Summary
このプロトコルは、xeno ・ フィーダー細胞フリー培養条件下でのひと多能性幹細胞から角膜輪部上皮幹細胞の差別化のための単純な 2 段階法を紹介します。ここで示した細胞培養法は、医療の質細胞、角膜上皮細胞療法の使用に適用される低コスト大量生産を有効にします。
Abstract
角膜輪部上皮幹細胞 (LESCs) は、角膜上皮を継続的に更新し、角膜の恒常性と映像の明瞭さを維持します。ひと多能性幹細胞 (hPSC)-派生 LESCs 角膜細胞補充療法の有望な細胞供給源を提供します。未定義、異種文化および分化条件は研究結果の変動を引き起こすし、hPSC から派生した治療の臨床の翻訳を妨げます。このプロトコルは、xeno ・ フィーダー細胞由来無細胞の条件の下で hPSC LESC 分化の再現性と効率的な方法を提供します。まず、組換えラミニン 521 (LN-521) と定義されている hPSC の中で画一的な hPSC の単層培養分化の高品質原料の生産のための基盤として提供しています。第二に、簡易 hPSC LESC 微分法は、わずか 24 日間で LESC 集団を生成します。このメソッドには、定義された角膜上皮分化培地での IV 型コラーゲン LN-521/組み合わせで付着性文化相が続く、小分子と懸濁液中 4 日表層外胚葉誘導が含まれています。Cryostoring と拡張分化さらにセル人口を浄化し、細胞療法製品の大量に細胞の銀行を有効にします。結果として得られる高品質の hPSC LESCs は、輪部幹細胞欠乏症 (LSCD) を治療するために角膜の表面再構成のための潜在的な新規治療戦略を提供します。
Introduction
眼表面で透明な角膜、網膜に入力する光と目の屈折力の大半を提供できます。最も外側の層は、重層の角膜上皮は、輪部上皮幹細胞 (LESCs) によって継続的に再生成されます。LESCs はして角膜ジャンクション1,2輪部のニッチの基底層に存在します。LESCs は、同定推定マーカーの一連のより広範な分析が必要ですので、具体的かつユニークなマーカーを欠いています。上皮性転写因子 p63、特に N 末端切り捨てられた謄本 p63 のアルファのアイソ フォーム (ΔNp63α) は、関連する肯定的な LESC マーカー3,4として提案されています。LESCs の非対称分裂自己更新しますが、また centripetally と前方移行子孫を生成することができます。セルに向かって前進する角膜の表面に徐々 に自分の幹細胞性を失うし、最終的に末期患者が継続的に角膜の表面から失われる表層の扁平上皮細胞に区別するため。
重度の視覚障害につながることができますいずれかの角膜の層への損傷と角膜欠損を世界的な視野の損失の導く原因の 1 つ。輪部幹細胞 (LSCD) の欠乏症で、角膜が病気や conjunctivalization や角膜の混濁、ビジョン5,6のそれに続く損失につながる外傷によって破壊されました。自家および同種の輪部移植を用いた細胞補充療法は、LSCD4,7,8,9症例に対する治療戦略を提供しています。健康な眼に合併症のリスクを負う自家移植を収穫し、ドナー組織が不足します。ひと多能性幹細胞 (hPSCs)、ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs)、具体的には、臨床的に関連する細胞の種類、角膜上皮細胞を含む無制限のソースとして使用できます。したがって、hPSC から派生した LESCs (hPSC-LESCs) は、眼セル置換療法のための魅力的な新しい細胞ソースを表します。
伝統的に、未分化 hPSC 培養法とその微分のプロトコル LESCs に未定義のフィーダー細胞、動物血清、エアコンのメディア、または羊膜10、11,の使用に依存しています。12,13,14,15. 最近、細胞療法製品を安全への取り組みより標準化された、無料の異種文化および分化プロトコルの検索を求めています。その結果、画一的な hPSCs の長期培養定義、xeno 無料方法はいくつかは、市販16,17,18をされます。連続体、角膜上皮の運命に hPSCs を誘導する分子手掛かりに依存するプロトコルが最近されている分化紹介19,20,21,22、 23。まだこれらのプロトコルの多くは材料、または分化のための複雑な異種の成長因子カクテルを開始としてどちらかの未定義、フィーダー ベースの hPSCs を使用しました。
