Summary
Detta protokoll införs en enkel två-stegs metod för att skilja korneal limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller xeno- och villkor feeder cellfria kultur. De cell kultur metoder presenteras här möjliggör kostnadseffektiva, storskaliga produktionen av klinisk kvalitet celler gäller för korneal cell terapi användning.
Abstract
Hornhinnans limbala stamceller epitelceller (LESCs) ansvarar för kontinuerligt förnya hornhinneepitelet och därmed upprätthålla korneal homeostas och visuell tydlighet. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda LESCs ger en lovande cell källa för korneal cell substitutionsterapi. Odefinierad, xenogena kultur och differentiering förhållanden orsaka förändring forskningsresultat och hindra klinisk översättning av hPSC-derived therapeutics. Detta protokoll ger en reproducerbar och effektiv metod för hPSC-ESF LESC differentiering xeno- och feeder cellfria villkor. För det första fungerar enskiktslager kultur av odifferentierade hPSC på rekombinant laminin-521 (LN-521) och definierade hPSC medium som en grund för robust produktion av högkvalitativa utgångsmaterial för differentieringar. För det andra, en snabb och enkel hPSC-ESF LESC differentiering metod ger ESF LESC populationer i bara 24 dagar. Metoden innehåller en fyra dagars ytan ektodermala induktion i suspension med små molekyler, följt av vidhäftande kultur fas på LN-521/kollagen IV kombination matris i definierade korneal epitelial differentiering medium. Cryostoring och utökade differentiering ytterligare renar cell befolkningen och möjliggör Bank av cellerna i stora mängder för cellterapi. De resulterande hög kvalitet hPSC-LESCs ge en potentiell ny behandlingsstrategi för hornhinnans yta återuppbyggnad att behandla brist på limbala stamceller (LSCD).
Introduction
Den genomskinliga hornhinnan på den okulära ytan tillåter ljus komma näthinnan och ger majoriteten av ögats brytningsförmåga. Det yttersta lagret, stratifierat hornhinnans epitel, är kontinuerligt regenereras genom limbala epitelial stamceller (LESCs). LESCs finnas i de basala lagret av de limbala nischerna på corneoscleral junction1,2. LESCs saknar specifik och unik markörer, så deras identifiering kräver en mer omfattande analys av en uppsättning förmodad markörer. Epitelial transkription faktorn p63 och särskilt N-terminalt trunkerade avskrift av den alfa isoformen av p63 (ΔNp63α), har föreslagits som en relevant positiva ESF LESC marker3,4. Asymmetrisk fördelning av LESCs tillåter dem att själv förnya, men också producera avkomma som migrerar centripetally och anteriorly. Som cellerna framsteg mot hornhinnans yta de gradvis förlorar sin stemness och slutligen obotligt differentiera till ytlig Skivepitelcancer celler som kontinuerligt försvinner från hornhinnans yta.
Skada på någon av hornhinnans lager kan leda till allvarlig synnedsättning och korneal defekter är således en av de främsta orsakerna till synnedsättning i hela världen. I brist på limbala stamceller (LSCD) förstörs limbus av sjukdom eller trauma som leder till conjunctivalization och grumling av hornhinnans yta och efterföljande förlust av vision5,6. Cell substitutionsterapi med autologa eller allogena limbala ympkvistar erbjuder en behandlingsstrategi för patienter med LSCD4,7,8,9. Men skörd autologa transplantat bär en risk för komplikationer för det friska ögat och givarens vävnad är en bristvara. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs), specifikt mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), kan fungera som en obegränsad källa av kliniskt relevanta celltyper, inklusive korneal epitelceller. HPSC-derived LESCs (hPSC-LESCs) utgör därför en attraktiv ny cell källa för okulär cell substitutionsterapi.
Traditionellt, både de odifferentierade hPSC kultur metoderna och deras differentiering protokoll till LESCs har förlitat sig på användning av odefinierade feeder celler, animaliska sera, luftkonditionerade medier eller fostervattnet membran10,11, 12 , 13 , 14 , 15. nyligen, insatser mot säkrare cellterapi har föranlett sökandet efter mer standardiserade och xeno-fri kultur och differentiering-protokoll. Som ett resultat, är flera definierade och xeno-fria metoder för långtidsodling av odifferentierade hPSCs kommersiellt tillgängliga16,17,18. Som ett kontinuum, riktad differentiering protokoll som förlitar sig på molekylär ledtrådar att vägleda hPSCs till hornhinnans epitel öde har nyligen introducerat19,20,21,22, 23. Ännu används många av dessa protokoll antingen odefinierad, feeder baserat hPSCs som utgångsmaterial, eller komplexa, xenogena tillväxtfaktor cocktails för differentiering.
Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en robust, optimerad, xeno- och feeder-fri hPSC kultur metod och efterföljande differentiering till hornhinnan LESCs. Enskiktslager kultur av pluripotenta hPSCs på laminin-521 (LN-521) matris i definierade, albumin-fri hPSC medium (särskilt väsentliga 8 Flex) tillåter snabb produktion av homogena utgångsmaterial för differentieringar. Därefter en enkel, two-step differentiering strategi guider hPSCs mot ytan ektodermala öde i suspension, följt av vidhäftande differentiering till LESCs. En cell befolkningen där > 65% uttrycka ΔNp63α erhålls inom 24 dagar. Xeno - och feeder-fri protokollet har testats med flera hPSC linjer (både hESCs och hiPSCs), utan några krav för cell linje specifik optimering. Protokollen för weekend-gratis underhåll, passaging, cryostoring och hPSC-ESF LESC fenotypning beskrivs här möjliggör tillverkning av stora serier av högkvalitativa LESCs för kliniska eller forskningsändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tammerfors universitet har godkännande av den nationella myndigheten Rättsskyddscentralen Finland (Dnro 1426/32/300/05) för att bedriva forskning på mänskliga embryon. Institutet har också stödjande uttalanden av etiska kommittén av Birkalands sjukvårdsdistrikt att härleda, kultur, och differentiera hESC linjer (Skottman/R05116) och använda hiPSC linjer i oftalmologiska forskning (Skottman/R14023). Inga nya cellinjer härleddes för denna studie.
Obs: Protokollet beskrivs är baserat på specifika, kommersiellt tillgängliga hPSC och hornhinneepitelet differentiering media. Se Tabell för material för tillverkare/leverantör information och katalog nummer.
1. upprätta Xeno - och Feeder-fri hPSC kultur
- Förberedelser
- Coat 24 brunnar med humant rekombinant laminin-521 (LN-521). För första feeder-fri (FF) passagen, använda LN-521 vid en koncentration av 1.09 µg/cm2och vid 0.55 µg/cm2 för de följande passagerna. De föreslagna koncentrationerna som LN-521 tjäna som utgångspunkt för framgångsrikt FF kultur men kan sänkas.
- Tina LN-521 injektionsflaskan långsamt vid 4 ° C enligt tillverkarens anvisningar.
Obs: Lämpligt hanteras LN-521 lösning kan förvaras vid 4 ° C i upp till 3 månader efter upptining. - För att förbereda beläggning lösningen, späd lämplig mängd LN-521 stamlösning med 1 x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) som innehåller Ca2 + och Mg2 + till en total volym på 300 µL per brunn.
- Pipettera beläggning lösningen till brunnar, försegla väl plattan med parafilm och inkubera över natten vid 4 ° C. Plattorna kan lagras vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
(Valfritt): alternativt för en snabb beläggning-protokollet, inkubera plattor med beläggning lösning för 2 h vid 37 ° C, 5% CO2.
- Tina LN-521 injektionsflaskan långsamt vid 4 ° C enligt tillverkarens anvisningar.
- Förbered hPSC odlingsmedium (särskilt väsentliga 8 Flex) genom att komplettera basala medium med medföljande tillägg, enligt anvisningar från tillverkaren. Lägga till 50 U/mL penicillin-streptomycin. Observera att formuleringen är känsliga för ljus och höga temperaturer. Tina upp tillägget och varm media vid rumstemperatur (RT), skyddas från ljus. Använd kompletterade hPSC mediet inom två veckor från tillskott.
- Coat 24 brunnar med humant rekombinant laminin-521 (LN-521). För första feeder-fri (FF) passagen, använda LN-521 vid en koncentration av 1.09 µg/cm2och vid 0.55 µg/cm2 för de följande passagerna. De föreslagna koncentrationerna som LN-521 tjäna som utgångspunkt för framgångsrikt FF kultur men kan sänkas.
- Överföring av hPSC till FF kultur på LN-521
- Pre varma alla nödvändiga material och reagenser till RT i LAF.
- Passagen hPSCs från standard kultur på mataren lager (t.ex. inaktiverade mänskliga förhud (hFF) eller mus embryonala fibroblaster), eller de andra FF kultur system använder standardmetod. HPSC kolonierna odlade på hFF feeder celler kan till exempel vara dissekeras till små bitar med en skalpell och bitarna sedan fristående med en nålspetsen. Mänskliga PSC odlade använder FF kultur system kan överföras med kluster passaging metod med eller utan föregående enzymbehandlingen.
- Ta bort LN-521 beläggning lösningen från 24-brunnarna och tillsätt 1 mL före värmde hPSC medium per brunn.
Obs: Låt inte brunnarna torka som LN-521, inaktiveras vid torkning. - Överföra de koloni bitar deponicell kluster till LN-521 belagda 24-brunnar i hPSC medium med en pipett. Överför 20 – 30 kolonin bitar per brunn, undvika överbefolkning brunnarna.
