Summary
本协议介绍了一种简单的两步法在异种和无细胞培养条件下, 从人多潜能干细胞中分化角膜缘上皮干细胞的方法。这里介绍的细胞培养方法可实现经济高效的大规模生产, 适用于角膜细胞治疗使用的临床质量细胞。
Abstract
角膜缘上皮干细胞 (LESCs) 负责持续更新角膜上皮细胞, 从而保持角膜的稳态和视觉清晰度。人类多能干细胞 (hPSC) 衍生 LESCs 为角膜细胞置换治疗提供了有希望的细胞来源。未定义、异种的培养和分化条件导致了研究结果的变化, 阻碍了 hPSC 治疗的临床翻译。该协议为异种和馈线无细胞条件下的 hPSC LESC 分化提供了一种可重现和有效的方法。首先, 对重组 laminin-521 (LN-521) 和定义的 hPSC 培养基中未分化 hPSC 的单层培养是稳定生产高质量起始材料的基础。其次, 快速简单的 hPSC LESC 分化方法仅在24天内就会产生 LESC 种群。该方法包括四天表面外胚层诱导的小分子悬浮液, 其次是在 LN-521/collagen IV 组合基质上贴壁培养相, 确定角膜上皮分化培养基。Cryostoring 和扩展分化进一步净化细胞的种群, 并使细胞的银行在大量的细胞治疗产品。由此产生的高质量 hPSC LESCs 为角膜表面重建治疗角膜缘干细胞缺乏 (康乐文化署) 提供了一种潜在的新的处理策略。
Introduction
眼睛表面的透明角膜允许光线进入视网膜并提供大部分眼球的折射力。角膜缘上皮干细胞 (LESCs) 持续再生, 是最外层的层状角膜上皮细胞。LESCs 位于巩膜交界处1,2的角膜缘壁龛的基底层。LESCs 缺乏特定的和独特的标记, 因此它们的识别需要对一套假定标记进行更广泛的分析。上皮转录因子 p63, 特别是 p63 (ΔNp63α) 阿尔法异构体的 n-末期截断转录, 已被提出作为一个相关的阳性 LESC 标记3,4。LESCs 的不对称分裂允许他们自我更新, 但也产生迁移向心地和前方的后代。随着细胞向角膜表面的进展, 他们逐渐失去了干性, 最后最终分化为从角膜表面不断丢失的表面鳞状细胞。
对任何角膜层的损伤都会导致严重的视力损害, 因此角膜缺陷是全球视力丧失的主要原因之一。在角膜缘干细胞缺乏症 (康乐文化署), 角膜缘被破坏的疾病或创伤导致 conjunctivalization 和白内障的表面和随后的视力损失5,6。使用自体或异基因角膜缘移植的细胞置换疗法为康乐文化署4、7、8、9的患者提供治疗策略。然而, 收获自体移植有并发症的风险, 健康的眼睛, 捐助组织是供不应求。人类多能干细胞 (hPSCs), 特别是人类胚胎干细胞 (hESCs) 和人类诱导的多能干细胞 (hiPSCs), 可以作为一种无限的临床相关细胞类型, 包括角膜上皮细胞的来源。因此, hPSC 衍生的 LESCs (hPSC LESCs) 代表了一种吸引眼球细胞替代疗法的新细胞源。
传统上, 未分化的 hPSC 培养方法和 LESCs 的分化协议依赖于未定义的馈线细胞、动物血清、条件培养基或羊膜10、11、12,13,14,15. 最近, 对更安全的细胞治疗产品的努力促使人们寻求更标准化和异种的文化和差异化协议。因此, 对未分化 hPSCs 的长期培养的几种定义和异种的方法现在在商业上可用16,17,18。作为一个连续的, 定向分化协议依赖分子线索引导 hPSCs 角膜上皮的命运最近介绍了19,20,21,22, 23。然而, 许多这些协议使用的是未定义的, 以馈线为基础的 hPSCs 作为起始材料, 或复杂, 异种生长因子鸡尾酒的分化。
本协议的目的是提供一个强大的, 优化的, 异种和无饲养的 hPSC 培养方法和随后分化的角膜 LESCs。多能 hPSCs 在 laminin-521 (LN-521) 基质中的单层培养在定义的无白蛋白 hPSC 培养基 (特别重要的 8 Flex) 允许快速生产均匀起始材料的分化。此后, 一个简单的, 两步分化策略引导 hPSCs 朝向表面外胚层的命运在悬浮, 其次是贴壁分化到 LESCs。在24天内获得 > 65% express ΔNp63α的细胞种群。异种和无馈线协议已通过几个 hPSC 线 (hESCs 和 hiPSCs) 进行了测试, 没有任何对细胞系特定优化的要求。此处介绍的无周末维护、传代、cryostoring 和 hPSC LESC 分型协议可为临床或研究目的生产大量高质量 LESCs。
