Summary
Bu iletişim kuralı kornea limbal epitel kök hücre xeno - ve besleyici boş hücre kültür koşullar altında insan pluripotent kök hücrelerden ayırt için basit iki adımlı bir yöntem sağlar. Burada sunulan hücre kültür yöntemleri klinik kalite hücre kornea hücre terapisi kullanmak için uygun maliyet-etkin, büyük ölçekli üretim sağlar.
Abstract
Kornea limbal epitel kök hücreler (LESCs) sürekli yenileyerek kornea epitel ve böylece kornea homeostazı ve görsel netlik sağlamak için sorumludur. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC)-türetilmiş LESCs kornea hücre replasman tedavisi için umut verici bir hücre kaynağı sağlamak. Tanımsız, xenogeneic kültür ve farklılaşma koşulları araştırma sonuçlarında değişim neden ve hPSC elde edilen tedavi klinik tercümesi engel. Bu iletişim kuralı için hPSC-LESC farklılaşma xeno - ve besleyici boş hücre koşullar altında tekrarlanabilir ve verimli bir yöntem sağlar. İlk olarak, rekombinant laminin-521 (LN-521) ve tanımlanmış hPSC orta farklılaşmamış hPSC kültürünün monolayer saptamaları için yüksek kaliteli başlangıç malzemesi sağlam üretimi için bir temel olarak hizmet vermektedir. İkinci olarak, hızlı ve basit hPSC LESC ayırt etme yöntemi sadece 24 gün içinde LESC örneğin alınma olasılığını verir. Bu yöntem bir dört gün yüzey ektodermal indüksiyon LN-521/kollajen IV kombinasyonu matris tanımlanmış kornea epitel farklılaşma orta yapisan kültür aşaması gelir küçük molekülleri ile süspansiyon dahil eder. Cryostoring ve genişletilmiş farklılaşma daha fazla hücre nüfus arındırır ve bankacılık hücre hücre terapi ürünleri için büyük miktarlarda sağlar. Elde edilen yüksek kalite hPSC-LESCs limbal kök hücre eksikliği (LSCD) tedavisinde kornea yüzey yeniden inşası için potansiyel bir roman tedavi stratejisi sağlayabilir.
Introduction
Oküler yüzeyde saydam kornea retina girmek ışık ve gözün refraktif güç çoğunluğu sağlar. En dış katmanı, tabakalı kornea epitel sürekli limbal epitel kök hücreleri (LESCs) tarafından yeniden oluşturulur. LESCs corneoscleral kavşak1,2limbal nişler bazal tabaka yer alır. Kendi kimlik bir dizi sözde işaretleri daha kapsamlı bir analiz gerektirir böylece LESCs özel ve benzersiz işaretleri, eksikliği. Epitel transkripsiyon faktörü p63 ve özellikle N-ölümcül kesilmiş transkript p63 Alfa izoformu (ΔNp63α), bir ilgili olumlu LESC işaret3,4önerdi. Asimetrik Anabilim Dalı LESCs onları kendi kendini yenilemek, ama aynı zamanda centripetally ve anteriorly geçirmek Döl üretmek izin verir. Hücreleri ilerleme olarak kornea yüzeyine doğru onlar yavaş yavaş onların stemness kaybetmek ve son olarak da sürekli olarak kornea yüzeyinden kaybolur yüzeysel Skuamöz Hücre ölümcül ayırt etmek.
Kornea katmanlardan herhangi birini Damage için ciddi görme bozukluğu açabilir ve kornea kusurları böylece görme kaybı dünya çapında önde gelen nedenlerinden biridir. Limbal kök hücre eksikliği (LSCD), limbus hastalık ya da conjunctivalization ve opaklaşmasına kornea yüzey ve vizyon5,6sonraki kaybı yol açan travma tarafından yok edilir. Hücre replasman tedavisi otolog veya allojenik limbal Greftler kullanarak LSCD4,7,8,9olan hastalar için bir tedavi stratejisi sunmaktadır. Ancak, otolog greft hasat sağlıklı göz komplikasyon riski taşımaktadır ve donör doku kısa kaynağı olduğunu. İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs), özellikle insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) ve insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs), klinik hücre tipleri kornea epitel hücreleri de dahil olmak üzere, sınırsız bir kaynağı olarak hizmet verebilir. Bu nedenle, hPSC elde edilen LESCs (hPSC-LESCs) oküler hücre replasman tedavisi için çekici bir yeni hücre kaynağı temsil eder.
Geleneksel olarak, farklılaşmamış hPSC kültür yöntemleri ve farklılaşma protokolleri LESCs için tanımsız besleyici hücreler, hayvan sera, klimalı ortam veya amniyotik membran10,11, kullanımı yararlanmıştır 12 , 13 , 14 , 15. son zamanlarda, daha fazla standart ve xeno-Alerjik kültür ve farklılaşma protokolleri için arama çabaları daha güvenli hücre terapi ürünleri doğru isteniyor. Sonuç olarak, çeşitli tanımlı ve xeno-Alerjik farklılaşmamış hPSCs uzun vadeli kültürü için şimdi piyasada bulunan16,17,18yöntemlerdir. 19,20,21,22bir süreklilik, yönlendirilmiş farklılaşma kornea epitel kadere hPSCs Kılavuzu için moleküler ipuçları üzerinde güvenerek protokolleri son zamanlarda tanıttı gibi 23. Henüz bu protokollerin çoğunu ya da tanımsız, besleyici dayalı hPSCs malzeme veya karmaşık, xenogeneic büyüme faktörü kokteyl farklılaşma için başlangıç olarak kullanılır.
