Summary
Este protocolo apresenta um método simples de duas etapas de diferenciação de células-tronco epiteliais estroma corneana de células-tronco pluripotentes humanas sob condições de cultura celular-free xeno - e alimentador. Os métodos de cultura celular aqui apresentados permitem a produção de custo-eficiente, em larga escala de células de qualidade clínica aplicáveis ao uso de terapia de células da córnea.
Abstract
Corneais estroma epiteliais células-tronco (LESCs) são responsáveis por renovar continuamente o epitélio corneano e mantendo assim a homeostasia corneana e clareza visual. Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-LESCs derivadas fornecem uma promissora fonte de células para terapia de reposição de células da córnea. Condições de cultura e diferenciação de indefinido, xenogénicas causam variação nos resultados de pesquisa e impedem a tradução clínica da terapêutica hPSC-derivado. Este protocolo fornece um método eficiente e reprodutível para diferenciação de hPSC-LESC condições xeno - e alimentador sem célula. Em primeiro lugar, cultura de monocamadas de hPSC indiferenciada na recombinação laminina-521 (LN-521) e médio hPSC definido serve como uma base para a produção de robusta de alta qualidade matéria-prima para diferenciações. Em segundo lugar, um método de diferenciação rápida e simples hPSC-LESC produz populações LESC em apenas 24 dias. Este método inclui uma quatro dias superfície ectodérmica indução em suspensão com pequenas moléculas, seguido por fase de cultura aderente na matriz de combinação LN-521/colagénio IV médio definido diferenciação epitelial da córnea. Cryostoring e diferenciação estendida mais purifica a população celular e permite bancário das células em grandes quantidades de produtos de terapia celular. Os resultantes hPSC-LESCs de alta qualidade fornecem uma potencial estratégia de tratamento romance para reconstrução da superfície da córnea tratar a deficiência de células-tronco limbal (LSCD).
Introduction
A córnea transparente na superfície ocular permite que a luz entra na retina e fornece a maioria do poder refrativo do olho. A camada mais externa, o epitélio estratificado da córnea, é continuamente regenerada por estroma de células tronco epiteliais (LESCs). Os LESCs residem na camada basal dos nichos estroma no corneoscleral junção1,2. LESCs falta de marcadores específicos e exclusivos, por sua identificação requer uma análise mais abrangente de um conjunto de marcadores putativos. P63 do fator de transcrição epiteliais e especialmente N-terminal truncada transcreva a isoforma alfa do p63 (ΔNp63α), tem sido proposto como um relevante positivo LESC marcador3,4. Divisão assimétrica de LESCs lhes permite renovar o Self, mas também produzir descendência que migra centripetamente e anteriormente. Como as células de progresso em direção à superfície da córnea eles gradualmente perdem sua stemness e finalmente terminalmente diferenciar superficial de células escamosas que perdem-se continuamente da superfície da córnea.
Danos a qualquer uma das camadas da córnea pode levar à severa deficiência visual, e defeitos corneais são, portanto, uma das principais causas de perda de visão em todo o mundo. Na deficiência de estroma de células estaminais (LSCD), ao limbo é destruído pela doença ou trauma que leva a conjunctivalization e opacificação da superfície da córnea e subsequente perda de visão5,6. Terapia de reposição celular usando enxertos de limbo autólogos ou alogênico oferece uma estratégia de tratamento para pacientes com LSCD4,7,8,9. No entanto, colheita de enxertos autólogos carrega um risco de complicações para o olho saudável, e tecido doador está em falta. Células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), especificamente as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs), pode servir como uma fonte ilimitada de tipos de células clinicamente relevantes, incluindo as células epiteliais da córnea. Portanto, hPSC-derivado LESCs (hPSC-LESCs) representam uma fonte de celular novo atrativo para terapia de reposição celular ocular.
Tradicionalmente, ambos os métodos de cultura hPSC indiferenciadas e seus protocolos de diferenciação para LESCs têm contado com o uso de células alimentador indefinido, soros de animais, mídia condicionadas ou membrana amniótica10,11, 12 , 13 , 14 , 15. recentemente, esforços na direção de produtos de terapia celular mais seguros tem solicitado a procura de mais protocolos padronizados e xeno-livre cultura e diferenciação. Como resultado, vários métodos definidos e xeno-livre para cultura a longo prazo de hPSCs indiferenciadas estão agora comercialmente disponíveis16,17,18. Como um continuum, dirigido diferenciação protocolos confiando em pistas moleculares para orientar a hPSCs ao destino epitelial da córnea foram recentemente introduzidos19,20,21,22, 23. Ainda muitos desses protocolos utilizados ou indefinido, alimentador com base hPSCs como material, ou fator de crescimento do complexo, xenogénica cocktails para diferenciação de partida.
