Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تعديل ناقلات التعبير باكولوفيروس لإنتاج يفرز البروتينات النباتية في خلايا الحشرات

Published: August 20, 2018 doi: 10.3791/58283
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular and Structural Biochemistry, College of Agriculture and Life Sciences, North Carolina State University

Summary

نقدم هنا، البروتوكولات من أجل الاستفادة من الحشرات خلية باكولوفيروس البروتين التعبير النظام وإنتاج كميات كبيرة من البروتينات النباتية يفرز لبلورة البروتينات. لقد تم تعديل ناقل تعبير باكولوفيروس مع GP67 أو الببتيد إشارة هيمولين الحشرات للنبات التعبير إفراز البروتين في خلايا الحشرات.

Abstract

لقد كان تحديا للعلماء للتعبير عن المؤتلف البروتينات حقيقية النواة الافرازية لدراسات هيكلية والبيوكيميائية. نظام التعبير باكولوفيروس بوساطة الحشرات الخلية واحدة من النظم المستخدمة للتعبير عن البروتينات الافرازية التوكسينات المؤتلف مع بعض التعديلات بوستترانسلاشونال. البروتينات الافرازية بحاجة إلى توجيه من خلال مسارات الافرازية للبروتين جليكوسيليشن وتشكيل روابط ثنائي كبريتيد وتعديلات أخرى بوستترانسلاشونال. لتحسين التعبير خلية الحشرات الموجودة من البروتينات النباتية الافرازية، يتم تعديل ناقل تعبير باكولوفيروس بإضافة أما GP67 أو إشارة هيمولين ببتيد تسلسل بين المروج ومواقع متعددة الاستنساخ. أنتجت هذا النظام الموجه المعدلة المصممة حديثا بنجاح عائد عالية من البروتينات مستقبلات النبات يفرز المؤتلف القابلة للذوبان من نبات التمويل. اثنين من البروتينات النباتية المعرب عنها، المجالات خارج الخلية من مستقبلات غشاء البلازما أعطيت تقرير التجارة والتنمية، و PRK3، وقد تبلور لدراسات الأشعة السينية بلورية. ناقل تعديل النظام هو أداة محسنة التي يمكن أن تستخدم للتعبير عن البروتينات الافرازية المؤتلف في المملكة الحيوانية، وكذلك.

Introduction

لا بد لمعمل أبحاث لتكون قادرة على إنتاج كميات كبيرة من البروتينات المؤتلف متجانسة للأوصاف البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية، خاصة بالنسبة لدراسات الأشعة السينية بلورية. هناك العديد من أنظمة تعبير مغايرة راسخة مثل الإشريكيّة القولونية، الخميرة، خلايا الحشرات، وخلايا الثدييات، والخلايا النباتية، إلخ فيما بينها، ونظام التعبير باكولوفيروس بوساطة الحشرات الخلية واحد من أهم يشيع استخدام تقنيات لإنتاج كميات كبيرة من مطوية هيكلياً الحجم الكبير المؤتلف التوكسينات البروتينات ل بلورة البروتينات1.

ناقلات التعبير منظومة التعبير باكولوفيروس صممت لتحتوي على بوليهيدرين قوية أو مروج P10 لإنتاج عائد عالية من البروتينات داخل الخلايا المؤتلف2،3. جعل باكولوفيروس المؤتلف، هو استنساخ الجينات للفائدة إلى متجه الحشرات المحتوية على محور الجينوم multi-نوكليوبوليهيدروفيرال كاليفورنية أوتوجرافا بوليهيدرين (بلح). ثم يتم تعيين تسلسل البناء الناتجة ويتم التحقق من إطاره الصحيح القراءة المفتوحة (ORF). بناء الصحيح ثم أدخلت الخلية المضيفة الحشرات من خلال عملية تعداء. ويتم إدراج الجينات التي تهم الجينوم الفيروسي باقترانها مثلى. نتائج هذا الحدث في إنتاج الجينوم الفيروسي المؤتلف، التي replicates ثم إنتاج المؤتلف كما جزيئات الفيروس1.

الخلايا الحشرات التي هي الأكثر شيوعاً في نظام التعبير خلايا (Hi5) خمسة Sf9 وعالية. الخلايا Sf9 عزل الاستنساخ من Sf21، المستمدة من خلايا المبيض الخوادر Spodoptera فروجيبيردا، وخلايا Hi5 عزل الاستنساخ المستمدة من الوالدين ني تريتشوبلوسيا خلية المبيض خط TN-3684،5. ترانسفيكشنز المشارك، وتضخيم الفيروس، وفحوصات البلاك تجري على الخلايا Sf9، بينما يتم عادة تحديد الخلايا Hi5 لإنتاج كميات أكبر من البروتينات المؤتلف6. تجدر الإشارة إلى أن الخلايا Hi5 ليست مناسبة لتوليد والتضخيم من نسلها الفيروس بسبب ميلها لإنتاج فيروسات المسخ. تقليديا، تعتبر درجة حرارة تتراوح من 25-30 درجة مئوية لتكون جيدة لزراعة خلايا الحشرات. ومع ذلك، أفيد أن 27-28 درجة مئوية هي درجة الحرارة المثلى لخلية الحشرات النمو والإصابة7،8.