Bu iletişim kuralının amacını sağlam, en iyi duruma getirilmiş, xeno sağlamaktır- ve besleyici-Alerjik hPSC kültür yöntemi ve kornea LESCs için sonraki farklılaşma. Pluripotent hPSCs laminin-521 (LN-521) matris içinde tanımlanan, albümin-Alerjik hPSC Orta (özellikle temel 8 Flex) kültürünün monolayer homojen Başlangıç materyali saptamaları için hızlı üretim sağlar. Bundan sonra basit bir, iki adım farklılaşma stratejisi hPSCs yapisan farklılaşma tarafından LESCs için takip süspansiyon, yüzey ektodermal kadere doğru size yol gösterir. Nerede > %65 ΔNp63α hızlı bir hücre nüfus 24 gün içinde elde edilir. Xeno ve besleyici ücretsiz iletişim kuralı birkaç hPSC hattı (her ikisi hESCs ve hiPSCs), hücre satır belirli optimizasyonu için herhangi bir zorunluluğu olmadan test edilmiştir. Yüksek kaliteli LESCs için büyük gruplar halinde üretimi için burada açıklanan hafta sonu ücretsiz bakım, passaging, cryostoring ve hPSC-LESC fenotipleme iletişim kurallarını etkinleştirme klinik veya araştırma amaçlı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tampere Üniversitesi Ulusal insan embriyosu üzerinde araştırma yapmak için yetki Medicolegal işleri Finlandiya (Dnro 1426/32/300/05) onayı vardır. Enstitü aynı zamanda Etik Komitesi: Pirkanmaa hastane bölgesinin, kültür, türetme yapıp yapmayacağınızı ve hESC satırları (Skottman/R05116) ayırt etmek ve hiPSC satırları oftalmik araştırma (Skottman/R14023) kullanmak için destekleyici ifadeleri var. Yeni hücre satır bu çalışma için elde edilmiştir.
Not: açıklanan protokolü belirli, piyasada bulunan hPSC ve kornea epitel farklılaşma medya dayanmaktadır. Tablo malzemeleri üretici/tedarikçi bilgi ve Katalog numaraları için başvurun.
1. hPSC kültür Xeno ve besleyici ücretsiz kurulması
- Hazırlıklar
- 24-şey pilakalar ve insan rekombinant laminin-521 (LN-521) kat. İlk besleyici-Alerjik (FF) geçiş için LN-521 1,09 µg/cm2bir konsantrasyon ve 0.55 µg/cm2 aşağıdaki pasajlar için kullanın. Önerilen LN-521 konsantrasyonları başarılı FF kültür için bir başlangıç noktası olarak hizmet ama indirdi.
- LN-521 flakon yavaşça 4 ° C'de üretici tarafından talimat olarak çözme.
Not: Uygun şekilde işlenmiş LN-521 çözüm 4 ° C'de çözdürme sonra 3 ayda depolanmış olabilir. - Kaplama çözüm hazırlamak için uygun miktarda LN-521 hisse senedi çözüm ile 1 x Dulbecco'nın Phosphate-Buffered serum fizyolojik (Ca2 + ve Mg2 + 300 µL iyi başına toplam hacmiyle içeren DPBS) oranında seyreltin.
- Damlalıklı wells, kaplama çözüm parafilm ile iyi plaka mühür ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya Kaplamalı plakalar 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
(İsteğe bağlı): Alternatif olarak, kuluçkaya hızlı kaplama iletişim kuralı için iyi pilakalar ve kaplama çözüm için 2 h 37 ° c, % 5 CO2.
- LN-521 flakon yavaşça 4 ° C'de üretici tarafından talimat olarak çözme.
- HPSC kültür orta (özellikle temel 8 Flex) Bazal orta sağlanan ilave ile ilave tarafından üretici tarafından talimat olarak hazır olun. 50 U/mL penisilin-streptomisin ekleyin. Formülasyonu hafif ve yüksek ısıya duyarlı olduğunu unutmayın. Ek çözülme ve ışıktan korumalı medya, oda sıcaklığında (RT), sıcak. Takviyesi tarihinden itibaren iki hafta içerisinde ilave hPSC aracı kullanın.
- 24-şey pilakalar ve insan rekombinant laminin-521 (LN-521) kat. İlk besleyici-Alerjik (FF) geçiş için LN-521 1,09 µg/cm2bir konsantrasyon ve 0.55 µg/cm2 aşağıdaki pasajlar için kullanın. Önerilen LN-521 konsantrasyonları başarılı FF kültür için bir başlangıç noktası olarak hizmet ama indirdi.
- HPSC LN-521 üzerinde FF kültür için aktarma
- Tüm gerekli malzeme ve laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
- Besleyici Katmanlar (Örneğin insan Inaktif sünnet (hFF) veya fare embriyonik fibroblastlar) sistemde standart kültür veya diğer FF kültür sistemleri standart metodoloji kullanarak geçiş hPSCs. Örneğin, hPSC kolonileri hFF besleyici hücreler kültürlü bir neşter ile küçük parçalar ve parçaları bir iğne ucu ile ilişkisi kesildi kesmiştim. FF kültür sistemleri kullanarak kültürlü insan PSC'ler yöntemi ile veya olmadan önceki enzim tedavisi passaging küme kullanarak transfer edilebilir.
- LN-521 kaplama çözüm 24 kuyulardan kaldırın ve 1 mL önceden ısıtılmış hPSC orta iyi başına ekleyin.