O propósito do presente protocolo é fornecer um robusto, otimizado, xeno- e método de cultura livre de alimentador hPSC e subsequente diferenciação para LESCs da córnea. Cultura de monocamadas de pluripotentes hPSCs na matriz de laminina-521 (LN-521) no meio de hPSC definida, livre de albumina (especificamente essencial Flex 8) permite a rápida produção de matéria-prima homogênea para diferenciações. Depois de um simples, estratégia de diferenciação em duas fases guias hPSCs em direção a superfície ectodérmico destino em suspensão, seguido de diferenciação aderente para LESCs. Uma população de células onde > 65% express ΔNp63α é obtida dentro de 24 dias. O protocolo de xeno alimentador-livre e foi testado com várias linhas de hPSC (hESCs e hiPSCs), sem qualquer exigência de otimização específicas de linha de celular. Os protocolos para fenotipagem de manutenção, passagem, cryostoring e hPSC-LESC livre de fim de semana, aqui descritos permitem a produção de grandes lotes de alta qualidade LESCs para clínicas ou fins de investigação.
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Protocol
Universidade de Tampere tem a aprovação da autoridade nacional para assuntos médico-legal Finlândia (Dnro 1426/32/300/05) para conduzir a investigação em embriões humanos. O Instituto também tem declarações de apoia do Comitê ético do distrito de Hospital de Pirkanmaa derivar, cultura, e diferenciar linhas hESC (Skottman/R05116) e usar linhas de hiPSC em pesquisa oftálmica (Skottman/R14023). Não há novas linhas de célula derivaram-se para este estudo.
Nota: O protocolo descrito baseia-se na hPSC específica, comercialmente disponível e meios de diferenciação do epitélio corneano. Por favor consulte a Tabela de materiais para os números de informações e catálogo do fabricante/fornecedor.
1. estabelecimento livre de Xeno e alimentador hPSC cultura
- Preparações
- Casaco bem 24 placas com laminina-521 recombinante humana (LN-521). Para a primeira livre de alimentador (FF) passagem, use LN-521 em uma concentração de 1,09 µ g/cm2e 0,55 µ g/cm2 para as seguintes passagens. As concentrações de LN-521 sugeridas servem como ponto de partida para uma bem sucedida cultura FF, mas podem ser reduzidas.
- Descongele o frasco de LN-521 lentamente a 4 ° C, conforme instruções do fabricante.
Nota: Solução de LN-521 adequadamente manipulada pode ser armazenada a 4 ° C por até 3 meses após o descongelamento. - Para preparar a solução de revestimento, dilua a quantidade adequada de solução estoque LN-521 com de 1 x Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) que contém Ca2 + e Mg2 + para um volume total de 300 µ l por bem.
- Pipetar a solução de revestimento de poços, selar a placa bem com parafilm e incubar durante a noite a 4 ° C. Placas revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C por até 2 semanas.
(Opcional): Alternativamente, para um protocolo de revestimento rápido, incubar as placas bem com solução de revestimento por 2 h a 37 ° C, 5% de CO2.
- Descongele o frasco de LN-521 lentamente a 4 ° C, conforme instruções do fabricante.
- Prepare meio de cultura hPSC (especificamente essencial Flex 8) completando o meio basal com suplemento fornecido, conforme as instruções do fabricante. Adicione 50 U/mL de penicilina-estreptomicina. Note que a formulação é sensível à luz e altas temperaturas. Descongelar o suplemento e aquecer os meios de comunicação, à temperatura ambiente (RT), protegidos da luz. Utilize o meio hPSC completada dentro de duas semanas a partir da data de suplementação.
- Casaco bem 24 placas com laminina-521 recombinante humana (LN-521). Para a primeira livre de alimentador (FF) passagem, use LN-521 em uma concentração de 1,09 µ g/cm2e 0,55 µ g/cm2 para as seguintes passagens. As concentrações de LN-521 sugeridas servem como ponto de partida para uma bem sucedida cultura FF, mas podem ser reduzidas.
- Transferir o hPSC para cultura de FF na LN-521
- Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar.
- HPSCs passagem de sistema padrão de cultura em camadas de alimentador (por exemplo, o prepúcio inactivada humana (hFF) ou embrionárias fibroblastos de rato), ou outros sistemas de cultura FF usando metodologia padrão. Por exemplo, hPSC colônias cultivadas em células de hFF alimentador podem ser dissecadas para peças pequenas com um bisturi e as peças então destacadas com uma ponta de agulha. PSCs humanas cultivadas usando FF sistemas de cultura podem ser transferidos usando cluster passagem método com ou sem tratamento prévio de enzima.
- Remover a solução de revestimento de LN-521 dos 24-poços e adicionar 1 mL de meio de hPSC pré-aquecido por bem.
Nota: Não permitem aos poços secar como LN-521 irá inativar após secagem. - Transferência da colônia peças/célula de clusters para LN-521 revestido 24-poços no hPSC médio com uma pipeta. Transferência de 20 – 30 pedaços de colônia por alvéolo, evitando a superlotação dos poços.