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Protocol
坦佩雷大学经芬兰国家法医学鉴定事务局 (Dnro 1426/32/300/05) 批准, 对人类胚胎进行研究。该研究所还有皮尔卡曼医院区道德委员会的支持性声明, 以推导、培养和区分人类胚胎干细胞线 (Skottman/R05116), 并在眼科研究中使用 hiPSC 线 (Skottman/R14023)。这项研究没有新的细胞系。
注意: 所述的协议是基于特定的, 商业上可用的 hPSC 和角膜上皮分化培养基。有关制造商/供应商信息和目录编号, 请参阅材料表。
1. 建立异种和无饲养 hPSC 文化
- 准备
- 大衣24孔板与人重组 laminin-521 (LN-521)。对于第一个无馈线 (FF) 通道, 使用 LN-521 在浓度为1.09 µg/厘米2, 并在0.55 µg/厘米2为以下段落。建议的 LN-521 浓度作为成功的 FF 文化的起点, 但可以降低。
- 按照制造商的指示, 在4摄氏度下缓慢解冻 LN-521 小瓶。
注意: 在解冻后, 适当处理的 LN-521 溶液可以储存在4摄氏度, 长达3月。 - 要准备涂层解决方案, 请用1x 杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 稀释适量的 LN-521 库存溶液, 其中含有 Ca2 +和 Mg2 +到总体积300µL 每井。
- 将涂层溶液移到井中, 用石蜡膜密封井板, 并在4摄氏度下过夜孵育。涂层板可存储在4摄氏度, 长达2周。
(可选): 另外, 对于快速涂层协议, 请在37摄氏度、5% CO2的 2 h 处孵育具有涂层溶液的孔板。
- 按照制造商的指示, 在4摄氏度下缓慢解冻 LN-521 小瓶。
- 按照制造商的指示, 根据提供的补充剂补充基础培养基, 准备 hPSC 培养基 (特别重要的 8 Flex)。加入 50 U/毫升青霉素-链霉素。请注意, 该配方对光线和高温很敏感。在室温 (RT) 下解冻补充剂, 加热介质, 保护光线。从补充日起两周内使用补充的 hPSC 培养基。
- 大衣24孔板与人重组 laminin-521 (LN-521)。对于第一个无馈线 (FF) 通道, 使用 LN-521 在浓度为1.09 µg/厘米2, 并在0.55 µg/厘米2为以下段落。建议的 LN-521 浓度作为成功的 FF 文化的起点, 但可以降低。
- 在 LN-521 上转移 hPSC 到 FF 文化
- 预热所有需要的材料和试剂在层流罩中 RT。
- 通过标准的方法, hPSCs 从标准培养系统 (如灭活人包皮 (hFF) 或小鼠胚胎成纤维细胞) 或其他 FF 培养系统中通过。例如, 在 hFF 馈线细胞培养的 hPSC 菌落可以用手术刀解剖到小块上, 然后用针头将其分离。使用 FF 培养系统培养的人 PSCs 可以使用聚类传代方法进行或不需要事先酶处理。
- 从24孔中取出 LN-521 涂层溶液, 并添加1毫升预预热 hPSC 培养基/井。
注意: 不要让水井干燥, 因为 LN-521 会在干燥时禁用。 - 用移液器将菌落块/细胞簇转移到 hPSC 培养基中的 LN-521 涂层24孔中。转移20–30菌落, 避免水井过度拥挤。
- 更换培养基与1毫升的 hPSC 培养基在转移后的一天, 此后每隔一天。传代3–4天以后, 这些文化已经准备好了, 因为 hPSCs 已经长成了光滑、未分化的殖民地。有关参考, 请参见图 1B (第一个图像)。对于第一个 FF 通道, 不应允许菌落生长到完全汇合的单层, 但当菌落达到1毫米的近似大小时, 应传代培养物。