مطلوب إدخال تسلسل إشارة قوية تسبق الجينات للتعبير عالية من البروتينات يفرزها. أن دليل التسلسل إشارة كفاءة البروتين المؤتلف المترجمة في هيولى لإفراز البروتين وبوستترانسلاشونال التعديلات اللازمة لطي السليم وتحقيق الاستقرار3. تم اختيار إشارة الببتيد تسلسل، مثل باكولوفيروس تغليف البروتين GP64/67، ميليتين نحل العسل، وغيرها، لتيسير التعبير عن البروتينات الافرازية المؤتلف في نظم التعبير بوساطة باكولوفيروس3. ثبت الأخذ بإشارة الببتيد من GP67 إلى زيادة غلة التعبير يفرز بروتين المؤتلف، بالمقارنة مع استخدام الببتيد إشارة الجوهرية ل الجينات الهدف9. هيمولين بروتين هيموليمف من فراشة الحرير العملاقة سيكروبيا هيالوفورا، التي يسببها عند الإصابة بالبكتيريا10. نظراً لمستوى عال نسبيا من التعبير المستحث، يمكن استخدام تسلسل الجين الببتيد إشارة التوسط من أجل التعبير إفراز البروتينات المؤتلف في نظام الخلية باكولوفيروس الحشرات.

(أ) التمويل تراتشيري عنصر التمايز المثبطة عامل مستقبلات (تقرير التجارة والتنمية) وحبوب اللقاح مستقبلات كيناز 3 (PRK3) على حد سواء تنتمي إلى عائلة النباتات الغنية لوسين تكرار مثل مستقبلات كيناز (لر-رلك) من البروتينات11،12 . من أجل دراسة هيكل ووظيفة هذه الأسرة من مستقبلات البروتينات النباتية، كذلك فيما يتعلق بتسهيل وصف غيرها من البروتينات النباتية يفرز الهيكلية والبيوكيميائية، تم تعديل نظام التعبير الحشرات باكولوفيروس الخلية إلى تحسين الغلة جودة وإنتاج البروتين. المجالات خارج الخلية لتقرير التجارة والتنمية و PRK3 بنجاح وأعربت استخدام ناقلات التعبير معدلة اثنين في نظام التعبير خلية باكولوفيروس الحشرات. وقد تبلورت المجالين خارج الخلية البروتينات تقرير التجارة والتنمية، و PRK3. تقارير هذه المادة بالتعبير وتنقية كميات كبيرة من البروتينات النباتية يفرز المؤتلف مع ناقلات التعبير باكولوفيروس معدلة اثنين بإدماج GP67 أو تسلسل إشارة هيمولين بين المروج والاستنساخ لأغراض متعددة المواقع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتم استخدام نظام الحشرات خلية/باكولوفيروس مع ناقلات التعبير معدلة للتعبير البروتين المصنع الافرازية والتبلور.

1-تعديل ناقل التعبير باكولوفيروس مع الببتيد GP67 إشارة للتعبير إفراز البروتين النباتي