- Substitua o meio com 1 mL de meio de hPSC o dia após a transferência e todos os outros dias depois disso. As culturas estão prontas para passagem 3 – 4 dias mais tarde, como hPSCs têm crescido para fora para as colónias com morfologia suave e indiferenciada. Para referência, consulte figura 1B (primeira imagem). Para a primeira passagem de FF, as colônias não devem crescer a uma monocamada confluente totalmente, mas as culturas devem ser passadas quando colónias atingir um tamanho aproximado de 1 mm.
- Passagem e manutenção da cultura de hPSC FF
- Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar.
- A segunda passagem de FF em diante, passagem a hPSCs FF, quando a cultura chegou a confluência de 80-100%. HPSCs FF de passagem para novo LN-521 revestido de placas de 24 poços usando célula única passagem duas vezes por semana (às segundas e quintas-feiras) para manter as culturas de alta qualidade com morfologia indiferenciada e para alcançar o regime de alimentação livre de fim de semana. Para obter detalhes, consulte18,24,25.
- Enxágue o FF hPSCs duas vezes com 1 mL de 1 x DPBS sem Ca2 + e Mg2 +.
- Desanexe FF hPSCs com xeno-livre do trypsin-EDTA (especificamente TrypLE selecione enzima) pela incubação 500 µ l por alvéolo a 37 ° C, 5% de CO2. Para o tempo de incubação ideal, permitem que as células para arredondar para cima, mas não para separar. Isto normalmente leva 3 min a 37 ° C, 5% de CO2 (não exceder 5 min).
- Remover o xeno-livre do trypsin-EDTA e imediatamente adicionar 500 µ l por alvéolo de inibidor de tripsina definidos.
- Desanexe FF hPSCs pipetando cuidado, no entanto, completo para obter uma suspensão de célula única. Transferi a suspensão de hPSC FF através de um filtro de célula de 40 µm para um tubo de centrifuga conico de 15 mL contendo meio hPSC previamente aquecido.
- Lavar os poços com 1 mL de meio de hPSC e adicionar o meio de lavagem para o tubo de centrifuga conico de 15 mL.
- Centrifugar a suspensão de célula única durante 5 min à 300 x g, aspirar o centrifugado e ressuspender em 1 mL de meio de hPSC previamente aquecido.
- Conte as células com hemocytometer ou contador automatizado de células.
- Remover a solução de revestimento de LN-521 (0,55 µ g/cm2) dos 24-poços e adicionar hPSC médio como na 1.2.3.
- Placa hPSCs de FF para 0,55 µ g/cm2 LN-521 revestido 24-poços em uma densidade de célula de 40.000 – 50.000 células/cm2.
- Substitua médio médio hPSC fresco o dia após a passagem e todos os outros dias daí em diante, excluindo os domingos.
- As células estão prontas a ser usado para diferenciação de 3-4 dias após a passagem, quando a cultura atingiu > confluência de 85%. Para garantir a alta qualidade do hPSCs, consulte métodos de caracterização descritos em detalhe em obras anteriores18,24,25. Recomenda-se apenas a cultura hPSCs até o nível de passagem 15 no sistema FF usando célula única passagem para evitar alterações espectofotômetro. Só uso hPSCs indiferenciada, de alta qualidade como material para diferenciações começar.
2. dirigido a diferenciação e criopreservação de hPSC-derivado LESCs
- Preparações
- Preparar o meio basal xeno-livre indução (meio de indução basal): suplemento Dulbecco modificado médio da águia (especificamente nocaute DMEM) com substituição de soro xeno-livre de 15% (spesifically CTS nocaute SR XenoFree), 2 mM L-glutamina, 0,1 mM 2 - Mercaptoetanol, 1% não aminoácidos essenciais e 50 U/mL de penicilina-estreptomicina. Utilize o meio de indução basais dentro de duas semanas.
- Prepare a mídia para indução da córnea na cultura de suspensão.
- Dia 1: Suplemento meio de indução basal com 5 μM de blebbistatin.
- Dia 2: Completar o meio basal de indução com 10 µM SB-505124 e 50 ng/mL humano básico fator de crescimento fibroblástico (bFGF).
- Dia 3-4: meio de indução basal de suplemento com 25 ng/mL Proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4).
- Preparar o meio de diferenciação do epitélio corneano (meio de diferenciação, especificamente CnT-30) para cultura aderente: adicionar suplementos ao meio basal de acordo com as instruções do fabricante e adicionar 50 U/mL de penicilina-estreptomicina.
Nota: A formulação média de diferenciação é sensível à luz. Utilize o meio de diferenciação completados dentro de 6 semanas a contar da data de suplementação. - Casaco de pratos de cultura de tecidos de 100 mm para diferenciação aderente (ver passo 2.3) com uma mistura de 5 µ g/cm2 humano placentário colágeno tipo IV (col. IV) e 0,5 µ g/cm2 LN-521, diluído em 1 x DPBS que contém Ca2 + e Mg2 +, em um total revestimento de volume de 5 mL por prato. Preparar e armazenar os revestimentos com col IV e LN-521, conforme descrito em 1.1.1.3.
-
Etapa i: indução da córnea na cultura de suspensão
- Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar.
- Desanexe FF hPSCs a suspensão de célula única com xeno-livre do trypsin-EDTA conforme as instruções em passos 1.3.2.1–1.3.2.6. Contar as células e distribuir 2-3 x 106 células por fixação baixo 6 placa no volume total de 3 mL de meio de indução basal suplementado com 5 blebbistatin μM para induzir a formação de EB noite, a 37 ° C, 5% CO2 (1 dia).
- No dia seguinte (dia 2), remova o meio e substitua com 3 mL de meio de indução basal suplementado com 10 µM SB-505124 e 50 ng/mL bFGF.
- Sobre os seguintes dois dias (dias 3-4), retire o meio e substitua com 3 mL de meio de indução basal suplementado com 25 ng/mL BMP-4.
- Etapa II: A diferenciação da córnea na cultura aderente
- Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar.
- No dia 5, placa da EBs para baixo para pratos de cultura de tecidos de 100 mm revestidos com 5 µ g/cm2 col IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521.
- Remover a solução de revestimento de pratos de cultura de tecidos de 100mm e adicionar 10 mL de meio de diferenciação pré-aquecido por prato.
Nota: Não deixe a louça secar como LN-521 irá inativar após secagem. - Transferir o EBs de uma placa de 6 bem para dois a três pratos de cultura de tecidos de 100 mm (aproximadamente 50 EBs por cm2) pipetando. Distribua uniformemente o EBs por agitação suave.
- Remover a solução de revestimento de pratos de cultura de tecidos de 100mm e adicionar 10 mL de meio de diferenciação pré-aquecido por prato.
- Manter as células em cultura aderente a 37 ° C, 5% CO2, substituindo o meio com 10 mL de meio fresco diferenciação três vezes por semana (na segunda, quarta e sexta-feira) para as próximas semanas de 2,5 – 3. Verifique as células regularmente para o surgimento da correta morfologia epitelial usando o microscópio de contraste de fase.
- Passo III: Cryo-bancário hPSC-derivado LESCs
- Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar, exceto para o meio de criopreservação que deve ser previamente refrigerado.
- Desanexar hPSC-derivado LESCs com xeno-livre do trypsin-EDTA e contar as células, como instruído para FF hPSCs em etapas 1.3.2.1–1.3.2.6, mas usando o meio de diferenciação.
Nota: Para LESCs hPSC-derivado, tempo de incubação ideal com xeno-livre do trypsin-EDTA é mais longo (cerca de 5 min). Uso 3 mL de xeno-livre do trypsin-EDTA e inibidor de tripsina definidos por prato de 100 mm. - Depois de contar as células, centrifugação repetição durante 5 min à 300 x g, Aspire médio e resuspenda o pellet de células em meio de criopreservação hPSC pre-refrigerados, xeno-livre. Pipetar o single cell suspensão em cryotubes, para que cada criotubo contém 0.5 a 1 x 106 células em 1 mL de meio de criopreservação.
- Coloque os tubos em um recipiente de congelação e transferência imediatamente (dentro de 5 min) a-80 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, transfira os tubos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
- Etapa IV: Descongelar os Shipper hPSC-LESCs
- Antes de descongelar, revesti as placas de pratos/bem com 5 col de2 µ g/cm IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521.
- Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar.
- Remover a solução de revestimento de pratos/poços e adicionar o volume apropriado de médio pré-aquecido diferenciação.
Nota: Não deixe a louça secar como LN-521 irá inativar após secagem. - Descongelar as células rapidamente ao RT e transferir imediatamente a suspensão de células para um tubo de centrifuga conico de 15 mL contendo 5 mL de meio de diferenciação previamente aquecido.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos por 5 min a 300 x g, aspirar e resuspenda o pellet em meio de diferenciação para remover qualquer meio de criopreservação.
- Placa das células para pratos/Poços revestidos com 5 µ g/cm2 col IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521, no meio de diferenciação em uma densidade de 40.000 – 50.000 células/cm2. Manter as células a 37 ° C, 5% CO2, substituindo o meio de diferenciação três vezes por semana.
3. fenotipagem de hPSC-derivado LESCs
- Análise qualitativa da imunofluorescência
- Por imunofluorescência, revestimento de poços de placa de 12 ou 24 --bem com 5 µ g/cm2 col IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521 e placa/descongelamento hPSC-LESCs no meio de diferenciação em uma densidade de 40 000 a 50 000 células/cm2.
- Quando chegaram a confluência das culturas, consertar as células com paraformaldeído 4% (PFA): lavar os poços duas vezes com 1 x DPBS sem Ca2 + e Mg2 +e incubar 15-20 min com 4% PFA em RT Depois disso, lave duas vezes com 1 x DPBS para remover eventuais resíduos PFA. Uso de 0,5-1 mL de soluções por bem.
Nota: Células fixas podem ser armazenadas em 1 x DPBS a 4 ° C por até uma semana antes da coloração.
Cuidado: PFA é tóxico e corrosivo. Lidar com PFA em uma coifa e usar roupas de proteção, óculos de proteção e luvas. - Aspire 1 x DPBS e permeabilize membranas celulares incubando por 10-15 min com 0,1% Triton X-100 em 1 x DPBS.
- Aspire 0,1% Triton X-100 e bloco anticorpos inespecíficos locais obrigatórios incubando por 1h com 3% albumina de soro bovino (BSA) em 1 x DPBS em RT. Prepare diluições de anticorpo primário em 0,5% BSA em 1 x DPBS.
Nota: Consulte a tabela 1 para os anticorpos primários recomendados. - Aspire 3% BSA e incubar com anticorpo primário apropriadamente diluído durante a noite a 4 ° C.
- Lavar os poços 3 x por 5 min com 1 x DPBS. Prepare diluições de anticorpo secundário em 0,5% BSA em 1 x DPBS.
Nota: Consulte a tabela 1 para anticorpos secundários recomendados. - Aspirar 1 x DPBS e incubar com anticorpo secundário apropriado, devidamente diluído por 1h no RT, protegido da luz.
Nota: Este passo no, mantenho as amostras protegidas da luz, a fim de evitar o desbotamento das tinturas fluorescentes. - Lavar os poços 3 x por 5 min com 1 x DPBS e, finalmente, núcleos de corante de contraste com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e monte com fluorescência meios de montagem. DAPI pode ser usado separadamente de acordo com as instruções do fabricante ou incluído no meio de montagem. Lugar redondo lamelas (placas de diâmetro 19 mm e 13 mm para 12 e 24-poços, respectivamente) em cada poço. Siga as instruções do fabricante sobre secagem e armazenamento das amostras montadas.
- Imagem das células coradas com um microscópio fluorescente.
- Análise quantitativa da imunofluorescência
- Prepare amostras de cytospin de LESCs hPSC-derivado objeto óculos.
- Desanexar hPSC-derivado LESCs com xeno-livre do trypsin-EDTA e contar as células, conforme instruído na etapa 2.4.2.
- Depois de contar, adicione 1 x DPBS pre-refrigerados e centrifugar durante 5 min à 300 x g. ajustar o volume da amostra e concentração de células de acordo com as instruções do fabricante do cytocentrifuge dado, por exemplo, 50.000-100.000 células em um volume de 150 µ l de amostra.
- Girar as células até óculos de objeto com um cytocentrifuge , por exemplo, 5 min à 28 x g e correção imediatamente para 15-20 min com 4% PFA em 1 x DPBS no RT Para a fiação recomendada tempo e velocidade, consulte o manual de instruções do cytocentrifuge determinado.
- Prossiga para a coloração das amostras cytospin conforme descrito em etapas 3.1.3–3.1.8 uso bloqueador líquido caneta rodeiam as amostras com um círculo hidrofóbica e realizar a coloração de um droplet para prática econômica. Lavagens podem ser realizadas em recipientes com suportes de lâmina, para garantir a remoção eficiente de anticorpos em excesso e coloração de fundo mínimo. Counterstain núcleos com DAPI e montar as amostras coradas com fluorescência mídia, cobrindo com lamelas de montagem. Siga as instruções do fabricante sobre secagem e armazenamento das amostras montadas.
- Capture imagens de 5-10 por exemplo de locais selecionados aleatoriamente, usando por exemplo 10 X ampliação de um microscópio de fluorescência.
- Estime a percentagem de células coradas positivamente em relação ao totais células (DAPI positivo), por exemplo, com ferramentas de software (https://imagej.nih.gov/ij/) análise e processamento de imagem do ImageJ. De preferência analisar > 500 células por amostra.
- Abra a imagem a ser analisados no software ImageJ. Duplique a imagem e o filtro com Desfoque Gaussiano padrão para remover o ruído.
- Crie um limite. Ajustar os valores de limiar para seleção ideal de núcleos de células coradas positivamente e aplicar. Agora, a imagem duplicada é convertida para uma visão binária.
- Processo a imagem binária com processamento binário ferramentas "Buracos de preenchimento" e "Divisor de águas", que automaticamente vai separar áreas mescladas representando núcleos único.
- Use a ferramenta de "Partículas de Analyze" para automaticamente lista regiões de interesse (ROIs) para a janela de Gerenciador de ROI, que irá abrir após aplicar o comando. Feche a imagem binária.
- Visualize o ROIs na imagem original, escolhendo "Mostrar tudo" no Gerenciador de ROI. Confirmar seleção correta dos núcleos de células coradas e, se necessário, manualmente remover e adicionar seleções individuais.
- Prepare amostras de cytospin de LESCs hPSC-derivado objeto óculos.
- Análise de citometria de fluxo
- Para confirmar os níveis de expressão p63α, manche as células por citometria de fluxo.
- Desanexar hPSC-derivado LESCs com xeno-livre do trypsin-EDTA e contar as células, conforme instruído na etapa 2.4.2.
- Lave as células duas vezes com 1 mL previamente refrigeradas 1 x DPBS e centrifugar durante 5 min à 300 x g. Fix e permeabilize com solução de fixação/permeabilização de ready-to-use para 20 min a 4 ° C. Depois disso lave as células duas vezes com 1 mL pre-refrigerados 1x permeabilizing tampão de lavagem.
Nota: Este passo no, mantenho as células a 4 ° C ou em gelo, salvo indicação em contrário. - Cuidado: Solução de fixação/permeabilização contém formaldeído de 4,2%. Lidar com a solução perigosa em uma coifa e usar roupas de proteção, óculos de proteção e luvas.
- Divida as amostras em tubos de polipropileno de 5 mL. Cada amostra deve conter 100.000-200.000 células e o volume da amostra deve ser ajustado para cerca de 100 µ l de tampão de lavagem 1X.
- Adicionar 2 µ l de fluorocromo conjugado anticorpo de FACS p63-α (para anticorpo recomendado, consulte tabela de equipamentos e materiais) para os tubos de amostra. Deixe uma amostra inocente para servir como controle negativo. Vórtice as amostras e incubar durante 1 h em RT, protegido da luz.
- Lavar as células duas vezes com 1 mL de pre-refrigerados 1x tampão de lavagem e por último, resuspenda as pelotas com 300 µ l de tampão. Armazene os tubos em gelo, protegido da luz.
- Analise as amostras com um citômetro de fluxo. Use as amostras de controlo negativo imaculado para retenção da população celular correto e excluindo o sinal de fundo fluorescente. Analisar um mínimo de 10.000 p63-α-manchado de células. Para implementação técnica detalhada, por favor consulte o manual do utilizador do citômetro de fluxo determinado.
- Para confirmar os níveis de expressão p63α, manche as células por citometria de fluxo.
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Representative Results
De hPSCs para hPSC-LESCs
Todo o processo de induzir a diferenciação de FF hPSCs para cryostoring hPSC-LESCs leva cerca de 3,5 semanas. Visão esquemática do método de diferenciação, destacando suas etapas-chave é apresentada na figura 1A. A figura 1B mostra morfologias típicas de populações de células em diferentes fases do protocolo. Os dados apresentados são obtidos com Regea08/017 hESC e UTA.04607.WT hiPSC linha, ambos derivados e caracterizado na Universidade de Tampere, na Finlândia, conforme descrito anteriormente,26,de27,28.
Na LN-521 hPSC médio, os hPSCs de FF indiferenciada, alta qualidade primeiro formam colônias distintas com bordas afiadas, que se fundem para homogêneas monocamadas na confluência (figura 1B, primeira imagem). Várias linhas individualmente derivadas e geneticamente distintas hESC e hiPSC com êxito foram adaptadas e cultivadas com este sistema. As populações de hPSC FF multiplicam aproximadamente 3 vezes dentro de cada passagem, fornecendo meios robustos para gerar xeno- e material para diferenciações25começar sem alimentador. A indução de 24h no meio de EB normalmente produz uma suspensão de EBs apertado, regular, de tamanhos variados (figura 1B, segunda imagem). Durante a indução superfície ectodérmica em suspensão (dia 2 – 4), a morfologia do EB não deve mudar drasticamente. Consequência natural colonial aparece logo após o EBs são chapeado sobre matriz de combinação col IV/LN-521 num meio de diferenciação (figura 1B, terceiros e quarta imagens), e nos dias 21 e 25 de diferenciação, as células formam camadas homogêneas confluentes com poligonal morfologia típica de células epiteliais (figura 1B, quinta imagem). As células podem então ser cryostored para uso posterior. Viabilidade e morfologia estão bem conservadas após o descongelamento os hPSC-LESCs (figura 1B, última imagem).
Normalmente, 3 x 106 FF hPSCs chapeados para uma única placa de 6 rendimento suficiente EBs para ser banhado por cultura aderente em 2 – 3 pratos de cultura de células (100 mm). De cada prato de 100 mm, 1 a 1,5 x 106 células podem ser colhidas para cryobanking por dia 22 a 25 de diferenciação. Em média, cada hPSC FF indiferenciada gera 0,7 células por dia 25 (Figura 2).
Validação de hPSC-derivado LESCs
Na ausência de proteínas específicas do marcador LESC, o fenótipo da célula correta é confirmado com um conjunto de marcadores que demonstram a diminuição na expressão da pluripotência associados a proteínas e aumento da expressão de marcadores LESC reconhecidos. No dia 24 de diferenciação, a grande maioria de cobertura expressa a LESCs hPSC-derivado caixa proteína PAX6 (PAX6), o regulador chave do desenvolvimento do olho, bem como p63α, o marcador LESC amplamente reconhecido. O ΔNp63 truncado p63-isoform é co expressa na maioria das células p63α-positivo, confirmando o fenótipo de células ΔNp63α-positivo de córnea mais específicos. Marcadores epiteliais basais e putativo LESC marcadores citoqueratinas (CK) -15 e CK-14 são expressos em parte, Considerando que o marcador de células-tronco pluripotentes OCT3/4 e marcador epitelial da córnea maduro CK-12 são indetectáveis neste ponto. Isto indica a diferenciação de hPSCs FF para os progenitores epiteliais estroma unipotent, mas não ainda terminal diferenciação em células epiteliais da córnea maduras. (Figura 3A) Os hPSC-LESCs com sucesso retêm seu fenótipo após a recuperação de cryostorage (dados comparáveis a Figura 3A).