- FF hPSC 文化的传代与维护
- 预热所有需要的材料和试剂在层流罩中 RT。
- 从第二个 ff 通道开始, 通过 ff hPSCs, 当文化达到80-100% 融合。通过 FF hPSCs 到新的 LN-521 涂层24孔板使用单细胞传代每周两次 (周一和周四) 保持高质量的文化与未分化的形态学和实现周末免费喂养方案。详情请参阅18、24、25。
- 用1毫升 1x DPBS 冲洗 FF hPSCs 两次, 不含 Ca2 +和 Mg2 +。
- 分离 FF hPSCs 与异种游离胰蛋白酶-EDTA (特别是 TrypLE 选择酵素) 通过孵化500µL 每井在37摄氏度, 5% CO2。为获得最佳孵育时间, 允许细胞向上舍入, 但不能分离。这通常需要3分钟在37摄氏度, 5% CO2 (不超过5分钟)。
- 去除异种胰蛋白酶-EDTA, 并立即添加500µL 每井定义的胰蛋白酶抑制剂。
- 通过仔细而彻底的移液分离 FF hPSCs 以获得单细胞悬浮液。将 FF hPSC 悬浮液通过40µm 细胞过滤器传送到15毫升锥形离心管中, 其中含有预热 hPSC 介质。
- 用1毫升 hPSC 培养基冲洗油井, 并将洗涤介质添加到15毫升锥形离心管中。
- 在 300 x g 离心单细胞悬浮液5分钟, 抽吸细胞颗粒, 并在1毫升预热的 hPSC 培养基中重悬。
- 使用血细胞计数器或自动单元格计数器计数单元格。
- 从24孔中取出 LN-521 涂层溶液 (0.55 µg/厘米2), 并在1.2.3 中添加 hPSC 介质。
- 板 FF hPSCs 到0.55 µg/厘米2 LN-521 涂层24孔在细胞密度 4万-5万细胞/厘米2。
- 在传代后的次日更换培养基与新鲜 hPSC 培养基, 此后每隔一天除外星期日。
- 当培养达到 > 85% 融合时, 细胞已准备好用于传代后3-4 天的分化。为确保 hPSCs 的高品质, 请参考以前作品18、24、25中详细描述的表征方法。建议仅在 FF 系统中使用单单元传代 hPSCs 到通道级别15的区域性, 以避免核型更改。仅使用高质量、未分化的 hPSCs 作为起始材料进行分化。
2. hPSC LESCs 的定向分化和冷冻保存
- 准备
- 制备异种基感应培养基 (基底感应培养基): 补充杜尔贝科的改良老鹰培养基 (特别是挖空 DMEM) 与15% 异种游离血清置换 (spesifically CTS 淘汰赛 SR XenoFree), 2 毫米 l-谷氨酰胺, 0.1 毫米 2-巯基乙醇, 1% 非必需氨基酸和 50 U/毫升青霉素-链霉素。在两周内使用基底感应培养基。
- 在悬浮培养中制备角膜诱导培养基。
- 日 1: 补充基础感应培养基与5微米 blebbistatin。
- 日 2: 补充基底诱导培养基与10µM SB-505124 和 50 ng/毫升人碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)。
- 日 3-4: 补充基底诱导培养基与 25 ng/毫升骨形态发生蛋白 4 (BMP-4)。
- 为贴壁培养制备角膜上皮分化培养基 (分化培养基, 特别是 CnT-30): 根据制造商的说明添加基培养基中的补充剂, 加入50毫升青霉素-链霉素。
注: 微分培养基配方对光线敏感。在补充日期的6周内使用补充分化培养基。 - 大衣100毫米组织培养皿贴壁分化 (见步骤 2.3), 混合物5µg/厘米2人胎盘胶原 iv (列 IV) 和0.5 µg/厘米2 LN-521 稀释在 1x DPBS 包含 Ca2 +和 Mg2 +, 在总每碟涂装量为5毫升。按照1.1.1.3 中的描述, 准备并储存与 IV 和 LN-521 的涂层。
-
第一步: 悬浮培养中的角膜诱导
- 预热所有需要的材料和试剂在层流罩中 RT。
- 按照步骤1.3 中的指示, 分离 FF hPSCs 到单细胞悬浮液, 异种游离胰蛋白酶-EDTA. 2.1–1.3. 2.6。计数细胞, 并分配 2-3x106细胞每低附件6孔板井, 在总容积3毫升的基底诱导培养基补充5微米 blebbistatin 诱导 EB 形成过夜在37摄氏度, 5% CO2 (天 1)。