Not: LN-521 kurutma üzerine devre dışı gibi Kuru kuyu izin vermez. - Koloni adet/hücre kümeleri LN-521 kaplı 24-kuyu hPSC orta bir pipet ile aktarın. 20-30 koloni adet iyi kuyuları aşırı kalabalık kaçınarak, başına aktarın.
- Orta hPSC orta 1 mL ile transfer ve bundan sonra her gün sonra gün değiştirin. Kültürler passaging 3-4 gün sonra hPSCs dışarı pürüzsüz, farklılaşmamış görünümdeki kolonileri için büyüdü için hazırsınız. Başvuru için bkz: Şekil 1B (ilk resim). İlk FF geçiş için koloniler için tam konfluent monolayer büyümeye izin verilmemelidir ama kolonileri yaklaşık bir boyutu 1 mm ulaştığınızda kültürler passaged.
- Passaging ve bakım FF hPSC kültür
- Tüm gerekli malzeme ve laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
- 80-%100 confluency kültür ulaşmıştır itibaren ikinci FF bölüm, FF hPSCs geçiş. Geçit FF hPSCs yeni LN-521 için iki kez bir hafta (Pazartesi ve Perşembe günleri) tek hücre passaging farklılaşmamış morfolojisi ile yüksek kaliteli kültürleri korumak için ve hafta sonu ücretsiz beslenme rejimi elde etmek için kullanarak 24-şey plakaları kaplı. Detaylar için lütfen18,24,25için bakın.
- FF hPSCs iki kez Ca2 + ve Mg2 +1 x DPBS 1 mL ile yıkayın.
- FF hPSCs xeno-Alerjik tripsin-EDTA (özellikle TrypLE seçin enzim) ile 37 ° C, % 5 CO2kuyuda başına 500 µL kuluçka tarafından bağlantısını kesin. Hücreleri yukarı yuvarlamak ama değil ayırmak için en uygun kuluçka süresi için izin. Bu genellikle 37 ° C, % 5 CO2 3 dakika sürer (5 dk fazla olamaz).
- Xeno-Alerjik tripsin-EDTA kaldırın ve hemen tanımlanmış tripsin inhibitörü kuyu başına 500 µL ekleyin.
- FF hPSCs bir tek hücre süspansiyon elde etmek için dikkatli, henüz tam pipetting tarafından bağlantısını kesin. FF hPSC süspansiyon önceden ısıtılmış hPSC orta içeren bir 15 mL konik santrifüj tüpüne 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla aktarın.
- 1 mL hPSC orta Wells'le yıkama ve çamaşır orta 15 mL konik santrifüj tüpü için ekleyin.
- Tek hücre süspansiyon için 300 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi, hücre Pelet Aspire edin ve 1 mL önceden ısıtılmış hPSC ortamda resuspend.
- Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak.
- LN-521 kaplama çözeltisi (0.55 µg/cm2) 24 kuyulardan kaldırın ve hPSC orta 1.2.3 olduğu gibi ekleyin.
- Plaka FF hPSCs 0,55 µg/cm2 LN-521 üzerine 24-wells, 40.000-50.000 hücreleri/cm2hücre yoğunluğu kaplı.
- Orta taze hPSC orta passaging sonra gün ve bundan sonra Pazar günleri hariç her gün değiştirin.
- Hücre farklılaşması için 3-4 gün passaging sonra ne zaman kültür ulaşmıştır kullanılmaya hazır > % 85 confluency. HPSCs yüksek kalitesini sağlamak için karakterizasyon yöntemleri ayrıntılı olarak önceki işleri18,24,25açıklanmıştır bakın. Bu sadece kültür hPSCs kadar geçiş Seviye 15 FF sistemdeki tek hücre karyotip değişiklikleri önlemek için passaging kullanarak önerilir. Sadece yüksek kaliteli, farklılaşmamış hPSCs malzeme saptamaları için başlangıç olarak kullanın.
2. yönlendirilmiş farklılaşma ve hPSC elde edilen LESCs dondurma
- Hazırlıklar
- Xeno-Alerjik bazal indüksiyon Orta (bazal indüksiyon orta) hazırlamak: ek Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (özellikle nakavt DMEM) % 15 xeno-Alerjik serumu değiştirme ile (spesifically CTS nakavt SR XenoFree), 2 mM L-glutamin, 0,1 mM 2 - mercaptoethanol, %1 non-gerekli amino asitler ve 50 U/mL penisilin-streptomisin. Bazal indüksiyon orta iki hafta içinde kullanın.
- Medya süspansiyon kültürü kornea indüksiyon için hazır olun.
- 1. gün: Bazal indüksiyon orta 5 mikron blebbistatin ile ek.
- 2. gün: 10 µM SB-505124 ve 50 ng/mL insan temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile bazal indüksiyon orta ek.
- Gün 3-4: 25 ng/mL kemik morfogenetik protein 4 ile ek bazal indüksiyon Orta (BMP-4).
- Kornea epitel farklılaşma Orta (farklılaşma orta, özellikle CnT-30) yapisan kültür için hazırlamak: üreticinin yönergelerine göre bazal orta takviyeleri ekleyin ve 50 U/mL penisilin-streptomisin ekleyin.
Not: Farklılaşma orta formülasyonu ışığa duyarlıdır. İlave farklılaşma orta takviyesi tarihi 6 hafta içerisinde kullanın. - Kat 100 mm doku kültürü yemekleri yapisan farklılaşma için (bkz. Adım 2.3) 0,5 µg/cm2 LN-521 1 x DPBS Ca2 + ve Mg2 +, bir toplam içeren içinde seyreltilmiş ve 5 µg/cm2 insan plasental kollajen tip IV (sütun IV) karışımı ile kaplama hacmi çanak başına 5 mL. Hazırlamak ve col IV kaplama ve LN-521 1.1.1.3 içinde açıklandığı gibi saklayın.