  1. توليف الحمض النووي جزء يحتوي على 5 ' بجليي قطع موقع13وتسلسل إشارة إفراز GP67، وموقع الاستنساخ متعددة مع نوتي، بامهي، اكوري، ستوي، سالي، سبيي، إكسباي، وبسطي وزهوي (الشكل 1A).
    ملاحظة: نظراً بجليي وبامهي يهضم الحمض النووي أدى إلى نهايات لاصقة نفس، ناقل خطية يمكن اضطر إلى الجزء الحمض النووي هضمها بينما سوف تحور مواقع كلا من بجليي وبامهي في تسلسل عملية ربط الملدنة لتسلسل غير كليافابلي أما بجليي أو بامهي14.
  2. خلاصة 4 ميكروغرام من الحمض النووي مع بجليي وزهوي وميكروغرام 4 من متجه التعبير الحمض النووي مع بامهي وزهوي14. مزيج من 10 وحدات لكل إنزيم التقييد مع الحمض النووي في 1 × تركيز رد فعل المخزن المؤقت (خلات البوتاسيوم 50 مم، 20 مم تريس-خلات خلات المغنيسيوم 10 ملم و 100 ميكروغرام/مل جيش صرب البوسنة، الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية) واحتضان المخلوط في 37 درجة مئوية ح 4.
    1. تنقية قصت جزء الحمض النووي وناقلات خطية الحمض النووي الحمض النووي جل استخراج طقم15.
  3. مزيج 100 نانوغرام من ناقلات خطية الحمض النووي مع 400 نانوغرام من الحمض النووي هضمها تجزئة في خليط رد فعل ربط 10 ميليلتر يحتوي على 1 × وحدات 5 T4 الحمض النووي والحمض النووي T4 ليجاسى رد فعل المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl و 10 مم مجكل2، ATP 1 مم، 10 مم DTT، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ليجاسى. احتضان الخليط رد فعل على 16 درجة مئوية ح 16.
  4. تحويل 5 ميليلتر من خليط ربط 100 ميليلتر من DH5α الخلايا المختصة بعد بروتوكول تحويل قياسي وحدد المستعمرات الناتجة على لوحة أجار الأمبيسلّين رطل16. التقاط المستعمرات 5-10 وتنمو كل مستعمرة في 2 مل من رطل المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين في 220 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز ح 16.
  5. استخراج كل بلازميد الحمض النووي مع مجموعة17 مينيبريب الحمض النووي وتأكيد المستنسخين بتسلسل الحمض النووي مع تمهيدي أجتاتتتاكتجتتتكجتاكاج.
  6. بكر تضخيم الجين تقرير التجارة والتنمية (أ) التمويل تفتيت بقايا ترميز 30-642 من جين TDR اصطناعية بناء (الأمام التمهيدي: "كاتج جكجككجك كتكاجتتتكاككتكاكتكتجتك"، عكس التمهيدي: GC جاتكك كبار المستشارين التقنيين دايمنشن دايمنشن ATG دايمنشن دايمنشن دايمنشن أككجتكتاتاتكتجكاتتككجك). تضخيم الحمض النووي لدورات 30 في المخزن مؤقت رد فعل بوليميريز الحمض النووي تحتوي على مزيج دنتب 0.5 مم، 0.2 ميكرون الإشعال، 0.1 ميكروغرام من قالب الحمض النووي، 0.4 مم مجكل2و 1 وحدة رد الفعل بوليميريز الحمض النووي.
    1. خطوات دورة بكر، تعيين تمسخ الأولى عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ومن ثم 30 دورات تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، الصلب في 55 درجة مئوية 30 ثانية، وتمديد في 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، مع تمديد نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. هضم جزء بكر وناقل معدلة مع إنزيمات التقييد endonuclease NotI وبامهي. سد جزء الجينات مع ناقل خطية. مزيج 100 نانوغرام من ناقلات خطية الحمض النووي مع 400 نانوغرام من الحمض النووي هضمها تجزئة في خليط رد فعل ربط 10 ميليلتر يحتوي على الحمض النووي T4 ليجاسى رد فعل المخزن المؤقت و 5 وحدات من ليجاسى T4 الحمض النووي. احتضان الخليط رد فعل على 16 درجة مئوية ح 16.
  8. تحويل 5 ميليلتر من خليط ربط 100 ميليلتر من DH5α الخلايا المختصة بعد بروتوكول تحويل قياسي وحدد المستعمرات الناتجة على لوحة أجار الأمبيسلّين رطل16. تأكيد النسخ الصحيحة بتسلسل الحمض النووي.

2-تعديل ناقل التعبير باكولوفيروس مع الببتيد هيمولين الحشرات إشارة للتعبير إفراز البروتين النباتي

  1. توليف الحمض النووي جزء يحتوي على 5 ' بجليي قطع موقع13وتسلسل إشارة إفراز هيمولين الحشرات، وموقع الاستنساخ متعددة مع نوتي، بامهي، اكوري، ستوي، سالي، سبيي، إكسباي، وبسطي وزهوي (الشكل 1B).
  2. خلاصة 4 ميكروغرام من الحمض النووي مع بجليي وإكسهوي، وميكروغرام 4 من متجه التعبير الحمض النووي مع بامهي وإكسهوي14. مزيج من 10 وحدات لكل إنزيم التقييد مع الحمض النووي في 1 × تركيز رد فعل المخزن المؤقت (خلات البوتاسيوم 50 مم، 20 مم تريس-خلات خلات المغنيسيوم 10 ملم و 100 ميكروغرام/مل جيش صرب البوسنة، الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية) واحتضان المخلوط في 37 درجة مئوية ح 4.
    1. تنقية قصت جزء الحمض النووي وناقلات خطية الحمض النووي الحمض النووي جل استخراج طقم15.
  3. مزيج 100 نانوغرام من ناقلات خطية الحمض النووي مع 400 نانوغرام من الحمض النووي هضمها تجزئة في خليط رد فعل ربط 10 ميليلتر يحتوي على 1 × وحدات 5 T4 الحمض النووي والحمض النووي T4 ليجاسى رد فعل المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl و 10 مم مجكل2، ATP 1 مم، 10 مم DTT، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ليجاسى. احتضان الخليط رد فعل على 16 درجة مئوية ح 16.
  4. تحويل 5 ميليلتر من خليط ربط 100 ميليلتر من الخلايا المختصة DH5α وحدد المستعمرات على صفيحة أجار الأمبيسلّين رطل. التقاط المستعمرات 5-10 وتنمو كل مستعمرة في متوسط رطل 2 مل تحتوي على 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسلّين في 220 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز ح 16.
  5. استخراج الحمض النووي بلازميد مع مجموعة17 مينيبريب الحمض النووي وتأكيد المستنسخين بتسلسل الحمض النووي مع تمهيدي أجتاتتتاكتجتتتكجتاكاج.
  6. [بكر] تضخيم التمويل (أ) 3 كيناز مستقبلات حبوب اللقاح (PRK3) الجينات بلغة ترميز بقايا 20-237 من بنية جينات PRK3 اصطناعية (الأمام التمهيدي: "كاتج جكجككجك كتاكاااكجتاجتجاتكجاكك"، عكس التمهيدي: "كجك جاتكك كبار المستشارين التقنيين دايمنشن دايمنشن ATG دايمنشن دايمنشن دايمنشن" تجاجتتكتكاتكجكاتكتاتاتك). تضخيم الحمض النووي لدورات 30 في المخزن مؤقت رد فعل بوليميريز الحمض النووي تحتوي على مزيج دنتب 0.5 مم، 0.2 ميكرون الإشعال، 0.1 ميكروغرام من قالب الحمض النووي، 0.4 مم مجكل2و 1 وحدة رد الفعل بوليميريز الحمض النووي.
    1. خطوات دورة بكر، تعيين تمسخ الأولى عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ومن ثم 30 دورات تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، الصلب في 55 درجة مئوية 30 ثانية، والتمديد في 72 درجة مئوية لمدة 30 s ضمن كل دورة، وهذا التمديد هو الأخير في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. هضم جزء بكر وناقل معدلة مع إنزيمات التقييد endonuclease NotI وبامهي. سد جزء الجينات مع ناقل خطية. مزيج 100 نانوغرام من ناقلات خطية الحمض النووي مع 400 نانوغرام من الحمض النووي هضمها تجزئة في خليط رد فعل ربط 10 ميليلتر يحتوي على الحمض النووي T4 ليجاسى رد فعل المخزن المؤقت و 5 وحدات من ليجاسى T4 الحمض النووي. احتضان الخليط رد فعل على 16 درجة مئوية ح 16.
  8. تحويل 5 ميليلتر من خليط ربط 100 ميليلتر من DH5α الخلايا المختصة بعد بروتوكول تحويل قياسي وحدد المستعمرات الناتجة على لوحة أجار الأمبيسلّين رطل16. تأكيد النسخ الصحيحة بتسلسل الحمض النووي.