- 第二天 (2 天), 取出培养基, 用3毫升基底感应培养基代替, 辅以10µM SB-505124 和 50 ng/毫升 bFGF。
- 在接下来的两天 (天 3–4), 去除培养基和替换3毫升的基础感应培养基补充 25 ng/毫升 BMP-4。
- 第二步: 贴壁培养中的角膜分化
- 预热所有需要的材料和试剂在层流罩中 RT。
- 在5天, 将 EBs 板下到100毫米组织培养皿上涂有5µg/厘米2的 IV 和0.5 µg/厘米2 LN-521。
- 从100毫米组织培养皿中取出涂层溶液, 每道菜添加10毫升预加热的分化培养基。
注意: 不要让盘子干燥, 因为 LN-521 会在干燥时禁用。 - 通过移液将 EBs 从一个6孔板井转移到两到三 100 mm 组织培养皿 (大约 50 EBs/厘米2)。通过轻柔摇动均匀分布 EBs。
- 从100毫米组织培养皿中取出涂层溶液, 每道菜添加10毫升预加热的分化培养基。
- 保持贴壁培养的细胞在37摄氏度, 5% CO2, 更换培养基与10毫升新鲜分化中等三次每周 (在星期一, 星期三和星期五) 下2.5–3周。定期检查细胞, 以形成正确的上皮形态使用相对比显微镜。
- 步骤三: 低温银行 hPSC 衍生 LESCs
- 预加热所有所需的材料和试剂在层流罩中 RT, 除了应预冷的冻存培养基。
- 分离 hPSC 派生的 LESCs 与异种游离胰蛋白酶-EDTA 和计数的细胞, 在步骤1.3 中的 FF hPSCs 的指示. 2.1–1.3. 2.6, 但使用分化培养基。
注: 对于 hPSC 衍生 LESCs, 异种胰蛋白酶-EDTA 的最佳孵育时间较长 (约5分钟)。使用3毫升无异种胰蛋白酶-EDTA 和定义胰蛋白酶抑制剂每100毫米菜。 - 计数细胞后, 重复离心5分钟, 在 300 x g, 吸液和重悬细胞颗粒在预冷, 无异种的 hPSC 冷冻保存培养基。将单细胞悬浮液移入 cryotubes, 使每个 cryotube 在1毫升冷冻保存培养基中包含0.5 至 1 x 106细胞。
- 将管子放入冷冻容器中, 并在一夜之间立即 (5 分钟以内) 转移至-80 摄氏度。
- 第二天, 将管子输送到液氮中, 长期贮存。
- 步骤 IV: 解冻冻存 hPSC-LESCs
- 解冻前, 用5µg/厘米2列和0.5 µg/厘米2 LN-521 涂上盘子/孔板。
- 预热所有需要的材料和试剂在层流罩中 RT。
- 从盘子/水井中取出涂层溶液, 并添加适当体积的预加热分化培养基。
注意: 不要让盘子干燥, 因为 LN-521 会在干燥时禁用。 - 在 RT 中快速解冻细胞, 并立即将细胞悬浮液转移到含有5毫升预热分化培养基的15毫升锥形离心管中。
- 离心细胞悬浮液5分钟, 在 300 x g, 抽吸, 并在分化培养基中重悬颗粒, 去除任何保存培养基。
- 将细胞印在盘子/水井上涂上5µg/厘米2列 IV 和0.5 µg/厘米2 LN-521, 在分化培养基中密度为 4万-5万细胞/厘米2。保持细胞在37摄氏度, 5% CO2, 取代分化培养基每周三次。
3. hPSC 衍生 LESCs 的分型
- 定性免疫荧光分析
- 对于免疫荧光, 涂层24或12孔板井与5µg/厘米2的 IV 和0.5 µg/厘米2 LN-521 和板块/解冻 hPSC-LESCs 在分化培养基在密度 40 000–50 000 细胞/厘米2。
- 当培养物达到融合时, 用4% 多聚甲醛 (PFA) 修复细胞: 用 1x DPBS 洗涤水井两次, 不含 Ca2 +和 Mg2 +, 孵育15-20 分钟, 4% PFA 在 RT。之后, 用 1x DPBS 洗涤两次, 除去任何 PFA 残留物。每井使用 0.5-1 毫升的溶液。
注: 固定细胞在染色前长达一周, 可在 1x DPBS 中储存4摄氏度。