-
Adım ı: kornea indüksiyon süspansiyon kültürü
- Tüm gerekli malzeme ve laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
- FF hPSCs xeno-Alerjik tripsin-EDTA ile tek hücre süspansiyon için adımları 1.3.2.1–1.3.2.6 talimat olarak ayırmak. Hücreleri saymak ve 2-3 x 6-şey plaka, EB oluşumu ikna etmek için 5 mikron blebbistatin ile desteklenmiş bazal indüksiyon orta 3 mL hacmi içinde bir gecede 37 ° C, % 5 CO2 (gün 1) düşük ek başına 106 hücre dağıtmak.
- Ertesi gün (gün 2), orta kaldırmak ve 3 mL 10 µM SB-505124 ve 50 ng/mL bFGF ile desteklenmiş bazal indüksiyon orta yerine.
- Aşağıdaki iki gün (günde 3-4), orta kaldırmak ve 3 mL 25 ng/mL ile BMP-4 takıma bazal indüksiyon orta yerine.
- Adım II: Kornea farklılaşma yapisan kültür
- Tüm gerekli malzeme ve laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
- 5 günde 5 µg/cm2 col IV ve 0,5 µg/cm2 LN-521 ile kaplı 100 mm doku kültürü yemekleri üzerine aşağı EBs plaka.
- Kaplama çözüm 100 mm doku kültürü yemekleri kaldırın ve önceden ısıtılmış farklılaşma orta çanağı başına 10 mL ekleyin.
Not: Bulaşıkları LN-521 kurutma üzerine devre dışı gibi kuru izin vermez. - EBs bir 6-şey plaka de iki üç 100 mm doku kültürü yemekleri transfer (yaklaşık 50 cm2başına EBs) pipetting tarafından. EBs nazik sallayarak eşit dağıt.
- Kaplama çözüm 100 mm doku kültürü yemekleri kaldırın ve önceden ısıtılmış farklılaşma orta çanağı başına 10 mL ekleyin.
- 37 ° c, % 5 CO2orta yerine taze farklılaşma orta 10 mL ile önümüzdeki 2,5 – 3 hafta boyunca (Tarih Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) haftada üç kez, yapisan kültüründe hücreleri korumak. Hücreleri faz kontrast mikroskop kullanarak doğru epitelyal morfoloji ortaya çıkması için düzenli olarak denetleyin.
- Adım III: Cryo-bankacılık hPSC elde edilen LESCs
- Tüm gerekli malzeme ve önceden soğutulmuş dondurma orta dışında laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
- HPSC elde edilen LESCs xeno-Alerjik tripsin-EDTA ile bağlantısını kesin ve adımları 1.3.2.1–1.3.2.6 ama farklılaşma orta kullanma FF hPSCs için talimat olarak hücreleri saymak.
Not: hPSC elde edilen LESCs için en uygun kuluçka xeno-Alerjik tripsin-EDTA ile daha uzun zamanı (yaklaşık 5 dk). Xeno-Alerjik tripsin-EDTA ve tanımlanmış tripsin inhibitörü 3 mL 100 mm çanak kullanın. - Sayım sonra hücreler, vasıl 300 x g, 5 min için tekrar Santrifüjü orta Aspire edin ve hücre Pelet önceden soğutulmuş, xeno-Alerjik hPSC dondurma ortamda resuspend. Damlalıklı tek hücre süspansiyon cryotubes böylece her cryotube 1 mL dondurma orta 0.5-1 x 106 hücreler içerir.
- Tüpler bir dondurma konteyner ve-80 ° c hemen (5 dk) içinde transfer gecede yerleştirin.
- Ertesi gün, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen tüpleri aktarın.
- Adım IV: cryopreserved hPSC-LESCs çözme
- Çözdürme önce 5 µg/cm2 col IV ve 0,5 µg/cm2 LN-521 yemekleri/iyi pilakalar kat.
- Tüm gerekli malzeme ve laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
- Kaplama çözüm yemekleri/kuyulardan kaldırın ve uygun önceden ısıtılmış farklılaşma orta hacmi ekleyin.
Not: Bulaşıkları LN-521 kurutma üzerine devre dışı gibi kuru izin vermez. - Hücreleri hızlı bir şekilde RT, çözülme ve hücre süspansiyon önceden ısıtılmış farklılaşma orta 5 mL içeren 15 mL konik santrifüj tüpü hemen aktarın.
- 300 x g, de 5 dk Aspire edin ve Pelet farklılaşma ortamda herhangi bir dondurma orta kaldırmak için resuspend hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.
- Hücreleri yemekleri/kuyu 5 µg/cm2 col IV ve 0,5 µg/cm2 LN-521, 40.000-50.000 hücreleri/cm2yoğunluğu, farklılaşma ortamda ile kaplı üzerine plaka. 37 ° c, % 5 CO2haftada üç kez farklılaşma orta yerine, hücreleri korumak.
3. fenotipleme hPSC elde edilen LESCs
- Nitel ayirt Analizi
- Ayirt için 24 veya 12 iyi plaka wells ile 5 µg/cm2 col IV ve 0,5 µg/cm2 LN-521 ve plaka/tezcan hPSC-LESCs 40 yoğunluğu, farklılaşma orta kat 000 – 50 000 hücre/cm2.
- Kültürler confluency ulaştınız, hücreleri % 4 paraformaldehyde (PFA) ile fix: wells olmadan Ca2 + ve Mg2 +1 x DPBS ile iki kez yıkayın ve % 4 ile 15-20 dk kuluçkaya PFA RT. Bundan sonra herhangi bir PFA artıkları kaldırmak için iki kez 1 x DPBS ile yıkayın. Çözümleri de başına kullanım 0.5-1 mL.
Not: Sabit hücreleri 4 ° C'de 1 x DPBS boyama önce bir hafta depolanabilir.
Dikkat: PFA toksik ve aşındırıcı. İngiltere'de yılın bir duman mahallede işlemek ve koruyucu giysiler, göz koruması ve eldiven giymek. - 1 x DPBS Aspire edin ve hücre zarlarında Triton X-100 1 x DPBS içinde 10-15 dk % 0.1 ile kuluçka permeabilize.
- % 0.1 Triton X-100 ve blok nonspesifik antikor bağlayıcı siteleri RT. Prepare birincil antikor dilutions 1 x DPBS % 0.5 BSA içinde 1 x DPBS içinde % 3 Sığır serum albümin (BSA) ile 1 h için kuluçka tarafından Aspire edin.
Not: Tablo 1 için önerilen birincil antikor bakın. - %3 BSA Aspire edin ve uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor gecede 4 ° C'de ile kuluçkaya
- 3 kuyu yıkama 5 min için x 1 x DPBS ile. 1 x DPBS % 0.5 BSA ikincil antikor dilutions hazırlayın.
Not: Tablo 1 için önerilen ikincil antikor bakın. - 1 x DPBS Aspire edin ve ışıktan korunan RT, 1 h için uygun, uygun şekilde seyreltilmiş ikincil antikor ile kuluçkaya.
Not: Bu adımından floresan boyalar solmaya önlemek için ışıktan korunan örnekleri tutmak. - 3 kuyu yıkama x 1 x DPBS ile 5 dk ve nihayet counterstain çekirdeklerin 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve ortam takma floresan ile monte. DAPI ayrı olarak üreticinin talimatlarına göre kullanılan veya montaj orta dahil. Yer coverslips yuvarlak (çapı 19 mm ve 13 mm için 12-24-iyi ve levhalar, sırasıyla) her şey içinde. Kurutma ve depolama monte örnekleri ile ilgili üreticinin yönergeleri izleyin.
- Lekeli hücreleri floresan mikroskop ile görüntü.
- Nicel ayirt Analizi
- HPSC elde edilen LESCs nesne gözlükteki örnekleri cytospin hazırlayın.
- HPSC elde edilen LESCs xeno-Alerjik tripsin-EDTA ile bağlantısını kesin ve 2.4.2. adımda anlatıldığı gibi hücreleri saymak.
- Sayım sonra önceden soğutulmuş 1 x DPBS ve 300 x g. ayarlama numune hacmi, 5 min için santrifüj ve hücre konsantrasyon verilen cytocentrifuge, Örneğin , üreticinin yönergelerine göre 150 µL örnek hacmi içinde 50.000-100.000 hücreleri ekleyin.
- Hücreleri nesne gözlük ile bir cytocentrifuge Örneğin 5 dk 28 x g ve düzeltme % 4 ile 15-20 dk için hemen aşağı spin PFA RT., 1 x DPBS içinde Önerilen iplik zaman ve hız için verilen cytocentrifuge talimat kılavuzuna bakın.
- Adımları 3.1.3–3.1.8 kullanım sıvı engelleyici kalem örnekleri hidrofobik bir daire ile çevrilidir ve ekonomik uygulama için damlacık boyama yapmak için açıklandığı gibi cytospin örnekleri boyama için devam edin. Yıkar kapları ile slayt sahipleri, aşırı antikor ve minimal arka plan boyama verimli kaldırılmasını sağlamak için gerçekleştirilebilir. Çekirdeklerin DAPI ile counterstain ve coverslips ile kapsayan ortam takma floresan ile lekeli örnekleri bağlayabilirsiniz. Kurutma ve depolama monte örnekleri ile ilgili üreticinin yönergeleri izleyin.
- 5 – 10 çekim Örneğin 10 X büyütme floresan mikroskop kullanarak rasgele seçilen konumlardan örnek başına.
- Örneğin ImageJ görüntü işleme ve analiz yazılımı (https://imagej.nih.gov/ij/) araçları ile toplam (DAPI pozitif) hücrelerle ilişkili olarak olumlu lekeli hücreleri yüzdesini tahmin ediyoruz. Tercihen analiz > örnek başına 500 hücre.
- Açık belgili tanımlık imge ImageJ yazılımında analiz edilecek. Yinelenen görüntü ve gürültü çıkarmak için varsayılan Gauss Bulanıklığı filtresi.
- Bir eşik oluşturun. Olumlu lekeli hücre çekirdeği en iyi seçim için eşik değerleri ayarlamak ve uygulayın. Çoğaltılmış görüntü şimdi ikili bir görünüme dönüştürülür.
- İşlemi ikili işlemciler ile ikili resim "Dolgu delik" ve "havza", otomatik olarak birleştirilmiş alanları tek çekirdek temsil eden ayrı olacak araçları.
- Otomatik olarak liste bölgeleri çıkarları (ROIs) komutu uygulamadan üzerine açılacak ROI Yöneticisi penceresi için için "Analiz parçacıklar" aracını kullanın. İkili resim kapatın.
- Orijinal görüntüdeki ROIs "ROI Yöneticisi'nde tüm göster" seçerek görselleştirin. Lekeli hücre çekirdeği doğru seçim doğrulayın ve gerekirse, el ile kaldırın ve bireysel seçimleri ekleyin.
- HPSC elde edilen LESCs nesne gözlükteki örnekleri cytospin hazırlayın.
- Akış Sitometresi Analizi
- P63α ifade düzeyleri onaylamak için akış sitometresi için hücreleri leke.
- HPSC elde edilen LESCs xeno-Alerjik tripsin-EDTA ile bağlantısını kesin ve 2.4.2. adımda anlatıldığı gibi hücreleri saymak.
- Hücreleri iki kez ile 1 mL 1 x DPBS önceden soğutulmuş ve 300 x g. düzeltme, 5 min için santrifüj kapasitesi ve 4 ° C'de 20 dk için kullanıma hazır fiksasyon/permeabilization çözüm ile permeabilize yıkama Bundan sonra yıkayın 1 mL iki kez hücrelerle yıkama arabellek permeabilizing x 1 önceden soğutulmuş.
Not: Bu adımından hücreleri 4 ° C'de veya buz üzerinde Aksi belirtilmedikçe tutun. - Dikkat: % 4.2 formaldehit fiksasyon/permeabilization çözüm içerir. Bir duman hood tehlikeli çözümde işlemek ve koruyucu giysiler, göz koruması ve eldiven giymek.
- Örnekleri 5 mL polipropilen tüpler içine bölün. Her örnek 100.000-200.000 hücreleri içermelidir ve numune hacmi yaklaşık 100 µL yıkama arabellek x 1 için ayarlanmalıdır.
- Birleşik fluorochrome p63-α FACS antikor 2 µL ekleyin (önerilen antikor için malzeme ve tesisatlar tablo bkz.) örnek tüpler içine. Bir örnek negatif denetimi hizmet için günahı bırakın. Girdap örnekleri ve ışıktan korunan RT, 1 h için kuluçkaya.
- İki kez önceden soğutulmuş 1 yıkama arabellek x 1 mL içeren hücreleri yıkama ve son olarak, granül 300 µL arabelleği ile resuspend. Tüpler buza, ışıktan korunan saklayın.
- Akış sitometresi ile örnekleri analiz. Günahı negatif kontrol örnek için doğru hücre nüfus çoğunluğuna ve floresan arka plan sinyal dışlamak için kullanın. En az 10.000 p63-α analiz-hücreleri lekeli. Ayrıntılı teknik uygulama için verilen akış sitometresi Kullanıcı kılavuzuna bakınız.
- P63α ifade düzeyleri onaylamak için akış sitometresi için hücreleri leke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HPSC-LESCs için hPSCs
FF hPSCs cryostoring hPSC-LESCs için farklılaşma inducing üzerinden tüm süreç yaklaşık 3,5 hafta sürer. Şekil 1A' onun anahtar adımlar vurgulayarak farklılaşma yönteminin şematik genel bakış sunulur. Şekil 1B hücre nüfusun tipik türleri morfoloji protokol farklı aşamalarında gösterir. Sunulan veri Regea08/017 hESC çizgi ile UTA.04607.WT hiPSC çizgi, hem elde edilen ve daha önce26,27,28açıklandığı gibi Tampere, Finlandiya, üniversite ile karakterize ile elde edilir.
LN-521 üzerinde hPSC ortamda, farklılaşmamış, yüksek kaliteli FF hPSCs ilk izdiham (Şekil 1B, ilk görüntü) üzerine homojen monolayers birleşerek keskin kenarlar ile farklı koloniler oluştururlar. Birden fazla tek tek türetilmiş ve genetik olarak farklı hESC ve hiPSC satır başarıyla uyarlanmış ve bu sistemle kültürlü. FF hPSC nüfus yaklaşık 3-fold çarpmak her geçiş içinde xeno oluşturmak için sağlam anlamına gelir sağlayan- ve besleyici-ücretsiz malzeme saptamaları25için başlangıç. EB orta 24 h indüksiyon genellikle sıkı, düzenli EBs (Şekil 1B, ikinci resim) farklı boyutlarda bir süspansiyon üretir. Süspansiyon (gün 2 – 4), yüzey ektodermal indüksiyon sırasında EB morfoloji önemli ölçüde değiştirmemelisiniz. Koloni akıbet belirir yakında EBs col IV/LN-521 kombinasyonu matris farklılaşma Orta (Şekil 1B, üçüncü ve dördüncü fotoğraf) üzerine kaplama ve 21-25 gün içinde farklılaşma hücreleri konfluent homojen katmanları ile oluşturur. poligonal Morfolojisi epitel hücreleri (Şekil 1B, beşinci resim) tipik. Hücreleri daha sonra cryostored daha sonra kullanmak için olabilir. Canlılık ve morfoloji hPSC LESCs (Şekil 1B, son görüntü) çözdürme sonra iyi korunmuş.
Genellikle, tek bir 6-şey plakasına kaplama 3 x 106 FF hPSCs 2-3 hücre kültür yemekleri (100 mm) yapisan kültür için kaplama için yeterli EBs verim. Her 100 mm yemeğin 1-1.5 x 106 hücre cryobanking için gün 22-25 tarafından farklılaşma hasat. Ortalama olarak her farklılaşmamış FF hPSC gün 25 (Şekil 2) 0.7 hücreleri oluşturur.
HPSC elde edilen LESCs doğrulama
Belirli LESC işaretçisi proteinler yokluğunda, doğru hücre fenotip pluripotency ifade azalma proteinler ilişkili ve ifade kabul LESC işaretleri artış gösteren işaretleri bir dizi ile doğrulanır. Gün 24 farklılaşma, hPSC elde edilen LESCs hızlı çiftli büyük çoğunluğu kutu protein PAX6 (PAX6), göz geliştirme, hem de p63α, tanınmış LESC işaretçisi anahtar regülatörü. Kesilmiş p63-izoformu ΔNp63 en kornea özel ΔNp63α pozitif hücre fenotip teyit p63α pozitif hücrelerinin çoğunda ortak ifade. Pluripotent kök hücre işaretçisi OCT3/4 ve olgun kornea epitel marker CK-12 Bu noktada fark edilmez ise bazal epitelyal işaretleri ve sözde LESC işaretleri cytokeratin (CK) -15 ve CK-14 kısmen ifade edilir. Bu FF hPSCs unipotent limbal epitel ataları doğru farklılaşma ancak henüz terminal farklılaşma olgun kornea epitel hücreleri gösterir. (Şekil 3A) HPSC LESCs onların fenotip cryostorage ( Şekil 3Aiçin karşılaştırılabilir veri) kurtarma sonra başarılı bir şekilde korur.
Farklılaşma 24 gün sonra ΔNp63 %66.2 ifade edildi (n %9,3 33, SD =) Regea08/017 hESC-LESCs ve %65.7 (n = 10, SD %4.1) uta.04607.wt hiPSC-LESCs (cytospin örnekleri, Şekil 3Bsayılabilir). Cryostorage, %82,2 kurtarma sonra (n = 10, SD = % 5.7) hESC-LESCs ve %90,5 (n = 10, SD=3.7%) hiPSC-LESCs ΔNp63 (iyi gün 26-28, 3B rakamtabaklarda gelen sayısal) dile getirdi.
P63α ifade daha fazla Akış Sitometresi Analizi için Regea08/017 hESC-LESCs ile doğrulandı. Farklılaşma 25 gün, taze farklılaşmış hPSC LESCs %62 p63α için olumlu idi. İki gün sonra kurtarma cryostorage (gün 28 içinde toplam), %81 hücrelerin p63α pozitif (Şekil 3 c) idi.
Şekil 1: hPSC-LESC farklılaşma Protokolü (A) ve tipik hücre türleri morfoloji şematik gösterimi (B) sürecinin farklı aşamalarında gözlenen. EBs yüksek kaliteli bir tek hücre süspansiyon kurulan, ilk 24 h üç gün küçük molekül indüksiyon yüzey ektoderm süspansiyon doğru sırasında farklılaşmamış hPSCs yapisan ayırt etme aşaması gelir. Tarafından gün 24 farklılaşma, hücreleri çoğunluğu tipik LESC benzeri morfoloji göster. Öncesi ve sırasında farklılaşma Regea08/017 hESC satır için gösterilen temsilcisi görüntüler. Siyah ölçek bar = 200 µm, panelinde tüm görüntüler için geçerli. Kısaltmalar: Blebb.: blebbistatin, SB: SB-505124 küçük molekül inhibitörü, bFGF: temel fibroblast büyüme faktörü, BMP-4: kemik morfogenetik protein 4, LN-521: insan rekombinant laminin 521, col IV: insan plasental kollajen tip IV, hPSC: insan pluripotent kök hücre, EB: embryoid vücut, LESC: limbal epitel kök hücreler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: beklenen hücre verim. Cryostoring gün 22-25 gün 0 EB oluşumu adım için kaplama farklılaşmamış hPSCs sayısı bölü farklılaşma için hücre sayısını gösteren öğretici Boxplots elde. Hücreleri her pluripotent hücreler her UTA.04607.WT hiPSC üretildi: 0.78 (SD 0,67) ise Regea08/017 hESC imal ortalama 0,72 üzerinde (SD 0,4). n: farklılaşma denemeleri sayısı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Beklenen hPSC elde edilen LESCs fenotip. (A)gösteren tek tip ifade göz geliştirme regülatörü PAX6 ve kabul LESC işaretleri p63α ve onun ΔNp63 izoformu yanı sıra iki diğer etiketleme ayirt antikor LESC işaretleri - CK15 ve 14 önerdi. Pluripotent işaret OCT3/4 ve olgun kornea epitel marker CK-12 negatifsin. Regea08/017 hESC-LESCs için farklılaşma 24 gün gösterilen temsilcisi Eğer görüntüler. Ölçek çubukları = 100 ΔNp63 taze sayma µm. (B) hücre Ayrıştırılan ve cryostored hPSC-LESCs gösteren hücreleri değil sadece korur, ancak cryostorage sonra artan ΔNp63 ifadesi göster. Hücre sayımı sonuçları göster > taze farklılaşmış hPSC LESCs % 65'i lekeli ΔNp63 önce cryobanking yordam için olumlu ve > %80 başarılı kurtarma sonra. n = ayrı farklılaşma denemeleri sayısı (en az 600 hücre sayılan örnek ve > 1600 hücreleri süresi noktası) (C) Akış Sitometresi Analizi taze farklılaşmış hPSC LESCs % 62 ve çözdürülen hücrelerinin % 81'i p63α, pozitif gösterilen Sonuç satırı Regea08/017 için sayma hücre doğrulanıyor. * B-C içinde çözülmüş hücreleri gösterir. Kırmızı çubuk grafik olumlu örnek ve siyah negatif (günahı) örnek için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Antikor | Ana bilgisayar | Seyreltme |
| If için birincil antikorlar | ||
| PAX6 | tavşan | 1: 200 |
| p63α | fare | 1: 200 |
| ΔNp63α | tavşan | 1: 200 |
| CK-15 | fare | 1: 200 |
| CK-14 | fare | 1: 200 |
| CK-12 | keçi | 1: 200 |
| OCT3/4 | keçi | 1: 200 |
| If için ikincil antikorlar | ||
| Alexa Fluor 568 Anti-keçi IG | eşek | 1:800 |
| Alexa Fluor 568 Anti-fare IG | eşek | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 Anti-tavşan IG | eşek | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 Anti-fare IG | eşek | 1:800 |
Tablo 1: birincil ve ikincil antikorlar (Eğer hPSC elde edilen LESCs etiketleme) ayirt için kullanılan önerilen. Tablo malzemeleri üreticileri için bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beklenen bu iletişim kuralı başarılı ve sağlam nesil LESCs FF hPSC bir tek hücre süspansiyon üzerinden yaklaşık 3,5 hafta içinde sonucudur. Kornea epitel yüzey ektoderm29geliştirir Protokolü'nün ilk adım hPSCs bu soy doğru direksiyon amaçlamaktadır. Dönüştürme büyüme faktörü beta (TGF-β) antagonisti SB-505124 ve bFGF ile bir kısa 24 h indüksiyon ektodermal farklılaşma, 48 h Mezodermal BMP-4 isteka yüzey ektoderm karşı hücreleri itmek için ardından ikna etmek için kullanılır. Col IV/LN-521 kombinasyonu matris kimyasal olarak tanımlanmış farklılaşma orta ile birlikte aşağıdaki yapisan farklılaşma basamakta daha fazla farklılaşma LESCs doğru rehberlik için kullanılır.