3-إنتاج والتضخيم من باكولوفيروس بنيات إيواء كاسيت التعبير البروتين المؤتلف

  1. استخدام 100 نانوغرام من بلازميد بناء على تحويل 40 ميليلتر من DH10Bac الخلايا المختصة بعد بروتوكول نظام التعبير باكولوفيروس1. احتضان لوحات التحويل في 37 درجة مئوية ح 48.
  2. التقاط مستعمرات بيضاء اثنين من كل لوحة التحويل، وتطعيم كل مستعمرة في 2 مل من رطل المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين و 7 ميكروغرام/مل الجنتاميسين و 10 ميكروغرام/مل التتراسيكلين. يتبع البروتوكول نظام التعبير باكولوفيروس1 لاستخراج والتحقق من باكميد الحمض النووي. الكوة كل الحمض النووي في أنبوبين مع 20 ميليلتر في كل منهما، وتخزين الأنابيب عند-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: تتطلب الخطوات التالية في عملية العقيم.
  3. تنمو من أحادي الطبقة خلايا Sf9 في المضادات الحيوية البنسلين والستربتوميسين وسائط الثقافة مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 100 ميكروغرام/مل (أو 100 I.U./mL) عند 27 درجة مئوية لالتقاء 80% في لوحة 6-جيدا. تقدير النسبة المئوية لالتقاء استناداً إلى النسبة المئوية لتغطي مساحة على اللوحة زراعة الأنسجة.
  4. إعداد الحلول التالية في أنبوبين العقيمة 1.5 مل أجهزة الطرد المركزي.
    1. أنبوب 1: لكل تعداء، تمييع 20 ميليلتر من باكميد الحمض النووي إلى 100 ميليلتر من الخلايا Sf9 أونسوبليمينتيد الثقافة المتوسطة دون المضادات الحيوية. مزيج تمييع بلطف بالتحريك الجانب من الأنبوب.
    2. أنبوب 2: لكل تعداء، تمييع ميليلتر 8 من الدهن تعداء الكاشف إلى 100 ميليلتر من الخلايا Sf9 أونسوبليمينتيد الثقافة المتوسطة دون المضادات الحيوية. مزيج تمييع جيدا قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً ل 6 x.
  5. الجمع بين الحلين ومزجها بلطف بيبيتينج ببطء صعودا وهبوطاً ل 3 x، واحتضان لهم لمدة 20-40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. أغسل كل بئر من أحادي الطبقة Sf9 الخلايا x 2 مع 3 مل من الخلايا Sf9 أونسوبليمينتيد الثقافة المتوسطة دون المضادات الحيوية. لكل تعداء، إضافة 0.8 مل من الخلايا Sf9 أونسوبليمينتيد الثقافة المتوسطة دون المضادات الحيوية لكل أنبوبة تحتوي على خليط الحمض الدهني. خلط محتويات الأنابيب برفق بيبيتينج ببطء صعودا وهبوطاً ل 3 x. نضح الوسائط يغسل من اللوحات وتراكب العينات مع خليط تعداء.
  7. بعد إضافة الخليط تعداء، احتضان لوحة transfected ح 5 عند 27 درجة مئوية. استبدال وسائط الإعلام تعداء بالكامل Sf9 خلية الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10% FBS و 100 ميكروغرام/مل (أو 100 I.U./mL) المضادات الحيوية البنسلين والستربتوميسين. احتضان لوحة transfected عند 27 درجة مئوية لمد 4.
  8. الحصاد وتضخيم باكولوفيروس المؤتلف.
    1. جمع المادة طافية لوحة المصابة في أنبوب مخروطي 15 مل عقيمة بعد 4 د للحضانة. تدور المادة طافية في 1010 x ز لمدة 5 دقائق لإزالة الأنقاض الخلية. تجاهل بيليه وصب المادة طافية على أنبوب نظيفة وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
      ملاحظة: هذا هو الفيروس P0. فإنه يمكن أن يكون الكوتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية لفترة أطول من الزمن.
    2. إلى تضخيم كل الفيروسات المؤتلف، تنمو من أحادي الطبقة خلايا Sf9 على طبق من 150 ملم إلى التقاء 80%. نضح الوسائط من اللوحة وإضافة 2 مل الفيروس P0 تمسكا الخلايا اللوحة واحتضان لوحة ح 1 في حاضنة 27 درجة مئوية. روك لوحة كل 15 دقيقة لخلط المتوسطة مع الخلايا.
      1. إضافة 25 مل كاملة نعمة الوسائط التي تحتوي على 10% FBS و 100 ميكروغرام/مل (أو 100 I.U./mL) المضادات الحيوية البنسلين والستربتوميسين. احتضان لوحة د 3 في حاضنة 27 درجة مئوية الحصول على الفيروسات مرور P1.
    3. جمع المادة طافية لوحة المصابة في أنبوب مخروطي 50 مل العقيمة وتدور في 1010 x ز لمدة 5 دقائق لإزالة الأنقاض الخلية. صب المادة طافية على أنبوب نظيفة وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
      ملاحظة: هذا الفيروس P1 يمكن أن الكوتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية لفترة أطول من الزمن.
    4. لتضخيم الفيروس من P1 إلى P2 المرور، تنمو من أحادي الطبقة خلايا Sf9 على طبق من 150 ملم إلى التقاء 90% ونضح وسائط الإعلام اللوحة وإضافة 2 مل الفيروس P1 اللوحة واحتضانها من أجل ح 1 في حاضنة 27 درجة مئوية.
    5. كرر الخطوتين 3.8.2 و 3.8.3 للحصول على الممرات P2 و P3 من الفيروسات. لا تقم بتخزين الفيروس P3 لأكثر من شهرين.