このプロトコルの目的は、信頼性の高い、最適化された、xeno を提供するために-hPSC のフィーダー フリー培養法と角膜 LESCs へのそれに続く分化。ラミニン 521 (LN-521) 行列 (具体的には不可欠な 8 フレックス) 定義、アルブミン無料 hPSC 中に多能性 hPSCs の単層培養により分化の均質な出発物質の迅速な生産ができます。その後、単純な 2 段階差別化戦略は懸濁液、LESCs に、付着性の分化に続く表面の外胚葉運命に向かって hPSCs をガイドします。> 65% が ΔNp63α を表現する細胞集団は 24 日以内に取得されます。Xeno とフィーダー フリー プロトコルは、セルの行の特定の最適化の必要はなく、いくつかの hPSC ライン (hESCs と hiPSCs の両方) のテストされています。週末無料メンテナンス、継、cryostoring、hPSC LESC フェノタイピングここで説明のためのプロトコルのための高品質 LESCs の大規模なバッチの生産を有効に臨床や研究の目的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
タンペレ大学は、ヒト胚の研究を実施するフィンランド (Dnro 1426/32/300/05) 法医学的事務局の承認です。研究所では、派生、文化、および悪名高くライン (Skottman/R05116) を差別化して眼の研究 (Skottman/R14023) によるラインに使用するピルカンマー病院地区の倫理委員会の支持のステートメントもあります。この研究のため派生した新しい細胞ラインはありません。
注: 説明されたプロトコルは、特定の市販 hPSC 角膜上皮分化等に基づいています。材料表、メーカー/サプライヤーの情報、カタログの数を参照してください。
1. Xeno とフィーダー フリー hPSC 文化を確立します。
- 準備
- 人間遺伝子組換えラミニン 521 (LN-521) 24 ウェル プレートをコートします。最初の無料のフィーダー (FF) 通過のため次の通路を 1.09 μ g/cm2の濃度、0.55 μ g/cm2 LN 521 を使用すること。推奨の LN 521 濃度 FF 培養に成功の出発点として役立つが、下げることができます。
- 製造元の指示に従って、4 ° C でゆっくり LN 521 バイアルを解凍します。
注意: LN 521 ソリューションを適切に処理が 4 ° C で融解後 3 ヶ月間保存可能性があります。 - コーティング液を準備するには、と 1 x ダルベッコ Phosphate-Buffered 生理食塩水 (DPBS) Ca2 +と Mg2 + 300 μ L/ウェルの容量を含む LN 521 原液の適切な量を希釈します。
- ピペット、井戸にコーティング液、パラフィルムでウェル プレートを封印し、4 ° C で一晩インキュベートコーティング プレートは、最大 2 週間までの 4 ° C で保存されるかもしれない。
(省略可能): また、急速なコーティング プロトコルの 37 ° C、5% CO2で 2 h のコーティング液をよく板をインキュベートします。
- 製造元の指示に従って、4 ° C でゆっくり LN 521 バイアルを解凍します。
- 製造元の指示に従って、指定されたサプリメントを基礎培地を継ぎ足すことによって hPSC 培地 (具体的には不可欠な 8 フレックス) を準備します。50 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシンを追加します。策定が光や高温に敏感であることに注意してください。サプリメントを解凍し、室温 (RT)、光から保護されているメディアを暖めます。補充の日から二週間以内補われた hPSC 培地を使用します。
- 人間遺伝子組換えラミニン 521 (LN-521) 24 ウェル プレートをコートします。最初の無料のフィーダー (FF) 通過のため次の通路を 1.09 μ g/cm2の濃度、0.55 μ g/cm2 LN 521 を使用すること。推奨の LN 521 濃度 FF 培養に成功の出発点として役立つが、下げることができます。
- LN-521 上、hPSC を FF 文化に転送する.