Yüksek malzeme kalitesi ve başlangıç (FF hPSCs) başarılı farklılaşma için önemlidir. Sadece FF hPSC kültürleri ile kesiştiği yerde ve farklılaşmamış fenotip % 100'ünü kullanılmalıdır. Tek hücre passaging hPSCs büyüme ve farklılaşma avantajları30' a kurşun karyotip anomalileri yatkınlık gibi düzenli hPSC keratinosit, tavsiye edilir. Uzun süre maruz kalmak tripsin yetersiz EB oluşumu veya hPSC ölüme neden olabilir. Protokol beş ayrı ayrı elde edilen ve genetik olarak farklı hPSC çizgiler, hem hESC hem de hiPSC ile test edildi. Hücre satır belirli değişiklikler küçük molekül konsantrasyonları veya indüksiyon kez gerek yok oldu. Ancak, protokol ilk duruma getirilmesi sırasında farklılaşma istenmeyen soy için aşırı hücre ölümü veya fibroblastic, nöronal veya diğer görünümdeki hücrelerinin görünümü gösterilir. İçinde öyle hal, belgili tanımlık yöntem ince ayar gerektirebilir. Kültür gemi biçimleri bir başlangıç noktası sağlar ve önerilen boyutları upscaled.
Terapi ürünleri kolay geçiş için iyi üretim uygulaması (GMP) hücre üretimi için izin LESC başkalaşım ve dondurma hPSC kültüründen Protokolü tüm tanımlanır. Ticari medya ve Kimyasalları sağlam geliştirme, üretim ve kalite kontrol prosedürlerinin geçmesi gibi onlar hPSC kültür ve saptamaları için tutarlı, tek kalite platformu sağlar. Varolan hPSC-LESC farklılaşma protokolleri10,11,12,13,14, üzerinde bir avantaj sunan toplu iş toplu iş varyasyon tanımlanmış koşulları en aza indirmek 20 , 22 , 23. hızlı ve nispeten basit protokolü de hücre satırları ve laboratuvarlar arasında standartlaştırmak ve istenen hücre tipleri31 arındırmak için güçlü Yöntemler gerektirir zor olan üç boyutlu kornea organoids üzerinde bir avantaj sağlar ,32. Ayrıca, yüksek verimli iletişim kuralı LESCs araştırma amaçlı, Örneğin hastalık modelleme, genetik mühendisliği, uyuşturucu tarama ve toksikolojik test için üretmek için sağlam araç sağlar. Ayrıca, belgili tanımlık peron-ebilmek var olmak kolayca farklılaşma retina pigment epitel hücreleri (RPE hücrelerinin)25gibi diğer oküler epitel hücre türleri için ince ayar.
Sadece birkaç bin p63 pozitif LESCs4, göz, başına başarılı limbal hücre replasman tedavisi gerektirir ancak ek hücre popülasyonlarının ve bu nedenle büyük ölçekli üretim kalite güvencesi gerektirir. Cryobanking nakli için hem de kalite ve güvenlik testi için hazır hücre stokları hazırlanması sağlayan. Ayrıca, hPSC-LESC saflık cryostoring sonra geliştirir ve passaging ve uzun süreli kültür25, artan ΔNp63 ifade tarafından önerilen sonra daha fazla.
Özet olarak, bu güçlü yöntem xeno - ve besleyici boş hücre kültür koşullar altında 3,5 hafta içinde hPSCs ΔNp63α pozitif hücreler oluşturur. Burada sunulan hücre kültür yöntemleri üretim yüksek kaliteli LESCs oküler için geçerli hücre terapisi kullanım sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Çalışma Finlandiya (grant numarası 297886) Akademisi, insan yedek parça programı Tèkèsī, Fince finansman ajansı tarafından teknoloji ve yenilik, desteklenmiştir Fin göz ve doku Bankası Vakfı ve Fin Kültür Vakfı. Yazarlar Biyomedikal Laboratuar teknisyenleri bozuştuk Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt ve sonunda Heikkilä mükemmel teknik yardım ve hücre kültürü katkısı için teşekkür ederiz. Profesör Katriina Aalto-Setälä kullanılan hiPSC hattı ve BioMediTech Imaging Core tesisi ekipman floresans görüntüleme için sağlamak için sağlamak için kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C.
- International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