- Ersätta mediet med 1 mL hPSC medium dagen efter överföring och varannan dag därefter. Kulturerna är redo för passaging 3 – 4 dagar senare som hPSCs har vuxit ut till kolonier med slät, odifferentierad morfologi. För referens, se figur 1B (första bilden). För första FF passagen, kolonierna bör inte tillåtas att växa till en fullt konfluenta enskiktslager, men kulturerna bör vara passaged när kolonierna når en ungefärlig storlek på 1 mm.
- Passaging och underhåll av FF hPSC kultur
- Pre varma alla nödvändiga material och reagenser till RT i LAF.
- Från andra FF passage och framåt, passage av FF hPSCs när kulturen har nått 80-100% konfluens. Passagen FF hPSCs till nya LN-521 belagd 24 brunnar med enstaka cell passaging två gånger i veckan (på måndagar och torsdagar) att upprätthålla hög kvalitet kulturer med odifferentierad morfologi och uppnå helg-fri utfodring regim. För detaljer, vänligen se18,24,25.
- Skölj den FF hPSCs två gånger med 1 mL av 1 x DPBS utan Ca2 + och Mg2 +.
- Lossa FF hPSCs med xeno-fri trypsin-EDTA (särskilt TrypLE Välj enzym) av ruvande 500 µL per brunn vid 37 ° C, 5% CO2. För optimal inkubationstiden, tillåta cellerna att runda upp men inte att lossa. Detta tar vanligtvis 3 min vid 37 ° C, 5% CO2 (inte överstiger 5 min).
- Ta bort xeno-fri trypsin-EDTA och omedelbart tillsätt 500 µL per brunn av definierade trypsin-inhibitor.
- Lossa FF hPSCs genom försiktig, men noggrann pipettering för att få en enda cellsuspension. Över FF hPSC genom en sil med 40 µm i cellen till en 15 mL koniskt centrifugrör som innehåller pre värmde hPSC medium.
- Tvätta brunnarna med 1 mL hPSC medium och Lägg till tvätt medium 15 mL koniska centrifugröret.
- Centrifugera enda cellsuspensionen för 5 min vid 300 x g, uppsugning cellpelleten och resuspendera i 1 mL före värmde hPSC medium.
- Räkna cellerna automatiserade cell räknaren eller hemocytometer.
- Ta bort LN-521 beläggning lösningen (0.55 µg/cm2) från 24-brunnarna och Lägg hPSC medium som i 1.2.3.
- Plattan FF hPSCs på 0,55 µg/cm2 LN-521 belagd 24-brunnar på en cell densiteten av 40 000 – 50 000 celler/cm2.
- Ersätta mediet med färska hPSC medium dagen efter passaging, och varannan dag därefter exklusive söndagar.
- Cellerna är redo att användas för differentiering 3-4 dagar efter passaging, när kulturen har nått > 85% konfluens. För att säkerställa den höga kvaliteten på hPSCs, se karakterisering metoder beskrivs i detalj i tidigare verk18,24,25. Det rekommenderas att endast kultur hPSCs upp till nivå 15 i FF systemet med enstaka cell passaging för att undvika karyotypic ändringar. Använd endast högkvalitativa, odifferentierade hPSCs som utgångsmaterial för differentieringar.
2. riktat differentiering och Frysförvaring av hPSC-derived LESCs
- Förberedelser
- Förbereda xeno-fri basala induktion medium (basal induktion medium): tillägg Dulbeccos modifierad örnens medium (specifikt KnockOut DMEM) med 15% xeno-fritt serum ersätter (spesifically CTS KnockOut SR XenoFree), 2 mM L-glutamin, 0,1 mM 2 - merkaptoetanol, 1% icke-essentiella aminosyror och 50 U/mL penicillin-streptomycin. Använd det basala induktion mediet inom två veckor.
- Förbered för korneal induktion i suspension kultur.
- Dag 1: Komplettera basala induktion medium med 5 μM blebbistatin.
- Dag 2: Tillägg basala induktion medium med 10 µM SB-505124 och 50 ng/mL mänskliga grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF).
- Dag 3-4: tillägg basala induktion medium med 25 ng/mL benmorfogent protein 4 (BMP-4).
- Förbereda hornhinneepitelet differentiering medium (differentiering medium, specifikt CnT-30) vidhäftande kultur: Tillsätt kosttillskott till basala medium enligt tillverkarens anvisningar och 50 U/mL penicillin-streptomycin.
Obs: Differentiering medium formulering är känsliga för ljus. Använd kompletterade differentiering mediet inom 6 veckor från tillskott. - Coat 100 mm vävnadsodling rätter för vidhäftande differentiering (se steg 2,3) med en blandning av 5 µg/cm2 mänsklig placenta kollagen typ IV (col IV) och 0,5 µg/cm2 LN-521 utspätt i 1 x DPBS som innehåller Ca2 + och Mg2 +, i totalt beläggning på 5 mL per maträtt. Förbered och förvara beläggningar med col IV och LN-521 som beskrivs i 1.1.1.3.
-
Steg I: korneal induktion i suspension kultur
- Pre varma alla nödvändiga material och reagenser till RT i LAF.
- Lossa FF hPSCs till enda cellsuspension med xeno-fri trypsin-EDTA enligt instruktionerna i steg 1.3.2.1–1.3.2.6. Räkna cellerna, och fördela 2-3 x 106 celler per låg infästning 6-väl plattan väl, i total volym 3 ml av basala induktion medium kompletteras med 5 μM blebbistatin att framkalla EB bildas över natten vid 37 ° C, 5% CO2 (dag 1).
- Följande dag (dag 2), ta bort mediet och ersätta med 3 mL basala induktion medium kompletteras med 10 µM SB-505124 och 50 ng/mL bFGF.
- Följande två dagar (dagarna 3 – 4), ta bort mediet och ersätta med 3 mL basala induktion medium kompletteras med 25 ng/mL BMP-4.
- Steg II: Hornhinnan differentiering i vidhäftande kultur
- Pre varma alla nödvändiga material och reagenser till RT i LAF.
- Dag 5, tallrik EBs ner på 100 mm vävnadsodling rätter överdragna med 5 µg/cm2 col IV och 0,5 µg/cm2 LN-521.
- Ta bort beläggningen lösningen från 100 mm vävnadsodling rätter och tillsätt 10 mL av pre värmde differentiering medium per maträtt.
Obs: Låt inte rätter att torka som LN-521, inaktiveras vid torkning. - Överför EBs från en 6-väl plattan väl till två till tre 100 mm vävnadsodling rätter (cirka 50 EBs per cm2) av pipettering. Fördela EBs jämnt genom varsam skakning.
- Ta bort beläggningen lösningen från 100 mm vävnadsodling rätter och tillsätt 10 mL av pre värmde differentiering medium per maträtt.
- Behålla cellerna vidhäftande kultur vid 37 ° C, 5% CO2, ersätta mediet med 10 mL färsk differentiering medium tre gånger per vecka (på måndag, onsdag och fredag) för nästa 2,5 – 3 veckor. Markera cellerna regelbundet för uppkomsten av rätt epitelial morfologi genom fas kontrast Mikroskop.
- Steg III: Cryo-banking hPSC-derived LESCs
- Pre varma alla nödvändiga material och reagenser till RT i LAF, med undantag för frysförvaring mediet som ska kylas före.
- Lossa hPSC-derived LESCs med xeno-fri trypsin-EDTA och räkna cellerna, för FF hPSCs i steg 1.3.2.1–1.3.2.6, men på differentiering medium.
Obs: För hPSC-härledda LESCs, optimal inkubationstiden med xeno-fri trypsin-EDTA är längre (ca 5 min). Använd 3 mL av xeno-fri trypsin-EDTA och definierade trypsin hämmare per 100 mm maträtt. - Efter räknar cellerna, upprepa centrifugering för 5 min vid 300 x g, aspirera medium och resuspendera cellpelleten i förväg kylda, xeno-fri hPSC frysförvaring medium. Pipettera singeln cell suspension in frysrör så att varje cryotube innehåller 0,5 till 1 x 106 celler i 1 mL frysförvaring medium.
- Placera rören i en frysning behållare och överföringen omedelbart (inom 5 min) till-80 ° C över natten.
- Följande dag, överföra rören till flytande kväve för långsiktig lagring.
- Steg IV: Upptining av frysförvarade hPSC-LESCs
- Innan upptining, coat rätter per brunn plattorna med 5 µg/cm2 col IV och 0,5 µg/cm2 LN-521.
- Pre varma alla nödvändiga material och reagenser till RT i LAF.
- Ta bort beläggningen lösningen från rätter/brunnar och Lägg till lämplig volym av pre värmde differentiering medium.
Obs: Låt inte rätter att torka som LN-521, inaktiveras vid torkning. - Tina cellerna snabbt på RT och omedelbart överföra cellsuspensionen till en 15 mL koniskt centrifugrör innehållande 5 mL före värmde differentiering medium.
- Centrifugera cellsuspensionen för 5 min vid 300 x g, aspirera, och återsuspendera pelleten i differentiering medium att ta bort alla frysförvaring medium.
- Platta celler på rätter/brunnar belagd med 5 µg/cm2 col IV och 0,5 µg/cm2 LN-521, i differentiering medium med en täthet av 40 000 – 50 000 celler/cm2. Upprätthålla cellerna vid 37 ° C, 5% CO2, ersätter differentiering medium tre gånger i veckan.
3. fenotypning av hPSC-derived LESCs
- Immunofluorescens. kvalitativ analys
- För immunofluorescens, täck 24 - eller 12-väl plattan brunnar med 5 µg/cm2 col IV och 0,5 µg/cm2 LN-521 och plattan/Tina hPSC-LESCs i differentiering medium med en täthet av 40 000 – 50 000 celler/cm2.
- När kulturerna har nått konfluens, fixa cellerna med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA): Tvätta brunnarna två gånger med 1 x DPBS utan Ca2 + och Mg2 +och inkubera 15-20 min med 4% PFA på RT. Därefter tvätta två gånger med 1 x DPBS att ta bort rester PFA. Använd 0,5-1 mL lösning per brunn.
Obs: Fast celler kan förvaras i 1 x DPBS vid 4 ° C i upp till en vecka före färgning.
Varning: PFA är giftiga och frätande. Hantera PFA i ett dragskåp och bära skyddskläder, ögonskydd och handskar. - Aspirera 1 x DPBS och permeabilize cellmembran genom inkubation för 10-15 min med 0,1% Triton x-100 i 1 x DPBS.
- Aspirera 0,1% Triton x-100 och blockera ospecifik antikropp bindande platser genom inkubation för 1 h med 3% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x DPBS på RT. förbereda primär antikropp utspädningar i 0,5% BSA i 1 x DPBS.
Obs: Se tabell 1 för rekommenderade primära antikroppar. - Aspirera 3% BSA och inkubera med lämpligt utspädd primär antikropp över natten vid 4 ° C.
- Tvätta brunnarna 3 x 5 min med 1 x DPBS. Förbereda sekundär antikropp utspädningar i 0,5% BSA i 1 x DPBS.
Obs: Se tabell 1 för rekommenderade sekundära antikroppar. - Aspirera 1 x DPBS och inkubera med lämplig, korrekt utspädd sekundär antikropp för 1 h på RT, skyddas från ljus.
Obs: Från detta steg på, hålla de prover som skyddas från ljus för att förhindra blekning av fluorescerande färgerna. - Tvätta brunnarna 3 x 5 min med 1 x DPBS och slutligen motfärg kärnor med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) och montera med fluorescens montering media. DAPI kan användas separat enligt tillverkarens anvisningar eller ingår i monteringsmedium. Plats runda coverslips (diameter 19 mm och 13 mm för 12 - och 24-bra plattor, respektive) i varje brunn. Följ tillverkarens instruktioner för torkning och lagring av monterade proverna.
- Bild färgas cellerna med en fluorescerande Mikroskop.
- Kvantitativa immunofluorescens analys
- Förbered cytospin prover av hPSC-derived LESCs på objektet glasögon.
- Lossa hPSC-derived LESCs med xeno-fri trypsin-EDTA och räkna cellerna, enligt instruktionerna i steg 2.4.2.
- Efter inventering, tillsätt pre kylda 1 x DPBS och Centrifugera under 5 minuter vid 300 x g. Justera provvolymen och cellkoncentrationen enligt tillverkarens anvisningar för den givna cytocentrifuge, t.ex. 50 000 – 100 000 celler i en provvolymen av 150 µL.
- Snurra celler ner till objektet glasögon med en cytocentrifuge e.g. 5 min 28 x g och fixa omedelbart för 15-20 min med 4% PFA i 1 x DPBS på RT. För rekommenderade spinning tid och hastighet, se bruksanvisningen för den givna cytocentrifuge.
- Gå vidare till färgning cytospin proven som beskrivs i steg 3.1.3–3.1.8 använda flytande blockerare penna att omge av prov med en hydrofob cirkel och genomföra färgningen i ett droplet-program för ekonomisk praxis. Tvättar kan utföras i behållare med slide innehavare, för att säkerställa effektiv borttagning av överskjutande antikroppar och minimal bakgrundsfärgning. Motfärg atomkärnor med DAPI och montera de färgade proverna med fluorescens montering media, täcka med coverslips. Följ tillverkarens anvisningar om torkning och lagring av monterade proverna.
- Ta 5 – 10 bilder per prov från slumpmässigt utvalda platser med t.ex. 10 X förstoring av fluorescens Mikroskop.
- Uppskatta andelen positivt färgade celler i förhållande till totala (DAPI positiv) celler, e.g. med ImageJ bildbehandling och analys-programvaruverktyg (https://imagej.nih.gov/ij/). Företrädesvis analysera > 500 celler per prov.
- Öppna bilden som ska analyseras i ImageJ programvara. Duplicera bilden och filter med standard Gaussisk oskärpa att ta bort brus.
- Skapa en tröskel. Justera tröskelvärdena till optimal urval av positivt färgade cellkärnor, och applicera. Duplicerade bilden omvandlas nu till en binär vy.
- Process binära bilden med binära bearbetning verktyg ”Fyll hål” och ”Watershed”, som automatiskt kommer att separera sammanfogade områden som utgör enda atomkärnor.
- Använd verktyget ”analysera partiklar” till automatiskt lista regioner intressen (ROIs) att fönstret ROI manager, som kommer att öppna vid ansökan kommandot. Stäng den binär bilden.
- Visualisera ROIs i den ursprungliga bilden genom att välja ”Visa alla” i ROI Manager. Bekräfta rätt val av färgade cellkärnor, och vid behov manuellt ta bort och lägga till individuella val.