Depois de 24 dias de diferenciação, ΔNp63 foi expressa em 66,2% (n = 33, SD 9,3%) de Regea08/017 hESC-LESCs e em 65,7% (n = 10, SD 4,1%) Uta.04607.WT hiPSC-LESCs (quantificados de cytospin amostras, Figura 3B). Após a recuperação do cryostorage, 82.2% (n = 10, SD 5,7%) de hESC-LESCs e 90,5% (n = 10, SD=3.7%) hiPSC-LESCs expresso ΔNp63 (quantificados de placas bem no dia 26 – 28, Figura 3B).
A expressão p63α foi confirmada com análise de citometria de fluxo para Regea08/017 hESC-LESCs. No dia 25 de diferenciação, os hPSC-LESCs recém diferenciadas, 62% foram positivas para p63α. Dois dias após a recuperação de cryostorage (dia 28 no total), 81% das células eram p63α-positivo (Figura 3).
Figura 1: ilustração esquemática do protocolo de diferenciação hPSC-LESC (A) e morfologias típicas células observadas em diferentes fases do processo (B). EBs são formados a partir de uma suspensão de célula única de alta qualidade, indiferenciada hPSCs durante a primeira indução de molécula pequena 24 h. três dias em direção a superfície ectoderm em suspensão é seguido pela fase de diferenciação aderentes. No dia 24 de diferenciação, a maioria das células mostra morfologia típica do LESC-como. Imagens de representante indicadas para Regea08/017 hESC linha antes e durante a diferenciação. Preto de escala barra = 200 µm, válido para todas as imagens no painel. Abreviaturas: Blebb.: blebbistatin, SB: SB-505124 pequena molécula inibidor, bFGF: fator de crescimento fibroblástico básico, BMP-4: osso Proteína morfogenética 4, LN-521: laminina recombinante humana 521, col IV: humano placentário colágeno tipo IV, hPSC: pluripotentes humanas células-tronco, EB: corpo do embryoid, LESC: células-tronco epiteliais estroma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: rendimento esperado celular. Boxplots mostrando o número de células obtidas por cryostoring no dia 22-25 de diferenciação, dividida pelo número de hPSCs indiferenciadas chapeado para etapa de formação do EB no dia 0. Na média 0.72 (SD 0.4) células foram produzidas a partir de cada pluripotentes hESC Regea08/017, enquanto 0,78 (SD 0,67) células foram produzidas a partir de cada hiPSC UTA.04607.WT. n: número de experimentos de diferenciação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Esperava o fenótipo de hPSC-derivado LESCs. Anticorpo de imunofluorescência rotulagem (A) apresentando a expressão uniforme do regulador de desenvolvimento de olho PAX6 e reconhecido LESC marcadores p63α e sua isoforma de ΔNp63, bem como dois outros sugeriu marcadores LESC - CK15 e 14. Marcador de pluripotência OCT3/4 e marcador epitelial da córnea maduro CK-12 são negativos. Imagens de se representante indicadas para Regea08/017 hESC-LESCs no dia 24 de diferenciação. Barras de escala = 100 µm. (B) ΔNp63 celular, contando a partir de recém diferenciadas e cryostored hPSC-LESCs demonstra que as células não apenas manter, mas mostram expressão aumentada ΔNp63 após cryostorage. Contagem de célula resulta mostrar > 65% dos hPSC-LESCs recém diferenciadas manchado positivo para ΔNp63 antes do procedimento de cryobanking, e > 80% após a recuperação bem sucedida. n = número de experimentos de diferenciação separado (mínimo de 600 células contadas por amostra e > 1600 células por ponto de tempo) análise de citometria de fluxo (C) mostrando os hPSC-LESCs recém diferenciadas, 62% e 81% das células descongeladas positivo para p63α, confirmando a célula contando resultados para linha Regea08/017. * em B-C indica células descongeladas. Histograma de vermelho para amostra positiva e preto para amostra negativa (inocente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Anticorpo | Acolhimento | Diluição |
| Anticorpos primários para se | ||
| PAX6 | coelho | 1: 200 |
| p63α | rato | 1: 200 |
| ΔNp63α | coelho | 1: 200 |
| CK-15 | rato | 1: 200 |
| CK-14 | rato | 1: 200 |
| CK-12 | cabra | 1: 200 |
| OCT3/4 | cabra | 1: 200 |
| Anticorpos secundarios para se | ||
| Alexa Fluor 568 de anti-cabra Ig | burro | 1:800 |
| Alexa Fluor 568 anti-rato Ig | burro | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 anti-coelho Ig | burro | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 anti-rato Ig | burro | 1:800 |
Tabela 1: recomendado anticorpos primários e secundários utilizados para imunofluorescência (IF) rotulagem de hPSC-derivado LESCs. Consulte Tabela de materiais para os fabricantes.