注意: PFA 有毒且具有腐蚀性。在烟雾罩中处理 PFA, 佩戴防护服、护眼和手套。 - 1x DPBS 和 permeabilize 细胞膜通过孵育10-15 分钟, 0.1% X-100 在 1x DPBS 中进行孵化。
- 吸0.1% 卫 X-100 和阻断非特异性抗体结合位点, 孵育1小时, 3% 牛血清白蛋白 (BSA) 在 1x DPBS 在 RT. 在 1x DPBS 中制备 0.5% BSA 中的原发性抗体稀释。
注: 有关推荐的主要抗体, 请参见表 1 。 - 吸出 3% BSA, 并在4摄氏度的夜间用适当稀释的原抗体孵育。
- 用 1x DPBS 洗涤油井 3x 5 分钟。在 1x DPBS 中制备 0.5% BSA 的二次抗体稀释。
注: 有关推荐的二抗抗体, 请参见表 1 。 - 吸 1x DPBS, 并与适当的稀释的二抗, 在 RT 1 小时孵育, 保护从光。
注意: 从这一步起, 保持样品免受光线的影响, 以防止荧光染料褪色。 - 用 1x DPBS 和最后复核与 4 ', 6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI) 和安装荧光安装介质来洗涤油井 3x 5 分钟。DAPI 可以根据制造商的说明单独使用, 也可在安装介质中包含。将圆形盖玻片 (分别为12和24孔板直径为19毫米和13毫米)。按照制造商关于干燥和储存所装样品的说明进行操作。
- 用荧光显微镜成像染色细胞。
- 定量免疫荧光分析
- 在物体眼镜上准备 hPSC 衍生 LESCs 的 cytospin 样品。
- 分离 hPSC 衍生 LESCs 与异种游离胰蛋白酶-EDTA 和计数细胞, 如步骤2.4.2 中的指示。
- 计数后, 添加预冷 1x DPBS 和离心机5分钟在 300 x g. 根据制造商对给定 cytocentrifuge 的说明调整样品体积和细胞浓度,例如5万-10万个样品体积为150µL 的细胞。
- 将细胞向下旋转到目标玻璃上, cytocentrifuge如5 分钟, 28 x g, 并立即修复15-20 分钟, 4% PFA 1x DPBS 在 RT。有关推荐的纺纱时间和速度, 请参阅给定 cytocentrifuge 的说明书。
- 按照步骤3.1 中所述继续染色 cytospin 样品. 3–3.1. 8 使用液体阻滞笔将样品与疏水圈环绕, 并在液滴中进行染色, 以实现经济实践。洗涤可以在带有滑动支架的容器中进行, 以确保有效去除过量抗体和最小的背景染色。复核与 DAPI 和安装染色样品与荧光安装介质, 覆盖与盖玻片。按照制造商关于干燥和储存所装样品的说明进行操作。
- 使用荧光显微镜的10X 放大倍率, 从随机选择的位置捕获每个样本的5–10图像。
- 估计正染色细胞与总 (DAPI 阳性) 细胞的百分比,例如使用 ImageJ 图像处理和分析软件 (https://imagej.nih.gov/ij/) 工具。优选分析每样样品 > 500 细胞。
- 打开要在 ImageJ 软件中分析的图像。使用默认高斯模糊复制图像和滤镜以移除杂色。
- 创建阈值。调整阈值以优化选择阳性染色细胞核, 并应用。复制的图像现在转换为二进制视图。
- 处理二进制图像与二进制处理工具 "填充孔" 和 "分水岭", 这将自动分隔代表单个原子核的合并区域。
- 使用 "分析粒子" 工具自动将感兴趣的区域 (ROIs) 列出到 ROI 管理器窗口, 这将在应用命令时打开。关闭二进制图像。
- 通过在 ROI 管理器中选择 "全部显示", 可视化原始图像中的 ROIs。确认染色细胞核的正确选择, 如果需要, 手动删除并添加个别选择。
- 在物体眼镜上准备 hPSC 衍生 LESCs 的 cytospin 样品。
- 流式细胞术分析
- 要确认 p63α表达水平, 请为流式细胞仪染色细胞。
- 分离 hPSC 衍生 LESCs 与异种游离胰蛋白酶-EDTA 和计数细胞, 如步骤2.4.2 中的指示。
- 用1毫升预冷 1x DPBS 和离心机洗涤细胞两次, 5 分钟, 300 x g. 固定和 permeabilize, 可随时使用的固定/透化解决方案, 20 分钟4摄氏度。随后用1毫升预冷 1x permeabilizing 洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
注意: 从这一步起, 保持细胞在4摄氏度或冰上, 除非另有说明。 - 注意: 固定/透化溶液含有4.2% 甲醛。在烟雾罩中处理危险的溶液, 佩戴防护服、眼睛保护和手套。
- 将样品分成5毫升聚丙烯管。每个样品应包含100,000–200,000 细胞和样品体积应调整到大约100µL 1x 洗涤缓冲液。
- 添加2µL 荧光染料共轭 p63-α流化抗体 (推荐抗体, 见设备和材料表) 到样品管中。留下一个样本未染色作为负控制。在 RT 中涡旋样品, 孵育1小时, 免受光线的保护。
- 用1毫升预冷1x 洗涤缓冲液洗涤细胞两次, 最后用300µL 缓冲液重悬颗粒。将管子储存在冰上, 保护光线。
- 用流式细胞仪分析样品。使用未染色阴性对照样本对正确的细胞种群进行浇口, 并排除荧光背景信号。至少分析1万个 p63-α染色的细胞。有关详细的技术实施, 请参阅给定流式细胞仪的用户手册。
- 要确认 p63α表达水平, 请为流式细胞仪染色细胞。
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Representative Results
从 hPSCs 到 hPSC-LESCs
从诱发 FF hPSCs 到 cryostoring hPSC LESCs 的整个过程大约需要3.5 周。图 1A给出了突出其关键步骤的微分方法的原理图概述。图 1B显示了协议不同阶段细胞种群的典型形态。所提供的数据采用 Regea08/017 人类胚胎干细胞线和 04607. WT hiPSC 线, 在芬兰坦佩雷大学获得和表征, 如前26、27、28所述。
在 hPSC 培养基的 LN-521 中, 未分化、高品质的 FF hPSCs 首先形成具有锋利边缘的截然不同的菌落, 在汇流处合并成均匀的单层膜 (图 1B, 第一图像)。该系统成功地适应和培养了几种个体衍生和基因上截然不同的人类胚胎干细胞和 hiPSC 线。FF hPSC 种群在每条通道内相乘约3倍, 提供稳健的方法来生成异种和无馈线起始材料的差异25。EB 介质中的 24 h 感应通常会产生不同尺寸的紧、常规 EBs 的悬挂 (图 1B、第二个图像)。在悬浮液 (日 2–4) 的表面外胚层诱导过程中, EB 形态不应发生显著变化。当 EBs 被电镀到 IV/LN-521 组合矩阵 (图 1B、第三和第四图像), 并在21–25天内分化细胞形成汇合均质层后不久就会出现殖民生长。典型的上皮细胞的多边形形态学 (图 1B, 第五图像)。然后, 细胞可能被冷冻供以后使用。hPSC-LESCs 解冻后, 活性和形态学保存完好 (图 1B, 最后的图像)。
通常情况下, 3 x 106 FF hPSCs 电镀到一个6孔板产生足够的 EBs 被电镀在细胞培养皿中的贴壁培养 (100 毫米)。从每个100毫米的菜, 1 到 1.5 x 106细胞可能被收获的 cryobanking 的一天22–25的分化。平均而言, 每个未分化的 FF hPSC 在25天内生成0.7 个细胞 (图 2)。
hPSC 衍生 LESCs 的验证
在缺乏特定的 LESC 标记蛋白的情况下, 用一组标记证实了正确的细胞表型, 表明多能性相关蛋白的表达减少, 并增加了公认 LESC 标记的表达。在24天的分化, 绝大多数的 hPSC 衍生 LESCs 快速配对盒蛋白 PAX6 (PAX6), 眼睛发展的关键调节器, 以及 p63α, 被广泛认可的 LESC 标记。截断的 p63-isoform ΔNp63 在大多数 p63α-positive 细胞中共同表达, 证实了最具角膜特异性的ΔNp63α阳性细胞表型。基底上皮标志物和假定 LESC 标记细胞角蛋白 (CK)-15 和 CK-14 在部分表达, 而多潜能干细胞标记 OCT3/4 和成熟的角膜上皮标记 CK-12 在这一点上是无法察觉的。这表明 FF hPSCs 对干细胞角膜缘上皮祖细胞的分化, 但尚未分化为成熟的角膜上皮干细胞。(图 3A)hPSC-LESCs 在从 cryostorage 恢复后成功保留其表型 (数据可与图 3A相媲美)。
在24天的分化后, ΔNp63 被表达在 66.2% (n=33, sd 9.3%) 的 Regea08/017 人类胚胎干细胞-LESCs, 并在 65.7% (n=10, sd 4.1%)04607. WT hiPSC-LESCs (从 cytospin 样品中定量,图 3B)。从 cryostorage 恢复后, 82.2% (n=10, sd 5.7%) 的人类胚胎干细胞 LESCs 和 90.5% (n=10, SD = 3.7%) hiPSC LESCs 表示ΔNp63 (定量从井板在日 26–28,图 3B)。
Regea08/017 人类胚胎干细胞 LESCs 的流式细胞术分析进一步证实了 p63α表达。在分化的25天, 62% 的新鲜分化的 hPSC LESCs 是阳性 p63α。从 cryostorage 恢复后两天 (总共28天), 81% 的细胞被 p63α-positive (图 3C)。
图 1: hPSC-LESC 微分协议 (A) 的原理图和在过程的不同阶段观察到的典型细胞形态 (B).EBs 是由一个单一细胞悬浮的高品质, 未分化的 hPSCs 在第一个24小时内形成的. 三天小分子诱导对表面外胚层的悬浮液, 其次是贴壁分化阶段。在24天的分化, 大多数细胞显示典型的 LESC 样形态。Regea08/017 人类胚胎干细胞线在分化之前和期间显示的代表性图像。黑色刻度条 = 200 µm, 适用于面板中的所有图像。缩写: Blebb: blebbistatin, SB: SB-505124 小分子抑制剂, bFGF: 碱性成纤维细胞生长因子, BMP-4: 骨形态发生蛋白 4, LN-521: 人重组层粘连蛋白 521, iv.: 人胎盘胶原 iv 型, hPSC: 人多潜能干细胞, EB: 胚状体体, LESC: 角膜缘上皮干细胞。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 预期的细胞产量.当显示 cryostoring 的22-25 天获得的细胞数量, 除以0天的 EB 形成步骤的未分化 hPSCs 的数量。平均 0.72 (sd 0.4) 细胞从每个多潜能 Regea08/017 人类胚胎干细胞生产, 而 0.78 (sd 0.67) 细胞是从每一个塔生产. 04607. WT hiPSC。n: 分化实验的数量。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图3。hPSC 衍生 LESCs 的预期表型.免疫荧光抗体标记 (A) 显示眼部发育调节器的均匀表达 PAX6 和公认的 LESC 标记 p63α及其ΔNp63 异构体, 以及其他两个建议的 LESC 标记-CK15 和14。多能性标记 OCT3/4 和成熟的角膜上皮标记 CK-12 为阴性。代表如果图像显示为 Regea08/017 人类胚胎干细胞-LESCs 在24天的差异。比例尺 = 100 µm. (B) ΔNp63 细胞计数从新鲜分化和冷冻 hPSC-LESCs 表明细胞不仅保留, 但在ΔNp63 后显示增加的 cryostorage 表达式。细胞计数结果显示 > 65% 的新鲜分化的 hPSC LESCs 染色阳性ΔNp63 前 cryobanking 程序, 和 > 80% 成功恢复后。n = 单独分化实验的数量 (至少每样本计数600个细胞, 每时间点 > 1600 细胞) (C) 流式细胞术分析显示62% 的新鲜分化的 hPSC LESCs 和81% 的解冻细胞阳性 p63α,确认线 Regea08/017 的细胞计数结果。* 在 b-C 表示解冻的细胞。用于阳性样品的红色直方图和阴性 (未染色) 样品的黑色。请点击这里查看这个数字的更大版本.
| 抗体 | 主机 | 稀释 |
| 原发性抗体, 如果 | ||
| PAX6 | 兔 | 1:200 |
| p63α | 鼠标 | 1:200 |
| ΔNp63α | 兔 | 1:200 |
| CK-15 | 鼠标 | 1:200 |
| CK-14 | 鼠标 | 1:200 |
| CK-12 | 山羊 | 1:200 |
| OCT3/4 | 山羊 | 1:200 |
| 二抗 IF | ||
| Alexa 福陆568抗山羊 Ig | 驴 | 1:800 |
| Alexa 福陆568反老鼠 Ig | 驴 | 1:800 |
| Alexa 福陆488抗兔 Ig | 驴 | 1:800 |
| Alexa 福陆488反老鼠 Ig | 驴 | 1:800 |
表 1: 推荐用于免疫荧光 (IF) 标记 hPSC 衍生 LESCs 的主要和二级抗体.请参阅制造商的材料表。
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Discussion
该协议的预期结果是在大约3.5 周内从 FF hPSC 的单个电池悬浮液中成功和稳健地生成 LESCs。由于角膜上皮发育从表面外胚层29, 该议定书的第一步旨在指导 hPSCs 走向这一血统。24 h 诱导与转化生长因子β (SB-505124) 拮抗剂, 和 bFGF 用于诱导外胚层分化, 其次 48 h 中胚层 BMP-4 提示推动细胞朝向表面外胚层。将 IV/LN-521 组合矩阵的以下贴壁分化步骤与化学定义的分化培养基结合在一起, 进一步引导分化为 LESCs。
高品质的起始材料 (FF hPSCs) 是成功分化的关键。只有 FF hPSC 的区域性与近汇流和接近100% 的未分化表型应使用。建议使用常规的 hPSC 核型分析, 因为单细胞传代可使 hPSCs 核型异常, 从而导致生长和分化优势30。长时间接触胰蛋白酶可能导致 EB 形成不足或 hPSC 死亡。该协议通过五个单独衍生的和基因上不同的 hPSC 线 (人类胚胎干细胞和 hiPSC 线) 进行了测试。不需要对小分子浓度或诱导时间进行特定的细胞系修饰。然而, 在该协议的初始优化, 过量细胞死亡或细胞的出现与成纤维细胞, 神经元或其他形态学表明分化到不需要的血统。在这种情况下, 该方法可能需要微调。培养容器格式提供了一个起点, 可以从建议的大小画质。
从 hPSC 文化到 LESC 分化和冷冻保存的整个协议定义, 允许轻松过渡到良好的生产实践 (GMP) 生产的细胞治疗产品。由于商业媒体和试剂经过稳健的开发、制造和质量控制程序, 它们为 hPSC 文化和分化提供了一致、统一的质量平台。定义的条件最小化批次到批次的变化, 这比现有的 hPSC LESC 差分协议10、11、12、13、14具有优势,20,22,23. 快速和相对简单的协议还提供了超过三维角膜 organoids 的优势, 这在细胞系和实验室中难以标准化, 需要可靠的方法来纯化所需的细胞类型31 ,32。此外, 高效的协议提供了强大的手段来生产 LESCs 的研究目的,如疾病建模, 基因工程, 药物筛选和毒理学测试。此外, 该平台可以很容易地微调, 以分化其他眼上皮细胞类型, 如视网膜色素上皮细胞 (RPE 细胞)25。
成功的角膜缘细胞置换治疗只需要几个千 p63-positive LESCs4, 每只眼睛, 但质量保证需要额外的细胞种群, 因此大规模生产。Cryobanking 允许为移植准备现成的细胞储存, 以及进行质量和安全测试。此外, hPSC LESC 纯度改善后 cryostoring, 并进一步后传代和延长的文化25, 如增加ΔNp63 表达的建议。
总之, 这种稳健的方法在异种和馈线无细胞培养条件下, 在3.5 周内从 hPSCs 生成ΔNp63α阳性细胞。这里提供的细胞培养方法使生产高质量 LESCs 适用于眼细胞治疗使用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该研究得到了芬兰科学院 (赠款297886号)、特克斯的人力备件计划、芬兰技术和创新资助机构、芬兰眼和组织银行基金会以及芬兰文化基金会的支持。作者感谢生物医学实验室技术人员我 Melin、汉娜 Pekkanen、艾玛维克斯泰特和我 Heikkilä为卓越的技术援助和对细胞培养的贡献。Katriina 教授 Setälä被公认为提供用于荧光成像设备的 hiPSC 线和普司通成像核心设施。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
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