- Förbered cytospin prover av hPSC-derived LESCs på objektet glasögon.
- Flödescytometri Flödesanalys
- För att bekräfta p63α uttrycksnivåerna, färga cellerna för flödescytometri.
- Lossa hPSC-derived LESCs med xeno-fri trypsin-EDTA och räkna cellerna, enligt instruktionerna i steg 2.4.2.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 mL före kylda 1 x DPBS och Centrifugera i 5 min vid 300 x g. Fix och permeabilize med färdiga att använda fixering/permeabilisering lösning för 20 min vid 4 ° C. Därefter tvätta cellerna två gånger med 1 mL före kyld 1 x permeabilizing tvättbuffert.
Obs: Från detta steg på, hålla cellerna vid 4 ° C eller på is, om inget annat anges. - FÖRSIKTIGHET: Fixering/permeabilisering lösning innehåller 4,2% formaldehyd. Hantera farliga lösningen i ett dragskåp och bära skyddskläder, ögonskydd och handskar.
- Dela in prover i 5 mL polypropylene rören. Varje prov bör innehålla 100 000 – 200 000 celler och provvolymen bör anpassas till cirka 100 µL av 1 x tvättbuffert.
- Tillsätt 2 µL fluorokrom konjugerat p63-α FACS antikropp (för rekommenderade antikroppar, se tabell av utrustning och material) in i provrör. Lämna ett prov ofärgade för att tjäna som negativ kontroll. Vortex proverna och inkubera i 1 h på RT, skyddas från ljus.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 mL före kylda 1 x Tvättbuffert och slutligen Omsuspendera pellets med 300 µL buffert. Förvara rören på is, skyddas från ljus.
- Analysera proverna med en flödescytometer. Använda det ofärgade negativa kontrollprovet för gating av befolkningens rätt cell, och exklusive de fluorescerande bakgrund signalen. Analysera minst 10.000 p63-α-färgade celler. För detaljerade tekniska genomförandet, hänvisas till användarmanualen för den givna flödescytometer.
- För att bekräfta p63α uttrycksnivåerna, färga cellerna för flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Från hPSCs till hPSC-LESCs
Hela processen från inducerar differentiering av FF hPSCs att cryostoring hPSC-LESCs tar runt 3,5 veckor. Schematisk översikt över metoden differentiering belysa dess viktigaste stegen presenteras i figur 1A. Figur 1B visar typiska morfologier av cellpopulationer i olika faser av protokollet. Uppgifterna erhålls med Regea08/017 hESC linje och UTA.04607.WT hiPSC linje, både härrör och kännetecknas vid Tammerfors universitet, Finland, som tidigare beskrivits26,27,28.
På LN-521 i hPSC medium bildar de odifferentierade, hög kvalitet FF hPSCs först distinkta kolonier med skarpa kanter, som går samman och homogen enskiktslager vid sammanflödet (figur 1B, första bilden). Flera individuellt härledda och genetiskt distinkta hESC och hiPSC linjer var framgångsrikt anpassat och odlade med detta system. FF hPSC befolkningarna multiplicera cirka 3 gånger inom varje passage, som ger robust sätt att generera xeno- och feeder-gratis utgångsmaterial för differentieringar25. 24 h induktion i EB medium producerar vanligtvis en suspension av snäva, regelbunden EBs av varierande storlek (figur 1B, andra bilden). Under ytan ektodermala induktion i suspension (dag 2 – 4), bör EB morfologi inte förändras dramatiskt. Koloniala utväxt visas snart efter EBs är pläterade på col IV/LN-521 kombination matris i differentiering medium (figur 1B, tredje och fjärde bilder), och inom 21 – 25 dagar av differentiering cellerna bilda konfluenta homogena skikt med Polygonal morfologi som är typiskt för epitelceller (figur 1B, femte bild). Cellerna kan då vara cryostored för senare användning. Livskraft och morfologi är väl bevarade efter upptining i hPSC-LESCs (figur 1B, sista bilden).
Typiskt, 3 x 106 FF hPSCs klädd till en enda 6-väl plåt ge tillräckligt EBs att vara klädd för vidhäftande kultur i 2 – 3 cell kultur rätter (100 mm). Från varje 100 mm maträtt, kan 1 till 1,5 x 106 celler skördas för cryobanking av dag 22 – 25 av differentiering. I genomsnitt genererar varje odifferentierade FF hPSC 0,7 celler genom dag 25 (figur 2).
Validering av hPSC-derived LESCs
I avsaknad av specifika ESF LESC markör proteiner bekräftas den rätta cell fenotypen med en uppsättning markörer som visar minskningen i uttryck för pluripotency associerade proteiner och ökat uttryck av erkänt ESF LESC markörer. Dag 24 av differentiering, majoriteten av de hPSC-derived LESCs express ihopkopplade box protein PAX6 (PAX6), den viktigaste regulatorn av ögat utveckling, liksom p63α, allmänt erkänd ESF LESC markören. Den trunkerade p63-isoform ΔNp63 är samtidig uttryckt i de flesta av de p63α-positiva celler, bekräftar den mest hornhinnan-specifika ΔNp63α-positiv cell fenotypen. Basala epiteliala markörer och förmodad ESF LESC markörer cytokeratin (CK) -15 och CK-14 uttrycks delvis pluripotenta stamceller markör OCT3/4 och mogen hornhinnans epitel markör CK-12 är omätbara på denna punkt. Detta indikerar differentiering av FF hPSCs mot unipotenta limbala epitelial föräldraparets, men inte ännu terminal differentiering in mogna korneal epitelceller. (Figur 3A) De hPSC-LESCs behålla framgångsrikt sin fenotyp efter återhämtning från cryostorage (Data jämförbar med figur 3A).
Efter 24 dagar av differentiering, ΔNp63 uttrycktes i 66,2% (n = 33, SD 9,3%) av Regea08/017 hESC-LESCs, och i 65,7% (n = 10, SD 4,1%) Uta.04607.WT hiPSC-LESCs (kvantifieras från cytospin prover, figur 3B). Efter återhämtning från cryostorage, 82,2% (n = 10, SD 5,7%) av hESC-LESCs och 90,5% (n = 10, SD=3.7%) hiPSC-LESCs uttryckt ΔNp63 (kvantifieras från plattor på dag 26 – 28, figur 3B).
Uttrycket p63α bekräftades ytterligare med flödescytometri Flödesanalys för Regea08/017 hESC-LESCs. På dag 25 av differentiering var 62% av de nybakade differentierade hPSC-LESCs positivt för p63α. Två dagar efter återhämtning från cryostorage (dag 28 i totalt), var 81% av cellerna p63α-positiv (figur 3 c).
Figur 1: Schematisk illustration av hPSC-ESF LESC differentiering protocol (A) och typiska cell morfologier observerats i olika faser av processen (B). EBs bildas från en enda cellsuspension av hög kvalitet, odifferentierade hPSCs under de första 24 h. tre dagars småmolekylära induktionen mot ytan ektoderm i suspension följs av vidhäftande differentiering fas. Dag 24 av differentiering visar majoriteten av cellerna typiska ESF LESC morfologi. Representativa bilder visas för Regea08/017 hESC linje före och under differentiering. Svart skala bar = 200 µm, giltig för alla bilder i panelen. Förkortningar: Blebb.: blebbistatin, SB: SB-505124 liten molekyl hämmare, bFGF: basic fibroblast tillväxtfaktor, BMP-4: bone morphogenetic protein 4, LN-521: humant rekombinant laminin 521, col IV: mänsklig placenta kollagen typ IV, hPSC: mänskliga pluripotenta stamceller, EB: embryoid kropp, ESF LESC: limbala stamceller epitelceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: beräknade cellen avkastning. Boxplots visar antalet celler som erhållits för cryostoring på dag 22-25 av differentiering, dividerat med antal odifferentierade hPSCs ströks för EB bildandet steg på dag 0. Den genomsnittliga 0,72 (SD 0,4) celler producerades från varje pluripotenta Regea08/017 hESC, medan 0,78 (SD 0,67) celler producerades från varje UTA.04607.WT hiPSC. n: antal differentiering experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Förväntat fenotyp av hPSC-derived LESCs. Immunofluorescens antikropp märkning (A) visar enhetligt uttryck för ögat utveckling regulator PAX6 och erkända ESF LESC markörer p63α och dess ΔNp63-isoform, samt två andra föreslog ESF LESC markörer - CK15 och 14. Pluripotency markör OCT3/4 och mogen hornhinnans epitel markör CK-12 är negativa. Representativa om bilder visas för Regea08/017 hESC-LESCs på dag 24 av differentiering. Skala barer = 100 µm. (B) ΔNp63 cell räknat från färska differentierade och cryostored hPSC-LESCs visar att cellerna behåller inte endast, men visar ökad ΔNp63 uttryck efter cryostorage. Cell räknar resultat visar > 65% av de färska differentierade hPSC-LESCs färgade positivt för ΔNp63 innan cryobanking förfarandet, och > 80% efter lyckad återhämtning. n = antal separata differentiering experiment (minst 600 celler räknas per prov och > 1600 celler per tidpunkt) (C) flödescytometri Flödesanalys visar 62% av de färska differentierade hPSC-LESCs och 81% av de upptinade cellerna positivt för p63α, bekräftar cellen räknar resultat för linje Regea08/017. * i B-C ange upptinade celler. Röd histogram för positivt prov och svart negativ (ofärgade) exempel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antikropp | Värd | Utspädning |
| Primära antikroppar för om | ||
| PAX6 | kanin | 1: 200 |
| p63α | mus | 1: 200 |
| ΔNp63α | kanin | 1: 200 |
| CK-15 | mus | 1: 200 |
| CK-14 | mus | 1: 200 |
| CK-12 | geten | 1: 200 |
| OCT3/4 | geten | 1: 200 |
| Sekundära antikroppar för om | ||
| Alexa Fluor 568 anti get Ig | åsna | 1:800 |
| Alexa Fluor 568 antimus Ig | åsna | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 anti-kanin Ig | åsna | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 antimus Ig | åsna | 1:800 |
Tabell 1: rekommenderade primära och sekundära antikroppar används för immunofluorescens (om) märkning av hPSC-derived LESCs. Se Tabell för material för tillverkare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det förväntade resultatet av detta protokoll är framgångsrik och robusta generation av LESCs från en enda cellsuspension av FF hPSC inom cirka 3,5 veckor. Som hornhinneepitelet utvecklas från ytan ektoderm29, syftar det första steget i protokollet till styrning hPSCs mot denna härstamning. En kort 24 h induktion med omvandla tillväxt factor-beta (TGF-β) antagonist SB-505124 och bFGF används för att framkalla ektodermala differentiering, följt av 48 h mesodermala BMP-4 cue att driva cellerna mot ytan Ektoderm. Följande vidhäftande differentiering steg på col IV/LN-521 kombination matris tillsammans med kemiskt definierade differentiering medium används för att vägleda ytterligare differentiering mot LESCs.