4-البروتين التعبير، تنقية مع نينتا، وتبلور

  1. الثقافة 1 لتر خلايا Hi5 الحشرات في المضادات الحيوية البنسلين والستربتوميسين وسائط الثقافة مع 100 ميكروغرام/مل (أو 100 I.U./mL) إلى كثافة 2 × 106 100 لفة في الدقيقة في شاكر حاضنة 27 درجة مئوية. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 570 x ز لمدة 5 دقائق وصب المادة طافية، ريسوسبيند الخلايا في 20 مل الفيروس P3 الطازجة المنتجة، ويبقيه في درجة حرارة الغرفة حاء – 1 بلطف يهز الزجاجة تدور ريسوسبيند الخلايا 1 × كل 15 دقيقة.
  2. نقل الخلايا إلى 1 لتر من المضادات الحيوية البنسلين والستربتوميسين وسائط الثقافة مع 100 ميكروغرام/مل (أو 100 I.U./mL) وثقافة الخلايا 100 لفة في الدقيقة في 27 درجة مئوية حاضنة شاكر ل h. 72 تدور أسفل الخلايا في س 1,010 ز لمدة 5 دقائق وجمع المادة طافية.
  3. مؤشر الرقم الهيدروجيني استخدام شرائط لضبط الأس الهيدروجيني من المادة طافية إلى 8.0 بإضافة 0.1 M HCl أو 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم وإضافة المخزن المؤقت ملزم بتركيز نهائي، الذي يحتوي على 20 مم تريس المخزن المؤقت على درجة الحموضة 8.0، 100 ملم كلوريد الصوديوم، وايميدازول 5 مم. إضافة مقدار معين من الراتنج نينتا (10-40 مل) استناداً إلى العائد المقدر من البروتين المؤتلف أعرب صاحب معلم.
    1. مزيج الحل على ضجة مغناطيسية بسرعة منخفضة عند 4 درجة مئوية حاء 1 يغسل الراتنج والوت البروتين ملزمة بعد تنقية نينتا القياسية البروتوكول18.
  4. موضوع البروتين المنقي للتبادل الأيوني وهلام الترشيح اللوني، فضلا عن طرق تنقية البروتين الأخرى، أن تسفر عن عينة متجانسة.
    ملاحظة: لتقرير التجارة والتنمية اكتودومين، 20 مم تريس، استخدمت درجة الحموضة 8، 100 ملم كلوريد الصوديوم كهلام الترشيح المخزن المؤقت. اكتودومين PRK3، مم 20 مكررا-تريس، استخدمت الرقم الهيدروجيني 6، 100 ملم كلوريد الصوديوم كالمخزن المؤقت الترشيح جل المفضل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما هو مبين في الشكل 1، كانت تستخدم موجهات التعبير باكولوفيروس pFastBac1 معدلة اثنين للتعبير عن البروتينات يفرزها مع GP67 أو تسلسل إشارة هيمولين لتحل محل الإشارات المضمنة تسلسل الجين المستهدف. ثبت GP67 الفيروسية والجينات هيمولين الحشرات إلى إفراز ارتفاع مستويات التعبير في الخلايا. من المتوقع أن تحسنت إلى حد كبير مستويات التعبير إفراز البروتينات الانصهار مع أي من هذه الإشارات تسلسلين. مواقع متعددة الاستنساخ (MCS) تم إجراء هندسة عكسية لها هذه متجهات معدلة اثنين متطابقة. موقع نوتي وضعت عمدا على الأكثر 5 '--جانب الإشراف، سبب نوتي تسلسل النوكليوتيدات ثمانية بدلاً من تسلسل النوكليوتيدات الستة الأكثر شيوعاً موجودة في العديد من المواقع الأخرى في تقييد. على هذا النحو، موقع نوتي أقل موجودة في الجينات الهدف من معظم المواقع قيود أخرى، مما يجعل الهضم التقييد واستنساخ معظم الجينات المستهدفة أكثر جدوى بالمقارنة باستخدام مواقع أخرى قيد. استنساخ الجينات المستهدفة بين نوتي وموقع تقييد المصب سيعرض ثلاثة فقط من الأحماض الأمينية المخلفات، جر، السابقة للجين المستهدف.