- すべての必要な材料および試薬 RT の層流フードのウォーム アップ済み。
- 送り装置の層 (例えば不活化ひと包皮 (hFF) またはマウス胚性線維芽細胞) の標準的な文化システムまたは標準的な方法を使用して他の FF 文化システムから hPSCs を通過。たとえば、hFF フィーダー細胞上で培養した hPSC のコロニーはメスと小さな断片と針の先端と切り離し部分に解剖できます。FF 文化システムを使用して培養された人間の Psc は、法以前の酵素処理の有無を継クラスターを使用して転送できます。
- 24 井戸から LN 521 コーティング ソリューションを削除し、ウェルあたり 1 mL に予め温めておいた hPSC 媒体を追加します。
注: は、LN 521 が乾燥時に不活化として乾燥する井戸は認めません。 - LN-521 コーティング 24 ウェル ピペットと hPSC 培地でコロニー作品/セルのクラスターに転送します。20-30 コロニー個井戸、井戸の混雑を回避するを転送します。
- 転送とその後にすべての他の日の後日 1 ml hPSC 媒体の媒体を交換します。文化は継 3-4 日間の hPSCs を滑らかな、画一的な形態を持つコロニーに成長しているので、後で準備ができています。参考までに、図 1 bを参照してください (最初のイメージ)。最初の FF 通路コロニーは完全にコンフルエント単層成長することができませんが、植民地が 1 mm のおおよそのサイズに達したら、文化が継代する必要があります。
- 継と FF hPSC 文化の保守
- すべての必要な材料および試薬 RT の層流フードのウォーム アップ済み。
- 2 番目の FF 箇所以降から文化が 80-100% の confluency に達したら FF hPSCs を通路します。新しい LN 521 に通路 FF hPSCs は、画一的な形態を持つ高品質の文化を維持するために、栄養療法の無料の週末を達成するために単一細胞継週 2 回 (月曜日と木曜日) を使用して 24 ウェル プレートをコーティングしました。詳細については、18,24,25を参照してください。
- Ca2 +と Mg2 +なし 1 x DPBS 1 mL で 2 回 FF hPSCs をすすいでください。
- 37 ° c、5% CO2ウェルあたり 500 μ L インキュベーターで xeno 無料トリプシン - edta (TrypLE 選択酵素特に) FF hPSCs をデタッチします。最適な培養時間、ラウンド アップ、デタッチには細胞を許可します。通常は 3 分の 37 ° C、5% CO2が、(5 分を超えていない)。
- Xeno 無料トリプシン-EDTA を削除し、すぐに定義済みのトリプシン ・ インヒビターの井戸あたり 500 μ L を追加します。
- 慎重、まだ徹底した単一細胞懸濁液を得るにピペッティングして FF hPSCs をデタッチします。予め温めておいた hPSC 媒体を含んでいる 15 mL コニカル遠心管に 40 μ m セル ストレーナー FF hPSC サスペンションを転送します。
- HPSC 培地 1 mL で洗浄し、洗浄媒体を 15 mL の円錐形遠心管に追加します。
- 300 × g で 5 分間単一細胞懸濁液を遠心分離、細胞ペレットを吸引、1 mL に予め温めておいた hPSC 媒体で再懸濁します。
- 検定または自動化された細胞カウンターにセルをカウントします。
- 24 井戸から LN 521 コーティング溶液 (0.55 μ g/cm2) を削除し、1.2.3 のように hPSC 媒体を追加します。
- 0.55 μ g/cm2 LN 521 に板 FF hPSCs は、24 ウェル 40,000-50,000 セル/cm2のセルでコーティング。
- 媒体を通過、翌日とその後日曜を除く毎日新鮮な hPSC 中に置き換えます。
- 細胞分化に文化が達したとき、通過後 3-4 日を使用する準備ができている > 85% の confluency。HPSCs の高品質の確保、前作品18,24,25でくわしく説明評価方法を参照してください。通過レベル 15 までしか文化 hPSCs には、継核型の変更を避けるために単一のセルを使用して FF のシステムにそれをお勧めします。だけ分化の出発原料として高品質、未分化の hPSCs を使用します。
2. 監督の分化と hPSC 由来 LESCs の凍結保存
- 準備
- 基底 xeno 無料誘導培地 (基底誘導培地) を準備: サプリメント ダルベッコ修飾イーグル培地 (特にノックアウト DMEM) 15% 血清の xeno 無料交換 (spesifically CTS ノックアウト SR XenoFree), L-グルタミン, 2 mM 0.1 mM 2-メルカプトエタノール、1% 非本質的なアミノ酸、および 50 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン。2 週間以内基底誘導培地を使用します。
- 懸濁培養角膜誘導メディアを準備します。
- 1 日目: 5 μ M blebbistatin と基底誘導培地を補足します。
- 2 日目: 10 μ M SB 505124 と 50 ng/mL ひと塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF) と基底誘導培地を補足します。
- 3-4 日目: サプリメント基底誘導媒体 25 ng/mL 骨形成タンパク質 4 (BMP-4)。
- 付着性文化の角膜上皮分化培地 (分化培地、特に CnT 30) を準備: 製造元の指示に従って基礎培地にサプリメントを追加し、50 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシンを追加。
注: 分化中の定式化は、光に敏感です。補充日から 6 週間以内の補われた分化培地を使用します。 - 付着性の差別化のため 100 mm ティッシュの培養皿をコート (手順 2.3 参照) 混合物 5 μ g/cm2ひと胎盤コラーゲン type IV (col IV) と 0.5 μ g/cm2 LN 521 含む Ca2 +と Mg2 +合計で 1 x DPBS で希釈しました。皿あたり 5 mL の容積をコーティングします。準備し、col IV とコーティングで、LN 521 1.1.1.3 で説明したように格納します。
-
手順 i: 懸濁培養における角膜誘導
- すべての必要な材料および試薬 RT の層流フードのウォーム アップ済み。
- 手順 1.3.2.1–1.3.2.6 の指示通り、xeno 無料トリプシン-EDTA と単一細胞懸濁液に FF hPSCs をデタッチします。セルをカウントし、37 ° c、5% CO2 (日 1) EB の形成を誘導する 5 μ M blebbistatin を添加した基底誘導培地 3 mL の容量で一晩よく、6 ウェル プレート低添付ファイルごとの 10 の6セル × 2 3 を配布します。
- 次の日 (2 日)、メディアを取り出して、3 ml の 10 μ M SB 505124 と 50 ng/mL bFGF 基底誘導培の取り付けです。
- 次の 2 日間 (3 – 4 日)、媒体を削除し、25 ng/ml の BMP 4 基底誘導培 3 mL で置き換えます。
- 付着性文化のステップ II: 角膜の分化
- すべての必要な材料および試薬 RT の層流フードのウォーム アップ済み。
- 5 日にプレートを EBs の 5 μ g/cm2コル IV と 0.5 μ g/cm2 LN 521 コーティング 100 mm ティッシュの培養皿の上に。
- コーティング液を 100 mm ティッシュの培養皿から外し、皿ごとに予め温めておいた分化培地 10 mL を加えます。
注: は、LN 521 が乾燥時に不活化として乾燥に料理できないようにします。 - 2 つの 3 つの 100 mm ティッシュの培養皿にもワンプレート 6 ウェルから EBs を転送 (約 50 cm2あたり EBs) ピペッティングによる。穏やかな揺れで EBs を均等に配布します。
- コーティング液を 100 mm ティッシュの培養皿から外し、皿ごとに予め温めておいた分化培地 10 mL を加えます。
- 37 ° C、5% CO2次の 2.5-3 週 (月曜日、水曜日および金曜日) に週 3 回 10 ml の新鮮な分化培地の培地を交換で付着性文化の細胞を維持します。位相差顕微鏡を使用して正しい上皮形態の出現のために定期的にセルを確認します。
- ステップ III: クライオ銀行 hPSC 由来 LESCs
- すべての必要な材料および試薬 RT の中古冷蔵する必要があります凍結保存培地を除いて、層流フードのウォーム アップ済み。
- Xeno 無料トリプシン-EDTA と hPSC 由来の LESCs を外し、手順 1.3.2.1–1.3.2.6 が分化培地を使用して FF hPSCs の指示に従って、セルの個数します。
注記: hPSC 由来 LESCs、xeno 無料トリプシン-EDTA に最適な培養時間は長く (約 5 分)。100 mm ディッシュあたり xeno 無料トリプシン-EDTA と定義済みのトリプシン ・ インヒビターの 3 mL を使用します。 - カウント後セル、300 x g で 5 分間繰り返し遠心分離培地を吸引し、中古冷蔵、xeno 無料 hPSC 凍結保存培地で細胞ペレットを再懸濁します。ピペットで移しなさい単一細胞懸濁液の各 cryotube 1 mL 凍結保存培地で 0.5 に 1 x 10 の6セルが含まれるように cryotubes に。
- 一晩冷凍コンテナー ・-80 ° C をすぐに (5 分) 以内の転送にチューブを置きます。
- 次の日の長期保存用液体窒素にチューブを転送します。
- ステップ IV: 融解凍結 hPSC LESCs
- 融解、前に 5 μ g/cm2コル IV と 0.5 μ g/cm2 LN 521 料理/ウェル プレートをコートします。
- すべての必要な材料および試薬 RT の層流フードのウォーム アップ済み。
- 料理/井戸からコーティング ソリューションを削除し、予め温めておいた分化培地の適切なボリュームを追加します。
注: は、LN 521 が乾燥時に不活化として乾燥に料理できないようにします。 - RT で迅速に細胞を解凍し、予め温めておいた分化培地 5 mL を含む 15 mL 円錐形遠心チューブに細胞懸濁液をすぐに転送。
- 細胞懸濁液を遠心分離機、300 x g で 5 分間、吸引、すべて凍結保存培地を削除する分化培地でペレットを再懸濁します。
- 料理/井戸 5 μ g/cm2コル IV と 0.5 μ g/cm2 LN-521 40,000-50,000 セル/cm2の密度で分化培地でコーティングした上に細胞をプレートします。37 ° C、5% CO2週に 3 回分化培地の交換でセルを維持します。
3. hPSC 由来の LESCs の表現型解析
- 質的な免疫蛍光分析
- 蛍光抗体法のコート 5 μ g/cm2コル IV と 0.5 μ g/cm2 LN 521 とプレート/雪解け hPSC-LESCs 40 の密度で分化培地で 24 または 12 ウェル プレート井戸 000-50 000 細胞/cm2。
- 文化の confluency に到達したときは、4% パラホルムアルデヒド (PFA) のセルを修復する: 1 x DPBS Ca2 +と Mg2 +なしで 2 回洗浄し、4% で 15-20 分を孵化させなさい室温 PFAその後、任意の PFA の残基を削除する 1 x DPBS で二回洗います。まああたりソリューションの使用 0.5 1 mL。
注: 固定セルは、染色する前に最大 1 週間の 4 ° C で 1 x DPBS に格納する可能性があります。
注意: PFA は有毒、腐食性です。ヒューム フードの PFA を処理し、防護服、目の保護と手袋を着用します。 - 1 x DPBS を吸引し、0.1% と 10-15 分のための 1 x DPBS トリトン X-100 の孵化によって細胞膜を permeabilize します。
- 1 x DPBS で 0.5 %bsa の一次抗体希釈液の調製した準備で 1 x DPBS で 3% ウシ血清アルブミン (BSA) で 1 時間インキュベートし、0.1% トリトン X-100 とブロック非特異的な抗体結合部位を吸引します。
注: 推奨される一次抗体の表 1を参照してください。 - 3 %bsa を吸引、4 ° C で一晩適切に希釈した一次抗体とインキュベート
- 井戸 3 1 x DPBS 5 分 x。1 x DPBS で 0.5 %bsa の二次抗体希釈液を準備します。
注: 推奨される二次抗体のための表 1を参照してください。 - 1 x DPBS を吸引し、常温、光から保護 1 h の適切な適切に希釈した二次抗体とインキュベートします。
注: このステップから蛍光色素の退色を防ぐために光から保護されたサンプルを保ちます。 - 井戸 3 1 x DPBS 5 分、最終的に核対比染色 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と蛍光メディアのマウントとマウントのための x。DAPI は、製造元の指示に従って個別に使用または取り付け中に含まれていることがことができます。丸い coverslips (直径 19 mm と 13 mm 12 および 24 ウェル プレート、それぞれ) 各井戸。マウントされたサンプルの乾燥や貯蔵に関する製造元の指示に従ってください。
- 蛍光顕微鏡による染色の細胞をイメージします。
- 定量的免疫染色解析
- オブジェクト ガラスの hPSC から派生した LESCs の cytospin サンプルを準備します。
- Xeno 無料トリプシン-EDTA と hPSC 由来の LESCs を外し、2.4.2 のステップの指示に従って、セルの個数します。
- カウント後セルを追加中古冷蔵 1 x DPBS と 300 x g. サンプル ボリューム調整で 5 分間遠心して、例えば指定された収集の製造元の指示に従って細胞濃度 50,000-100,000 150 μ L のサンプル量で。
- オブジェクトを収集などx g と 4% と 15 〜 20 分が即座に修正プログラム 28 で 5 分メガネにセルをスピンで室温 1 x DPBS PFA推奨回転時間と速度、特定の収集の取扱説明書を参照してください。
- Cytospin サンプルを染色の手順 3.1.3–3.1.8 使用液体ブロッカー サンプルは疎水性サークル囲む行い経済的な練習のための液滴の染色ペンで説明するように進みます。抗体の過剰と最小限の背景の汚損の効率的な除去を確保するために、スライド ホルダー、容器の洗浄が行われます。対比染色 DAPI による核と蛍光カバー coverslips とメディアのマウントとステンド グラス サンプルをマウントします。マウントされたサンプルの乾燥や貯蔵に関する製造元の指示に従ってください。
- 蛍光顕微鏡の例えば10 倍の倍率を使用してランダムに選択した場所からサンプルあたり 5-10 画像をキャプチャします。
- 例えばImageJ 画像処理および解析ソフトウェア (https://imagej.nih.gov/ij/) のツール (DAPI 正) セルの総数に関連して積極的に陽性細胞の割合を推定します。できれば分析 > サンプルあたり 500 セル。
- ImageJ ソフトウェアで分析するイメージを開きます。イメージと既定ガウスぼかしとノイズを除去するフィルターを重複してください。
- しきい値を作成します。最適な積極的に染色細胞核の選択するしきい値を調整し、適用します。複製された画像はバイナリ ビューに変換されます。
- バイナリ処理と画像処理ツール「塗りつぶし穴」、「分水界」は、単一核を表す結合領域を自動的に分離されます。
- 興味 (ROIs) コマンドを適用するときに開く ROI マネージャーのウィンドウに自動的にリスト領域に「分析粒子」ツールを使用します。バイナリ イメージを閉じます。
- 「すべて表示」ROI マネージャーで選択することによって元の画像の Roi を視覚化します。染色細胞核の正しい選択を確認し、必要な場合、手動で削除し、個々 の選択を追加します。
- オブジェクト ガラスの hPSC から派生した LESCs の cytospin サンプルを準備します。
- フローサイトメトリー解析
- P63α 発現レベルを確認、フローサイトメトリー用セルを汚します。
- Xeno 無料トリプシン-EDTA と hPSC 由来の LESCs を外し、2.4.2 のステップの指示に従って、セルの個数します。
- 洗って 1 mL で 2 回セル中古冷蔵 1 x DPBS と 300 x g. 修正で 5 分間遠心分離、4 ° C で 20 分使える-固定/透過ソリューションを permeabilizeその後洗って 1 mL で 2 回細胞事前構造の洗浄バッファー x 1 を冷やしています。
注: この手順から細胞を維持で 4 ° C または氷の上別段。 - 注意: 固定/透過のソリューションには、4.2% のホルムアルデヒドが含まれています。ヒューム フードの危険なソリューションを処理し、防護服、目の保護と手袋着用します。
- 5 mL ポリプロピレン チューブにサンプルを分割します。各サンプルは、100,000-200,000 セルを含める必要があります、洗浄バッファー x 1 の約 100 μ L にサンプル ボリュームを調節する必要があります。
- 螢光色素共役 p63 α FACS 抗体 2 μ L を追加 (推奨される抗体は、表の装置および材料を参照してください) サンプル チューブに。1 つのサンプルは、ネガティブ コントロールとして無染色のままします。渦のサンプルし、光から保護された RT で 1 時間インキュベートします。
- 洗浄バッファー x 中古冷蔵 1 の 1 mL で 2 回細胞を洗浄し、最後に、バッファーの 300 μ L でペレットを再懸濁します。光から保護されている氷の上のチューブを格納します。
- 流れの cytometer でサンプルを分析します。正しいセル人口のゲートおよび蛍光バック グラウンド信号を除く、無染色のネガティブ コントロール サンプルを使用します。10,000 p63 α の最小値を分析-細胞を染色します。詳細な技術的な実装、与えられた流れの cytometer のユーザー マニュアルを参照してください。
- P63α 発現レベルを確認、フローサイトメトリー用セルを汚します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HPSC LESCs に hPSCs から
FF hPSCs cryostoring hPSC LESCs への分化誘導から全体のプロセスは、約 3.5 週間をかかります。その主な手順を強調表示微分法の概要は、図 1 aにされます。図 1 bは、プロトコルの異なるフェーズでセル人口の典型的な形態を示しています。発表データは、Regea08/017 hESC ラインと UTA.04607.WT によるライン、派生し、26,27,28を前述のようにフィンランド、タンペレ大学の特徴の両方が得られます。
LN-521 hPSC 中、上未分化、高品質 FF hPSCs は最初合流点 (図 1 b、最初のイメージ) に均質な単分子膜への差し込みシャープなエッジで明瞭なコロニーを形成します。いくつかの個別に派生と遺伝的に異なる hESC による線が正常に合わせられ、このシステムで培養します。FF hPSC 集団乗算 3 倍約 xeno を生成する強力な手段を提供する各通路内-フィーダー無料分化25の出発原料。EB 中 24 h 誘導は通常様々 なサイズ (図 1 b、2 番目のイメージ) のタイトな正規の EBs の懸濁液を生成します。懸濁液 (1 日 2-4)、表面の外胚葉誘導中に EB 形態を大幅に変更しないでください。EBs は分化培地 (図 1 b、3 番目と 4 番目の画像) にコル IV/LN-521 の組み合わせにメッキが分化の 21-25 日以内セルはの合流の均一層を形成後にすぐに植民地時代の副産物が表示されます。上皮細胞 (図 1 b、5 画像) の典型的な多角形の形態。セルし、後で使用できる cryostored があります。HPSC LESCs (図 1 b、最後の画像) を解凍後生存率と形態がよく保存されています。
通常、単一 6 ウェル プレートにメッキ 3 x 106 FF hPSCs 2-3 細胞培養皿 (100 mm) で付着性文化にメッキに十分な EBs が得られます。それぞれの 100 mm ディッシュから 1 に 1.5 x 10 の6セルは、分化の 22-25 の日 cryobanking の収穫されるかもしれない。平均して、各未分化の FF hPSC 日 25 (図 2) 0.7 セルを生成します。
HPSC から派生した LESCs の検証
特定 LESC マーカー蛋白質の不在、正しい細胞表現型を多能性の発現の低下タンパク質し、認められた LESC マーカーの発現を増加を示すマーカーのセットを確認した.分化の日 24、hPSC 派生の LESCs 特急対の大半ボックス蛋白質 PAX6 (PAX6)、p63α、広く認識されている LESC マーカーと同様に、目の開発の重要な調節因子。切り捨てられた p63 アイソ フォームの ΔNp63 は、最も角膜固有 ΔNp63α 陽性細胞の表現型を確認、p63α 陽性細胞のほとんど共発現です。CK 14 と推定 LESC マーカー サイトケラチン (CK)-15 基底上皮系マーカーは、一方、多能性幹細胞のマーカー OCT3/4 と成熟した角膜上皮マーカー CK 12 検出されない時点でこの部分に、表されます。これは、FF hPSCs ベキ単輪部上皮前駆細胞への分化がないまだ成熟した角膜上皮細胞へ分化を示します。(図 3 a)HPSC LESCs は、正常に実用 (データ図 3 aに匹敵する) からの回復後の表現型を保持します。
分化の 24 日後 ΔNp63 は、66.2% で表され (n = 33、SD 9.3%) Regea08/017 hESC-LESCs、および 65.7% (n = 10、SD 4.1%)UTA.04607.WT による LESCs (cytospin サンプル、図 3 bから定量化)。実用、82.2% からの回復後 (n = 10、SD 5.7%) hESC LESCs の 90.5% (n = 10, SD=3.7%) による LESCs の ΔNp63 (日 26-28図 3Bのウェル プレートから定量化) を表明しました。
P63α 式はさらに Regea08/017 hESC LESCs の流フローサイトメトリー解析で確認されました。日 25 分化の新鮮な差別化された hPSC LESCs の 62 %p63α 陽性であった。実用 (日 28 の合計) からの回復後 2 日間 81% の細胞 p63α 陽性 (図 3) であった。
図 1: hPSC LESC 分化プロトコル (A) と典型的な細胞の形態の模式図 (B) のプロセスのさまざまな段階で観察。EBs は高品質の単一細胞懸濁液から形成される、懸濁液の表面の外胚葉に向けた最初の 24 時間 3 日間小分子誘導中に未分化の hPSCs は付着性の分化段階が続きます。分化の日 24 セルの大半は典型的な LESC のような形態を表示します。分化前後 Regea08/017 hESC ライン示されている代表的な画像。黒のスケール バー = 200 μ m、パネルのすべての画像に対して有効です。略語: Blebb: blebbistatin、SB: SB 505124 小分子阻害薬、bFGF: 塩基性繊維芽細胞成長因子、BMP 4: 骨形成タンパク質 4、LN 521: 人間の組換えラミニン 521、col IV: ひと胎盤コラーゲン type IV、hPSC: ひと多能性。幹細胞、EB: LESC 胚様体: 輪部上皮幹細胞。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 予想される細胞収率。ひげのセルの数を示す取得日 0 EB 形成ステップ メッキ未分化の hPSCs の数で割った、分化の 22-25 日目に cryostoring。On 平均 0.72 (SD 0.4) セルはそれぞれの多能性 0.78 (SD 0.67) 各 UTA.04607.WT ことから製造された細胞中の Regea08/017 hESC から生産されました。n: 分化実験の数。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。HPSC 由来の LESCs の表現型を予想します。蛍光抗体の分類 (A) 示す目開発レギュレータ PAX6 の一貫した式と認められた LESC マーカー p63α その ΔNp63 のアイソ フォームと 2 他 LESC マーカー - CK15 と 14 が示唆されました。多能性マーカー OCT3/4 と成熟した角膜上皮マーカー CK 12 負されています。代表的な場合画像が分化の 24 日 Regea08/017 hESC LESCs に示されています。スケール バー = 100 μ m (B) ΔNp63 細胞から新鮮なカウントが区別され、cryostored hPSC LESCs、セルしか保持していないが、実用後増加 ΔNp63 式を表示を示します。細胞数の結果 > 新鮮な差別化された hPSC LESCs の 65% が cryobanking 手順の前に ΔNp63 の肯定的なステンド グラスと > 正常に回復後 80%。n = 別分化実験の数 (サンプルあたり 600 セルの最小値がカウントと > 時点あたり 1600 セル) 新鮮な差別化された hPSC LESCs の 62% と 81% の解凍の細胞を p63α の肯定的な表示 (C) 流れフローサイトメトリー解析Regea08/017 の行の結果をカウントするセルを確認します。* B C 解凍セルを指定します。肯定的なサンプルと負 (無染色) サンプルの黒の赤のヒストグラム。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 抗体 | ホスト | 希釈 |
| もし一次抗体 | ||
| PAX6 | ウサギ | 1: 200 |
| p63α | マウス | 1: 200 |
| ΔNp63α | ウサギ | 1: 200 |
| CK 15 | マウス | 1: 200 |
| CK 14 | マウス | 1: 200 |
| CK 12 | ヤギ | 1: 200 |
| OCT3/4 | ヤギ | 1: 200 |
| 場合のための二次抗体 | ||
| Alexa Fluor 568 の反やぎ Ig | ロバ | 1:800 |
| Alexa Fluor 568 抗マウス Ig | ロバ | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 抗家兎 Ig | ロバ | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 抗マウス Ig | ロバ | 1:800 |
表 1: 第一次および二次抗体を蛍光抗体法 (IF) hPSC 由来 LESCs のラベル使用をお勧めします。メーカーの材料表を参照してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルの期待される結果は、約 3.5 週間以内 FF hPSC の単一細胞懸濁液から LESCs の成功で堅牢な世代です。表面の外胚葉29から角膜上皮が発展すると、プロトコルの最初のステップはこの系譜に向かって hPSCs のステアリングを目指しています。増殖因子 β (TGF-β) 拮抗薬、SB 505124 と bFGF の変換と短い 24 h 誘導、48 h 中胚葉性の BMP 4 キューへ表面の外胚葉細胞をプッシュする続いて外胚葉の分化を誘導するために使用されます。化学的に定義された分化培地とともにコル IV/LN-521 組み合わせ行列に次付着性の分化手順は、さらに LESCs への分化をガイドに使用されます。
原料 (FF hPSCs) の高品質差別化の成功にとって重要です。のみ FF hPSC 文化と合流点付近と画一的な表現型のほぼ 100% を使用してください。HPSCs 増殖と分化の利点30につながる核型異常に素因単一細胞継と、通常 hPSC karyotyping することをお勧めします。トリプシンに長時間さらされるは、不十分な EB の形成や hPSC の死を引き起こすことができます。プロトコルは個別に派生 5 と遺伝的に異なる hPSC ライン、悪名高くによる線でテストされました。小分子濃度または誘導時間に細胞ライン特定の変更の必要はありません。ただし、プロトコルの初期の最適化中に、過剰な細胞死や細胞線維芽、神経またはその他の形態の外観が望ましくない系統への分化を示した。このような場合、メソッドは、微調整を必要があります。文化容器形式は、開始ポイントを提供し、推奨されるサイズからスケール アップすることができます。
LESC 分化と凍結する hPSC 文化から全体のプロトコルが定義されているセルの生産のための容易な移行よい製造業練習 (GMP) 療法の製品を許可します。商業メディアと試薬は、堅牢な開発・製造・品質管理を受ける、hPSC 文化と分化の質の一貫性のある、統一されたプラットフォームが提供します。定義された条件は、既存 hPSC LESC 分化プロトコル10、11,12,13,14,以上の利点を提供するバッチごとに変動を最小限に抑える20,22,23. 高速で比較的単純なプロトコルも細胞、研究所全体で標準化、目的のセル型31 を浄化するために堅牢な方法を必要とすることは困難である三次元の角膜 organoids 優位を提供します ,32。さらに、高効率のプロトコルは、研究目的、例えば疾患モデルの作製、遺伝子工学、創薬スクリーニング、毒性試験の LESCs を生成する強力な手段を提供します。さらに、プラットフォームは、網膜色素上皮細胞 (RPE 細胞)25の他の眼の上皮細胞などの分化のために簡単に微調整することができます。
成功した輪部細胞補充療法にわずか数千 p63 陽性 LESCs4、回目が必要ですが、追加の細胞集団およびしたがって大規模な生産品質保証が必要です。Cryobanking により容易に利用可能な細胞株の移植のためだけでなく、品質と安全性試験のための準備ができます。さらに、hPSC LESC 純度 cryostoring 後の向上さらに継と長期にわたる文化25増加 ΔNp63 式によって提案された後。
要約すると、この手法は、xeno ・ フィーダー細胞フリー培養条件下で 3.5 週間以内 hPSCs から ΔNp63α 陽性細胞を生成します。ここで示した細胞培養法は、高品質 LESCs 眼に適用可能な細胞療法の使用の生産を有効にします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
調査は技術と革新のフィンランド (許可番号 297886) のアカデミー、フィンランド技術庁、フィンランドの資金配分機関の人間スペアパーツ プログラムによってサポートされたフィンランドの目およびティッシュ銀行財団とフィンランド文化財団。著者は、優秀なテクニカル サポートと細胞培養への貢献のために医学の技工 Outi Heikkilä エマ Vikstedt、ハンナ Pekkanen Outi Melin をありがとうございます。教授 Katriina アアルト Setälä は、蛍光イメージングのための機器を提供するため使用ことラインと BioMediTech イメージングの中核施設を提供するために認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C.
- International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