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Discussion
O resultado esperado deste protocolo é a geração bem sucedida e robusta de LESCs de uma suspensão de célula única do FF hPSC dentro aproximadamente 3,5 semanas. Como o epitélio corneano se desenvolve a partir do ectoderma de superfície29, o primeiro passo do protocolo visa hPSCs para esta linhagem de direção. Uma indução curto 24 h com a transformação de fator de crescimento beta (TGF-β) antagonista SB-505124 e bFGF são utilizados para induzir a diferenciação ectodérmica, seguida por mesodérmica sugestão de BMP-4 48 h para empurrar as células no sentido de ectoderma de superfície. A seguinte etapa de diferenciação aderentes na matriz de combinação col IV/LN-521 juntamente com meio de diferenciação quimicamente definidas é usada para orientar ainda mais diferenciação no sentido LESCs.
Alta qualidade da matéria-prima (o hPSCs FF) é crítica para a diferenciação de sucesso. Devem ser usadas apenas FF hPSC culturas com perto de confluência e perto de 100% do fenótipo indiferenciado. HPSC regular o cariótipo é recomendado, como célula única passagem pode predispor hPSCs para espectofotômetro anormalidades que levam ao crescimento e diferenciação de vantagens30. Exposição prolongada a tripsina pode causar a morte de formação ou hPSC EB inadequada. O protocolo foi testado com cinco individualmente derivado e hPSC geneticamente distintas linhas, linhas tanto hESC e hiPSC. Não havia necessidade para célula linha modificações específicas a molécula pequenas concentrações ou tempos de indução. No entanto, durante a otimização inicial do protocolo, morte celular excessiva ou aparecimento de células com morfologia neuronal, fibroblástica ou outra indicado diferenciação de linhagens indesejáveis. Nesse caso, o método pode exigir ajuste fino. Os formatos de navio de cultura fornecem um ponto de partida e podem ser com upscaling dos tamanhos recomendados.
O protocolo inteiro da cultura hPSC para diferenciação de LESC e criopreservação é definido, permitindo a fácil transição para prática GMP (Good Manufacturing) para a produção de célula produtos de terapia. Como a mídia comercial e os reagentes passam por desenvolvimento robusto, fabricação e controle de qualidade, eles fornecem uma plataforma de qualidade consistente e uniforme para diferenciações e cultura hPSC. As condições estabelecidas minimizar a variação de lotes, que oferece uma vantagem sobre existente hPSC-LESC diferenciação protocolos10,11,12,13,14, 20 , 22 , 23. o protocolo relativamente simples e rápido também oferece uma vantagem sobre organoids corneal tridimensional que são difíceis de padronize linhas celulares e laboratórios e requerem métodos robustos para purificar os tipos de células desejado31 ,32. Além disso, o protocolo altamente eficiente fornece meios robustos para produzir LESCs para fins de investigação, por exemplo, doença de modelagem, engenharia genética, rastreio de drogas e testes toxicológicos. Além disso, a plataforma pode ser facilmente ajustada para diferenciação de outros tipos de célula epitelial ocular como pigmento da retina células epiteliais (células RPE)25.
Terapia de reposição de células de estroma bem sucedido requer somente alguns mil p63-positivo LESCs4, por olho, mas garantia de qualidade exige populações de células adicionais e, portanto, grande escala de produção. Cryobanking permite a preparação de estoques de célula prontamente disponíveis para transplante, além de qualidade e testes de segurança. Além disso, a pureza do hPSC-LESC melhora após cryostoring e ainda mais após a passagem e prolongada cultura25, como sugerido por ΔNp63 maior expressão.
Em resumo, este método robusto gera células ΔNp63α-positivo de hPSCs dentro de 3,5 semanas sob condições de cultura celular-free xeno - e alimentador. Os métodos de cultura celular aqui apresentados permitem a produção de uso de terapia alta qualidade LESCs célula aplicável à ocular.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado por Academia da Finlândia (número de concessão 297886), o programa de peças humanas de Tekes, o finlandês agência de financiamento para tecnologia e inovação, o olho finlandês e Fundação do banco de tecido e Fundação Cultural finlandesa. Os autores graças os técnicos de laboratório biomédico Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt e Outi Heikkilä para assistência técnica excelente e contribuição para a cultura de células. Professor Katriina Aalto-Setälä é reconhecido para fornecer a linha de hiPSC usado e facilidade de BioMediTech Imaging Core para fornecendo equipamentos para tratamento de imagens de fluorescência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
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