Hög kvalitet av utgångsmaterialet (den FF hPSCs) är avgörande för framgångsrik differentiering. Endast FF hPSC kulturer med nära sammanflödet och nära 100% av odifferentierade fenotyp bör användas. Regelbundna hPSC kromosomanalyser rekommenderas, eftersom enda cell passaging kan predisponera hPSCs till karyotypic avvikelser som leder till tillväxt och differentiering fördelar30. Långvarig exponering för trypsin kan orsaka otillräcklig EB bildandet eller hPSC död. Protokollet har testats med fem individuellt härrör och genetiskt distinkta hPSC linjer, både hESC och hiPSC linjer. Det fanns ingen anledning för cell linje specifika ändringar av liten molekyl koncentrationer eller induktion gånger. Dock under initial optimering av protokollet anges överdriven celldöd eller utseende av celler med fibroblastic, neuronala eller andra morfologi differentiering till oönskad härstamningar. I sådana fall kanske metoden kräver finjustering. Kultur fartyget format ger en utgångspunkt och kan skalas från de rekommenderade storlekarna.
Hela protokollet från hPSC kultur till ESF LESC differentiering och frysförvaring definieras, möjliggör enkel övergång till god tillverkningssed (GMP) för produktion av cell terapi produkter. Som kommersiella medier och reagenser genomgår robust utveckling, tillverkning och kvalitetskontroll, ger de en konsekvent, enhetlig kvalitet plattform för hPSC kultur och differentieringar. Angivna villkor minimera sats till sats variationen, som erbjuder en fördel jämfört med befintliga hPSC-ESF LESC differentiering protokoll10,11,12,13,14, 20 , 22 , 23. snabb och relativt enkla protokollet ger också en fördel över tredimensionella hornhinnan organoids som är svåra att standardisera i cellinjer och laboratorier, och kräver robusta metoder att rena önskade celltyper31 ,32. Dessutom ger högeffektiv protokollet robust sätt att producera LESCs för forskningsändamål, t.ex. sjukdom modellering, genteknik, drogkontroll och toxikologiska tester. Plattformen kan dessutom vara enkelt finjusteras för differentiering av andra okulära epitelial celltyper som retinal pigment epitelceller (RPE-celler)25.
Framgångsrik limbala cell ersättningsbehandling kräver bara några tusen p63-positiva LESCs4, per öga, men kvalitetssäkring kräver ytterligare cellpopulationer och därför storskalig produktion. Cryobanking gör beredningen av lättillgängliga cell bestånd för transplantation samt för kvalitets- och säkerhetstester. Vidare hPSC-ESF LESC renhet förbättras efter cryostoring och ytterligare efter passaging och långvarig kultur25, som föreslagits av ökad ΔNp63 uttryck.
Sammanfattningsvis genererar denna robust metod ΔNp63α-positiva celler från hPSCs inom 3,5 veckor xeno- och villkor feeder cellfria kultur. Cell kultur metoderna presenteras här möjliggör tillverkning av högkvalitativa LESCs för okulär cell terapi använder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Studien har finansierats av akademin av Finland (licensnummer 297886), det mänskliga reservdelar programmet av Tekes – utvecklingscentralen för teknologi och innovationer, finska ögat vävnad Bank stiftelse och Finska Kulturfonden. Författarna vill tacka de biomedicinska laboratorietekniker Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt och Outi Heikkilä för utmärkt tekniskt bistånd och bidrag till cellkultur. Professor Katriina Aalto-Setälä är erkänt för att tillhandahålla den hiPSC linjen används och BioMediTech Imaging Core facility för att tillhandahålla utrustning för fluorescens avbildning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
- International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