PBac1-GP67 و pBac1-هيم قد استخدمت بنجاح للتعبير عن المجالات خارج الخلية من مستقبلات التمويل (أ) تقرير التجارة والتنمية، و PRK3، على التوالي (الشكل 2). بعد أن تم تنقية البروتينات المؤتلف من نينتا استخدام علامة 6-الحامض الأميني الطرفي ج هندسة، يتسق البروتين متوسط العائد حوالي 20 مغ/لتر خلايا Hi5. نقاء كل البروتين قريبة أو أعلى من 50%، بحثت مع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وأخذ تلطيخ.

كذلك كانت تنقية البروتينات المؤتلف من المجالات خارج الخلية لتقرير التجارة والتنمية، و PRK3 بحجم الاستبعاد اللوني (الشكل 2). كانت مركزة على 5 ملغ/مل البروتين المنقي وثم تعرض لغربلة تبلور. كانت الأمثل الظروف التي أسفرت عن بلورات أولية لكل البروتين، حتى شوهدت البلورات البروتينية ذات حجم أكبر من 20 ميكرومتر (الشكل 3). وكانت هياكل الكريستال كل البروتينات عنها11،12.

Figure 1
رقم 1: خرائط متجهات معدلة pFastBac1- تم إدراجها في تسلسل الحمض النووي أظهرت في هذه اللوحات الأمامية من المروج بوليهيدرين ناقل pFastBac1، تملك تسلسل الببتيد إشارة ومواقع متعددة الاستنساخ (MCS) للجينات المستهدفة. تحتوي كلا ناقلات MCS نفسه. (أ) هذا الفريق يظهر تسلسل مواقع الاستنساخ المصب المروج بوليهيدرين في ناقلات pBac1-GP67. يتم تلوين المترجمة تسلسل الأحماض الأمينية ببتيد GP67 إشارة باللون الأحمر. كل موقع قيود فريدة من نوعها في الإشراف مسطراً، مع اسم الموقع المسمى أعلاه. (ب) هذا الفريق يبين تسلسل مواقع الاستنساخ المصب المروج بوليهيدرين في ناقلات هيم pBac1. يتم تلوين تسلسل الأحماض الأمينية ببتيد إشارة هيمولين المترجمة باللون الأحمر. كل موقع قيود فريدة من نوعها في الإشراف مسطراً، مع اسم الموقع المسمى أعلاه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تعبير البروتين مع ناقلات pFastBac1 تم التعديل في نظام الخلية الحشرات باكولوفيروس. (أ) اكتودومين لتقرير التجارة والتنمية كان المعرب عنها في الخلايا Hi5 الحشرات، وتنقيته من النيكل-تقارب وحجم الاستبعاد اللوني (S)، وحلها على جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. تم غسلها الراتنج النيكل مرة واحدة مع عازلة التي تحتوي على 5 مم ايميدازول (الغسيل 1)، ومرة ثانية مع 20 مم ايميدازول (الغسيل 2). (ب) هذا تحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عرض التعبير والنيكل انجذاب تطهير (نينتا)، فضلا عن حجم الاستبعاد اللوني من اكتودومين PRK3. تتم تسمية علامات الوزن الجزيئي (ميغاواط) مع الأحجام المطابق. الأسهم الحمراء في كل لوحة الدلالة التعبيرات والأحجام المتوقعة من المؤتلف تقرير التجارة والتنمية والبروتينات اكتودومين PRK3. ومن المرجح طبائع الفرقة متعددة من البروتينات المعرب عنها بسبب جليكوسيليشن غير متجانسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: البلورات البروتينية من خارج الخلية مجالات التمويل أعطيت تقرير التجارة والتنمية، و PRK3- (أ) هذا الفريق يظهر بلورات البروتين من المجالات خارج الخلية التمويل (أ) تقرير التجارة والتنمية. (ب) هذا الفريق يظهر بلورات البروتين من مجالات التمويل ألف PRK3 خارج الخلية. شريط مقياس يظهر أسفل كل صورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ونظرا للتنوع في الحجم واستقرار الآلاف من البروتينات الموجودة في النظم البيولوجية، من التجريبية لبحوث المختبرية تقرر أي نظام التعبير مغايرة قد يتم اختياره للتعبير عن البروتين محددة. نظام التعبير كولاي هو غالباً الخيار الأول لتعبير البروتين نظراً لدورة حياة قصيرة للبكتيريا، منخفضة التكلفة للثقافة الإعلامية، والسهولة النسبية الارتقاء إلى19. للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة الكبيرة مع أحجام أكثر من كاتشين 60، مع ذلك، باستخدام كولاي كثيرا ما يؤدي نظام البروتينات غير قابلة للذوبان في الجسم إدراج أو تجميع20. للتعبير عن تلك البروتينات الصعبة، ولغيرها من البروتينات يفرزها، قد يكون أكثر فائدة من ه القولونيةالنظام التعبير خلية باكولوفيروس الحشرات. لا سيما عند التعبير عن البروتينات حقيقية النواة يفرزها، يمكن أن يكون هذا النظام تعديل الحشرات باكولوفيروس خلية التعبير خيار مفضل.

