire con 3 mL di medium basale induzione supplementato con 10 µM SB-505124 e 50 ng/mL bFGF.
- Il seguente due giorni (giorni 3 – 4), rimuovere il supporto e sostituire con 3 mL di terreno di induzione basale completato con 25 ng/mL BMP-4.
- Fase II: Differenziazione cornea nella cultura aderente
- Pre-riscaldare tutti i materiali necessari e reagenti per RT nella cappa a flusso laminare.
- Il giorno 5, piastra EBs giù su piatti di coltura del tessuto 100 mm rivestiti con 5 µ g/cm2 col IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento da piastre di coltura del tessuto di 100mm e aggiungere 10 mL di mezzo di differenziazione pre-riscaldato per ogni piatto.
Nota: Non consentono i piatti ad asciugare come LN-521 sarà inattivare durante l'essiccazione. - Trasferire l'EBs da una piastra a 6 pozzetti bene a due-tre piatti di coltura del tessuto di 100 mm (circa 50 EBs per cm2) pipettando. Distribuire uniformemente l'EBs di agitazione delicata.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento da piastre di coltura del tessuto di 100mm e aggiungere 10 mL di mezzo di differenziazione pre-riscaldato per ogni piatto.
- Mantenere le cellule in coltura aderente a 37 ° C, 5% CO2, sostituendo il mezzo con 10 mL di mezzo di differenziazione fresco tre volte alla settimana (il lunedì, mercoledì e venerdì) per le prossime settimane di 2,5-3. Controllare le cellule regolarmente per l'emersione della corretta morfologia epiteliale mediante microscopio a contrasto di fase.
- Fase III: Cryo-banking hPSC-derivati LESCs
- Pre-riscaldare tutti i materiali necessari e reagenti per RT nella cappa a flusso laminare, tranne che per il mezzo di crioconservazione che dovrebbe essere pre-refrigerato.
- Staccare LESCs hPSC-derivati con tripsina-EDTA privo di xeno e contare le celle, come da istruzioni per FF hPSCs in passaggi 1.3.2.1–1.3.2.6, ma utilizzando il mezzo di differenziazione.
Nota: Per hPSC-derivati LESCs, tempo di incubazione ottimali con tripsina-EDTA privo di xeno è più lungo (circa 5 min). Utilizzare 3 mL di tripsina-EDTA privo di xeno e inibitore della tripsina definiti per ogni piatto di 100 mm. - Dopo il conteggio delle cellule, ripetere centrifugazione per 5 min a 300 x g, aspirare medio e risospendere il pellet cellulare nel mezzo di crioconservazione hPSC pre-refrigerati, privo di xeno. Dispensare la singola cella sospensione in provette per criogenia affinché ogni stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA contiene 0,5 a 1 x 106 cellule in 1 mL di terreno di crioconservazione.
- Disporre le provette in un contenitore di congelamento e trasferimento immediatamente (entro 5 min) a-80 ° C durante la notte.
- Il giorno seguente, è possibile trasferire i tubi a azoto liquido per stoccaggio a lungo termine.
- Fase IV: Lo scongelamento il crioconservati hPSC-LESCs
- Prima lo scongelamento, cappotto i piatti/pozzetti con 5 µ g/cm2 col IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521.
- Pre-riscaldare tutti i materiali necessari e reagenti per RT nella cappa a flusso laminare.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento da piatti/pozzi e aggiungere volume appropriato di mezzo di differenziazione pre-riscaldato.
Nota: Non consentono i piatti ad asciugare come LN-521 sarà inattivare durante l'essiccazione. - Scongelare le cellule rapidamente a RT e trasferire immediatamente la sospensione cellulare in una provetta conica per centrifuga 15 mL contenente 5 mL di mezzo di differenziazione pre-riscaldato.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 300 x g, aspirare e risospendere il pellet in mezzo di differenziazione per rimuovere qualsiasi mezzo di crioconservazione.
- Piastra le cellule su piatti/pozzetti sensibilizzati con 5 µ g/cm2 col IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521, nel mezzo di differenziazione ad una densità di 40.000-50.000 cellule/cm2. Mantenere le cellule a 37 ° C, 5% CO2, sostituendo il mezzo di differenziazione tre volte a settimana.
3. phenotyping di hPSC-derivati LESCs
- Analisi di immunofluorescenza qualitativa
- Per l'immunofluorescenza, cappotto 24 o 12 pozzetti pozzetti della piastra con 5 µ g/cm2 col IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521 e piastra/disgelo hPSC-LESCs nel mezzo di differenziazione ad una densità di 40 000-50 000 cellule/cm2.
- Quando le colture hanno raggiunto la confluenza, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (PFA): lavare i pozzetti due volte con 1 x DPBS senza Ca2 + e Mg2 +e incubare per 15-20 minuti con 4% PFA a TA. Successivamente, lavare due volte con 1 x DPBS per eliminare eventuali residui PFA. Uso di 0,5-1 mL di soluzioni per pozzetto.
Nota: Celle fisse possono essere memorizzate in 1 x DPBS a 4 ° C fino a una settimana prima della colorazione.
Attenzione: PFA è tossico e corrosivo. Gestire PFA in una cappa aspirante e indossare indumenti protettivi, occhiali di protezione e guanti. - 1 x DPBS di aspirare e permeabilize le membrane cellulari incubando per 10-15 min con 0,1% Triton X-100 in 1 x DPBS.
- Aspirare 0.1% Triton X-100 e blocco degli anticorpi non specifici siti di legame incubando per 1 h con 3% di albumina di siero bovino (BSA) in 1 x DPBS a RT. preparare diluizioni di anticorpo primario in 0,5% BSA in 1 x DPBS.
Nota: Vedi tabella 1 per gli anticorpi primari consigliati. - Aspirare il 3% BSA e incubare con l'anticorpo primario opportunamente diluito durante la notte a 4 ° C.
- Lavare i pozzetti 3 x per 5 minuti con 1 x DPBS. Preparare diluizioni di anticorpo secondario in 0,5% BSA in 1 x DPBS.
Nota: Vedi tabella 1 per gli anticorpi secondari consigliati. - 1 x DPBS di aspirare e incubare con anticorpo secondario adatto, opportunamente diluito per 1 h a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
Nota: Da questo punto, mantenere i campioni al fine di evitare la sbiadisc delle tinture fluorescenti al riparo dalla luce. - Lavare i pozzetti 3 x per 5 minuti con 1 x DPBS e, infine, i nuclei controcolorazione con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e montare con fluorescenza supporti di montaggio. DAPI può essere utilizzato separatamente secondo le istruzioni del produttore o incluso nel mezzo di montaggio. Posto rotondo coprioggetti (diametro 19 mm e 13 mm per 12 e 24 pozzetti piastre, rispettivamente) in ciascun pozzetto. Seguire le istruzioni del produttore per quanto riguarda l'essiccazione e stoccaggio dei campioni montati.
- L'immagine di cellule marcate con un microscopio a fluorescenza.
- Analisi quantitativa di immunofluorescenza
- Preparazione di cytospin campioni di hPSC-derivati LESCs oggetto occhiali.
- Staccare LESCs hPSC-derivati con tripsina-EDTA privo di xeno e contare le celle, come indicato al punto 2.4.2.
- Dopo il conteggio, aggiungere 1 x DPBS pre-refrigerati e centrifugare per 5 minuti a 300 x g. regolare il volume del campione e concentrazione di cellule secondo le istruzioni del produttore della citocentrifuga dato, ad es. 50.000 – 100.000 cellule in un volume di campione di 150 µ l.
- Girare le cellule fino a oggetto occhiali con una citocentrifuga ad es. 5 min a 28 x g e correzione immediatamente per 15-20 min con 4% PFA in 1 x DPBS a TA. Per il tempo consigliato filatura e velocità, consultare il manuale di istruzioni della citocentrifuga determinato.
- Procedere alla colorazione dei campioni di cytospin come descritto nella penna di passaggi 3.1.3–3.1.8 uso liquido bloccante per circondare i campioni con un cerchio idrofobo e condurre la colorazione in una gocciolina per pratica economica. Lavaggi devono essere eseguiti in contenitori con portavetrini, al fine di garantire un'efficiente rimozione di anticorpi in eccesso e la colorazione di fondo minimo. Colorante di contrasto nuclei con DAPI e montare i campioni macchiati con fluorescenza media, che coprono con le lamelle di montaggio. Seguire le istruzioni del produttore per quanto riguarda l'essiccazione e stoccaggio dei campioni montati.
- Catturare immagini di 5 – 10 per campione dal selezionato casualmente utilizzando ad es. 10 X ingrandimento di un microscopio a fluorescenza.
- Stimare la percentuale di cellule macchiate positivamente in relazione alla totale cellule (DAPI positive), ad esempio con ImageJ Image Processing e analisi strumenti software (https://imagej.nih.gov/ij/). Preferibilmente analizzare > 500 cellule per campione.
- Aprire l'immagine per essere analizzati nel software ImageJ. Duplicare l'immagine e il filtro con sfocatura gaussiana predefinito per rimuovere il rumore.
- Creare una soglia. Regolare i valori di soglia ottimale selezione dei nuclei delle cellule positivamente macchiato e applicare. L'immagine duplicata è ora convertito in un binario vista.
- Processo l'immagine binaria con binario elaborazione strumenti "Riempimento fori" e "Spartiacque", che separerà automaticamente unite aree che rappresentano i singoli nuclei.
- Utilizzare lo strumento "Analyze particelle" per automaticamente elencare le regioni di interesse (ROI) alla finestra di gestione ROI, che si aprirà dopo l'applicazione del comando. Chiudere l'immagine binaria.
- Visualizzare il ROIs nell'immagine originale scegliendo "Visualizza tutti" nel gestore di ROI. Confermare la corretta selezione dei nuclei delle cellule macchiato e se necessario, rimuovere manualmente e aggiungere singole selezioni.
- Preparazione di cytospin campioni di hPSC-derivati LESCs oggetto occhiali.
- Analisi di citometria a flusso
- Per confermare i livelli di espressione p63α, macchia le celle per citometria a flusso.
- Staccare LESCs hPSC-derivati con tripsina-EDTA privo di xeno e contare le celle, come indicato al punto 2.4.2.
- Lavare le cellule due volte con 1 mL pre-refrigerati 1 x DPBS e centrifugare per 5 min a 300 x g. Fix e permeabilize con soluzione ready-to-use fissazione/permeabilizzazione per 20 min a 4 ° C. Da allora in poi lavare le cellule due volte con 1 mL pre-raffreddato 1x permeabilizing tampone di lavaggio.
Nota: Da questo punto, tenere le cellule a 4 ° C o su ghiaccio, a meno che non diversamente indicato. - Attenzione: Soluzione di fissazione/permeabilizzazione contiene formaldeide del 4,2%. Gestire la soluzione pericolosa in una cappa aspirante e indossare indumenti protettivi, occhiali di protezione e guanti.
- Dividere i campioni in provette di polipropilene da 5 mL. Ogni campione deve contenere 100.000 – 200.000 cellule e il volume del campione deve essere regolato a circa 100 µ l di tampone di lavaggio 1X.
- Aggiungere 2 µ l di anticorpo di fluorocromo coniugato p63-α FACS (per l'anticorpo consigliato, vedere tabella di attrezzature e materiali) nei tubi del campione. Lasciare un campione senza macchia per servire come controllo negativo. Vortice i campioni e incubare per 1 h a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
- Lavare le cellule due volte con 1 mL di pre-refrigerati 1x tampone di lavaggio e, infine, risospendere il pellet con 300 µ l di tampone. Conservare i capillari sul ghiaccio, al riparo dalla luce.
- Analizzare i campioni con un citometro a flusso. Utilizzare il campione di controllo negativo non macchiate per gating della popolazione cellulare corretto e per escludere il segnale di fondo fluorescente. Analizzare un minimo di 10.000 p63-α-macchiato le cellule. Per la realizzazione tecnica dettagliata, consultare il manuale utente del citofluorimetro determinato.
- Per confermare i livelli di espressione p63α, macchia le celle per citometria a flusso.
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Representative Results
Da hPSCs a hPSC-LESCs
L'intero processo dall'induzione della differenziazione di hPSCs FF a cryostoring hPSC-LESCs prende circa 3,5 settimane. Descrizione schematica del metodo differenziazione evidenziando i passi chiavi è presentato in Figura 1A. Figura 1B Mostra morfologie tipiche delle popolazioni di cellule in diverse fasi del protocollo. I dati presentati sono ottenuti con Regea08/017 hESC e UTA.04607.WT hiPSC linea, derivati sia caratterizzato presso l'Università di Tampere, in Finlandia, come descritto in precedenza26,27,28.
Il LN-521 in mezzo hPSC, l'hPSCs FF indifferenziato, di alta qualità prima formare colonie distinte con spigoli vivi, che si fondono a strati monomolecolari omogenei su confluenza (Figura 1B, prima immagine). Numerose linee di hESC e hiPSC singolarmente derivate e geneticamente distinte correttamente adattati e coltivate con questo sistema. Le popolazioni di hPSC FF moltiplicano circa 3 volte all'interno di ogni passaggio, fornendo mezzi robusti per generare xeno- e materiale di partenza per differenziazioni25privo di alimentatore. L'induzione di 24 h nel mezzo di EB produce in genere una sospensione di EBs stretto, regolare, di dimensioni variabili (Figura 1B, seconda immagine). Durante l'induzione superficie ectodermica in sospensione (giorno 2 – 4), la morfologia EB non dovrebbe cambiare radicalmente. Escrescenza coloniale appare subito dopo l'EBs sono piastrate su matrice di combinazione col IV/LN-521 in mezzo di differenziazione (Figura 1B, immagini di terza e quarta), ed entro 21 – 25 giorni di differenziazione le cellule formano strati confluenti omogenei con poligonale morfologia tipica delle cellule epiteliali (Figura 1B, quinta immagine). Le cellule possono quindi essere cryostored per un uso successivo. Vitalità e la morfologia sono ben conservati dopo lo scongelamento hPSC-LESCs (Figura 1B, ultima immagine).
In genere, 3 x 106 FF hPSCs placcato per una singola piastra a 6 pozzetti resa abbastanza EBs per essere placcato per coltura aderente in piastre di coltura cellulare di 2 – 3 (100 mm). Da ogni piatto di 100 mm, 1 a 1,5 x 106 cellule possono essere raccolto per cryobanking da giorno 22 – 25 di differenziazione. In media, ogni indifferenziato hPSC FF genera 0,7 cellule di giorno 25 (Figura 2).
Convalida di hPSC-derivati LESCs
In assenza di specifiche proteine di marker LESC, il fenotipo delle cellule corrette è confermato con una serie di marcatori che dimostrano la diminuzione nell'espressione della pluripotenza proteine associate e ha aumentato l'espressione di marcatori LESC riconosciuti. Al giorno 24 di differenziazione, la stragrande maggioranza della hPSC-derivati LESCs espresso Paired box proteina PAX6 (PAX6), il regolatore chiave di sviluppo dell'occhio, così come p63α, il marcatore LESC ampiamente riconosciuto. Il tronco p63-isoforma ΔNp63 è co-espressi nella maggior parte delle cellule p63α-positive, confermando il fenotipo delle cellule ΔNp63α-positive più cornea-specifici. Marcatori epiteliali basali e presunto LESC marcatori cytokeratin (CK) -15 e CK-14 sono espressi in parte, considerando che il marcatore di cellule staminali pluripotenti OCT3/4 e indicatore epiteliale corneale maturo CK-12 sono rilevabili a questo punto. Questo indica la differenziazione di FF hPSCs verso i progenitori epiteliali limbal unipotenti, ma non ancora differenziamento in cellule epiteliali corneale mature. (Figura 3A) HPSC-LESCs mantenere con successo il loro fenotipo dopo il recupero dalla crioconservazione (dati paragonabili a Figura 3A).
Dopo 24 giorni di differenziazione, ΔNp63 è stato espresso a 66,2% (n = 33, SD 9,3%) del Regea08/017 hESC-LESCs con il 65,7% (n = 10, SD 4,1%) Uta.04607.WT hiPSC-LESCs (quantificati dai campioni di cytospin, Figura 3B). Dopo il recupero dalla crioconservazione, 82,2% (n = 10, SD 5,7%) di hESC-LESCs e 90,5% (n = 10, SD=3.7%) di hiPSC-LESCs espresso ΔNp63 (quantificati da piastre a pozzetti il giorno 26 – 28, Figura 3B).
L'espressione di p63α fu ulteriormente confermata con analisi di citometria a flusso per Regea08/017 hESC-LESCs. Al giorno 25 di differenziazione, il 62% degli appena differenziata hPSC-LESCs erano positive per p63α. Due giorni dopo il recupero dalla crioconservazione (in totale 28 giorni), 81% delle cellule erano p63α-positivi (Figura 3).
Figura 1: illustrazione schematica del protocollo di differenziazione hPSC-LESC (A) e morfologie tipico delle cellule osservate nelle diverse fasi del processo (B). EBs sono formate da una sospensione di singola cellula di alta qualità, indifferenziato hPSCs durante l'induzione di piccola molecola di 24 h. tre giorni prima verso la superficie ectoderma in sospensione è seguita da fase di differenziazione aderente. Dal giorno 24 di differenziazione, la maggior parte delle cellule Mostra LESC-come la morfologia tipica. Immagini rappresentative indicate per Regea08/017 hESC linea prima e durante il differenziamento. Nero scala bar = 200 µm, valido per tutte le immagini nel pannello. Abbreviazioni: Blebb.: blebbistatin, SB: SB-505124 piccola molecola inibitore, bFGF: fattore di crescita di base del fibroblasto, BMP-4: ossea morfogenetica 4, LN-521: umano ricombinante laminin 521, col IV: umano placentare collagene di tipo IV, hPSC: pluripotenti umane cellule staminali, EB: embryoid body, LESC: cellule staminali epiteliali limbal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rendimento previsto cell. BoxPlot mostrando il numero di cellule ottenute per cryostoring il giorno 22-25 di differenziazione, divisa per numero di indifferenziato hPSCs placcato per passaggio di formazione EB il giorno 0. Il medio 0,72 (SD 0.4) le cellule sono state prodotte da ogni pluripotenti hESC Regea08/017, mentre 0,78 (SD 0,67) le cellule sono state prodotte da ogni hiPSC UTA.04607.WT. n: numero di esperimenti di differenziazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Previsto il fenotipo di hPSC-derivato LESCs. Contrassegno (A) mostrando espressione uniforme del regolatore di occhio sviluppo PAX6 e riconosciuto LESC marcatori p63α e la sua isoforma ΔNp63, come pure due altri dell'anticorpo di immunofluorescenza ha suggerito marcatori LESC - CK15 e 14. Marcatori di pluripotenza OCT3/4 e indicatore epiteliale corneale maturo CK-12 sono negativi. Immagini rappresentative di se mostrate per Regea08/017 hESC-LESCs al giorno 24 di differenziazione. Scala bar = 100 µm. (B) ΔNp63 cella contando da appena differenziato e cryostored hPSC-LESCs dimostra che le cellule non solo mantengono, ma mostrano l'espressione aumentata ΔNp63 dopo crioconservazione. Conta cellulare risultati Visualizza > 65% degli appena differenziata hPSC-LESCs hanno macchiato il positivo per ΔNp63 prima della procedura di cryobanking, e > 80% dopo un recupero corretto. n = numero di esperimenti di differenziazione separati (minimo di 600 cellule contate per campione e > 1600 cellule per punto nel tempo) analisi di citometria a flusso (C) risultati positivi per p63α, 62% degli appena differenziata hPSC-LESCs e l'81% delle cellule scongelate confermando la cella conteggio risultati per linea Regea08/017. * in B-C indicano cellule scongelate. Istogramma rosso per campione positivo e nero per campione negativo (non colorato). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Anticorpo | Host | Diluizione |
| Anticorpi primari per se | ||
| PAX6 | coniglio | 1: 200 |
| p63α | mouse | 1: 200 |
| ΔNp63α | coniglio | 1: 200 |
| CK-15 | mouse | 1: 200 |
| CK-14 | mouse | 1: 200 |
| CK-12 | capra | 1: 200 |
| OCT3/4 | capra | 1: 200 |
| Anticorpi secondari per se | ||
| Alexa Fluor 568 anti-capra Ig | asino | 1: 800 |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | asino | 1: 800 |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | asino | 1: 800 |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | asino | 1: 800 |
Tabella 1: consigliato anticorpi primari e secondari utilizzati per immunofluorescenza (se) etichettatura di hPSC-derivato LESCs. Vedi Tabella materiali per i produttori.
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Discussion
Il risultato previsto del presente protocollo è la generazione robusta e di successo di LESCs da una sospensione unicellulare di FF hPSC entro circa 3,5 settimane. Come epitelio corneale si sviluppa dalla superficie ectoderma29, il primo passo del protocollo mira a sterzo hPSCs verso questo lignaggio. Un'induzione di breve 24h con trasformazione di fattore di sviluppo beta (TGF-β) antagonista SB-505124 e bFGF sono utilizzati per indurre la differenziazione ectodermica, seguita da spunto di BMP-4 mesodermal 48h per spingere le cellule verso la superficie ectoderma. Il passaggio seguente differenziazione aderente sulla matrice di combinazione col IV/LN-521 insieme a mezzo di differenziazione chimicamente definito è usato per guidare ulteriore differenziazione verso LESCs.
Alta qualità della materia prima (l'hPSCs FF) è fondamentale per il differenziamento di successo. Devono essere utilizzate solo FF hPSC culture con confluenza e quasi il 100% del fenotipo indifferenziato. Cariotipo normale hPSC è consigliato, come passaggio di singola cellula può predisporre hPSCs a anomalie karyotypic che portano alla crescita e differenziazione vantaggi30. L'esposizione prolungata a tripsina può causare la morte di formazione o hPSC EB inadeguata. Il protocollo è stato testato con cinque individualmente derivato e linee hESC sia hiPSC, hPSC geneticamente distinte. Non c'era alcun bisogno di cella linea specifiche modifiche della concentrazioni di piccola molecola o tempi di induzione. Tuttavia, durante l'ottimizzazione iniziale del protocollo, morte cellulare eccessiva o comparsa di cellule con morfologia fibroblastica, un neurone o di altro indicato differenziazione a lignaggi indesiderati. In tal caso, il metodo potrebbe richiedere di fine-tuning. I formati di vaso di cultura forniscono un punto di partenza e possono essere migliorati dalle dimensioni consigliate.
L'intero protocollo da hPSC cultura LESC differenziazione e crioconservazione è definito, che consentono facile transizione alla buona pratica di fabbricazione (GMP) per la produzione della cella prodotti per la terapia. Come i media commerciali e i reagenti subiscono lo sviluppo robusto, produzione e procedure di controllo qualità, forniscono una piattaforma di qualità costante e uniforme per differenziazioni e hPSC cultura. Condizioni definite minimizzare la variazione lotto, che offre un vantaggio sopra albergo esistente hPSC-LESC differenziazione protocolli10,11,12,13,14, 20 , 22 , 23. il protocollo veloce e relativamente semplice fornisce inoltre un vantaggio rispetto tridimensionale organoids corneali che sono difficili da standardizzare le linee cellulari e laboratori e richiedono metodi robusti per purificare i tipi di cella desiderata31 ,32. Inoltre, il protocollo altamente efficiente fornisce robusti mezzi per produrre LESCs per scopi di ricerca, ad es. malattia modellazione, ingegneria genetica, screening di farmaci e test tossicologici. Inoltre, la piattaforma può essere facilmente regolata per differenziazione di altri tipi di cellule epiteliali oculari come pigmento retinico epiteliale cellule (RPE)25.
Terapia sostitutiva delle cellule di limbal successo richiede solo poche migliaia p63-positivi LESCs4, per l'occhio, ma garanzia della qualità richiede quindi grande scala produzione e popolazioni di cellule supplementari. Cryobanking consente una preparazione delle cellulare prontamente disponibili per il trapianto, così come per la qualità e test di sicurezza. Ulteriormente, la purezza di hPSC-LESC migliora dopo cryostoring e in seguito dopo passaggio e prolungato cultura25, come suggerito dall'espressione aumentata ΔNp63.
In sintesi, questo robusto metodo genera cellule ΔNp63α-positive da hPSCs entro 3,5 settimane in condizioni di coltura senza cellula di xeno - e alimentatore. I metodi di coltura cellulare qui presentati consentono la produzione di uso di terapia di alta qualità LESCs cella applicabile all'oculare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto dell'Accademia di Finlandia (concessione numero 297886), il programma di pezzi di ricambio umani di Tekes, l'agenzia finlandese di finanziamento per la tecnologia e l'innovazione, l'occhio finlandese e Tissue Bank Foundation e la Fondazione culturale finlandese. Gli autori ringraziano i tecnici di laboratorio biomedico Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt e Outi Heikkilä per assistenza tecnica eccellente e contributo alla coltura delle cellule. Professor Katriina albanese è riconosciuto per fornire il hiPSC linea utilizzata e BioMediTech Imaging Core facility per la fornitura di apparecchiature per l'imaging di fluorescenza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
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