تحتاج العديد من البروتينات حقيقية النواة يفرزها، بما في ذلك مصنع يفرز البروتينات، glycosylation المعقدة وتشكيل ثنائي كبريتيد وغيرها من التعديلات بوستترانسلاشونال أثناء قابلة للطي وإفراز بروتين21. لم يكن لديك كولاي النظم الآلية الخلوية عملية التعديلات المعقدة اللازمة للعديد من البروتينات التوكسينات22. الخميرة بنظام glycosylation نسبيا أكثر تقدما من كولاي23. بيد أن للتعبير عن البروتينات يفرزها في أعلى الأنواع التوكسينات والنباتات، يمثل نظام الخلية الحشرات باكولوفيروس ميزة كبيرة. منذ glycosylation يؤثر على طي البروتين، وأعرب عن الاستقرار24، العديد من البروتينات يفرزها المؤتلف في نظم كولاي والخميرة منخفضة غلة وتميل إلى تجميع، يفترض أن سبب طي البروتين غير صحيحة. تم تعديل نظام حشرة باكولوفيروس لتحسين glycosylation البروتين، مما يجعله نظام مثالي للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة يفرزها25. في هذه الدراسة، إشارة GP67 وهيمولين الببتيدات قد استخدمت بنجاح لتوجيه التعبير إفراز البروتينات مستقبلات مصنع اثنين لبلورة البروتينات. مع هذه الدراسات في الاعتبار على الرغم من اختيار أما الببتيد إشارة خطوة حاسمة، وأنه يحتاج إلى دراسات مقارنة أكثر انتظاما مع مجموعة من الجينات المستهدفة من الكائنات المختلفة.

كان يقودها فكرة استخدام الببتيدات إشارة GP67 وهيمولين لتعزيز التعبير إفراز البروتين غلة التعبير عالية من كلا الجينات. ومع ذلك، إذا هي مثقلة إفراز البروتين وآلية تعديل بوستترانسلاشونال من المضيف التعبير مع البروتينات المؤتلف المعرب عنها، البروتينات المؤتلف يفرز قد لا يكون التعديلات كافية، لا سيما glycosylation. وقد استخدمت كلا متجهات معدلة للتعبير عن نجاح عديدة مصنع البروتينات الافرازية11،12،26، كثير منها تميل إلى مجتمعة، والذي على الأرجح بسبب جليكوسيليشن غير صحيحة أو غير كافية. ولذلك، للتعبير عن تلك البروتينات الصعبة، تسلسل الببتيد الإشارات القوية والضعيفة على حد سواء يجب أن يتم اختبارها ونوعية البروتينات المؤتلف أعرب يحتاج إلى مقارنة. نضع في اعتبارنا أن تسلسل ببتيد إشارة ضعيفة سوف يخفض العائد الكلي للبروتين؛ ومع ذلك، قد تعطي إليه إفراز المضيف التعبير سعة كافية لعملية إفراز البروتين والتعديلات.

بالإضافة إلى التعبير عن البروتينات يفرزها مغايرة في خلايا الحشرات، خلايا الثدييات ونظم التعبير الخلية النباتية قد استخدمت بنجاح في overexpression المؤتلف الثدييات والبروتينات النباتية، على التوالي27، ،من 2829. بالمقارنة مع أنظمة مغايرة، التعبير الذاتية القريب سيكون الشرط أما في الثدييات أو البروتينات النباتية يفرز الأجهزة التعديل الأصلي تقريبا في الخلايا المضيفة لإنتاج البروتينات المطوية جيدا. التحذير من استخدام نظام التعبير قرب أصلي-هو أن البروتينات المؤتلف المعرب عنها قد تتداخل مع الوظيفة الفسيولوجية للخلايا، مما قد يحتمل أن تكون لها آثار معاكسة على العائد التعبير النهائي من البروتينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل باستخدام أموال بدء التشغيل الجديد كلية من "جامعة ولاية كارولينا الشمالية" عن شو جوجو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator shaker VWR Model Excella E25 27 oC
Incubator VWR Model 2005 27 oC
Centrifuge BECKMAN Model J-6 with a swing bucket rotor
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent 600677-51 For PCR amplification of DNA
Thermal Cycler BIO-RAD Model C1000 Touch For PCR amplification of DNA
Incubator shaker New Brunswick Scientific Model I 24 For growing baceria culture
Customer DNA synthesis GENSCRIPT
BamHI (HF) New England Biolabs R3136S Restriction Endonuclease
BglII New England Biolabs R0144S Restriction Endonuclease
NotI (HF) New England Biolabs R3189S Restriction Endonuclease
XhoI New England Biolabs R0146S Restriction Endonuclease
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202T DNA ligation
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 Plasmid DNA purification from bacteria culture
Agarose Thermo Fisher Scientific 15510-019 For DNA gel electropherosis
MAX Efficiency DH5α competen cell Invitrogen 18-258-012 For transformation of DNA ligation mixture
Lennox L LB Broth Research Product International Corp. L24066-5000.0 For making bacteria culture
Ampicillin sodium salt Thermo Fisher Scientific 11593-019 Antibiotics
Kanamycin Sulfate Thermo Fisher Scientific 15160-054 Antibiotics
Tetracycline Thermo Fisher Scientific 64-75-5 Antibiotics
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15710-064 Antibiotics
MAX Efficiency DH10Bac competent cells Thermo Fisher Scientific 10361-012 For making bacmid DNA
S.O.C. Medium Thermo Fisher Scientific 15544-034 For DNA transformation
CellFECTIN II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362-101 Insect cell transfection reagent
Bac-to-Bac Expression System Thermo Fisher Scientific 10359-016 Baculovirus-insect cells expression kit
Bluo-gal Thermo Fisher Scientific 15519-028 For isolation of recominant Bacmid DNA
IPTG Thermo Fisher Scientific 15529-019 For isolation of recominant Bacmid DNA
pFastBac1 Thermo Fisher Scientific 10360014 Baculorirus expression vector
Sf9 cells Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 monolayer cells
Hi5 cells Thermo Fisher Scientific B85502 High Five insect cells
Grace’s insect medium, unsupplemented Thermo Fisher Scientific 11595030 Sf9 cell transfection minimum medium
Grace’s insect medium, supplemented Thermo Fisher Scientific 11605102 Sf9 monolayer cell culture complete medium
Sf-900 II SFM Thermo Fisher Scientific 10902104 Sf9 suspension cell culture medium without FBS
Express Five SFM Thermo Fisher Scientific 10486025 Hi5 cell culture medium
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 ml (10,000 I.U./ml)
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081 100 ml
FBS Certified Thermo Fisher Scientific 16000-044 500 ml
6-well plates Thermo Fisher Scientific 08-772-1B Flat-bottom
150 mm plates Thermo Fisher Scientific 353025 100/case
1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1415-2500 500 tubes/bag
15 ml conical screw cap centrifuge tubes USA Scientific 1475-0511 25 tubes/bag
50 ml conical screw cap centrifuge tubes USA Scientific 1500-1211 25 tubes/bag
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430 NiNTA resin
pH-indicator strips EMD Millipore Corporation 1.09535.0001 pH 0 - 14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
  2. Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
  3. Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
  4. Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
  5. Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
  6. Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology - Animal. 29A, 388-390 (1993).
  7. Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
  8. Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
  9. Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
  10. Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
  11. Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317 (2017).
  12. Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796 (2018).
  13. Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
  14. Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
  15. Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
  16. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
  18. Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
  19. Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
  20. Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
  21. Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
  22. Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
  23. Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
  24. Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
  25. Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
  26. Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
  27. Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
  28. Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
  29. Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).

Tags

الكيمياء الحيوية، 138 قضية، خلية الحشرات، باكولوفيروس، وناقلات التعبير، بروتين افرازي، إشارة الببتيد، GP67، hemolin، باكميد، تعداء، خلية ثقافة، جليكوسيليشن، وتعبير البروتين، وتبلور البروتين
تعديل ناقلات التعبير باكولوفيروس لإنتاج يفرز البروتينات النباتية في خلايا الحشرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chakraborty, S., Trihemasava, K.,… More

Chakraborty, S., Trihemasava, K., Xu, G. Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells. J. Vis. Exp. (138), e58283, doi:10.3791/58283 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter