Summary
Здесь мы представляем протокол для улучшения парафин секционирование. Этот метод сочетает в себе резки и плавающие, используя простую термостатический камеру чтобы избежать процесса передачи требуется обычным методом. В результате эффективность и количество нетронутыми парафиновых срезах были значительно улучшены.
Abstract
Секционирование парафин врезанных тканей широко используется в гистологии и патологии. Однако это утомительно. Чтобы улучшить этот метод, несколько коммерческих компаний разработали сложные Секции систем перевода с помощью жидкости воды. Для упрощения этой технологии, мы создали простой метод, с помощью домашнего оборудования, которое сочетает в себе резки и плавающей внутри простой термостатический камеры; Таким образом разделы автоматически ввести ванну водой на поверхности воды. Гиппокамп от взрослых мыши мозги, Взрослый мыши почки, мозги эмбриона мыши и взрослых рыбок данио глаза были сокращены с помощью обычных парафин секционирование и представленный метод для сравнения. Статистический анализ показывает, что наш усовершенствованный метод сэкономить время и выше качество секций. Кроме того парафин секционирование всего образца в короткое время легко для младших операторов.
Introduction
Морфологическое исследование имеет важное значение в биологических исследованиях. Хотя новая технология позволила исследователи соблюдать их целей непосредственно из цельной ткани или организмов1,2,3, резка образца в шлифов, следуют окрашивание, остается основным метод fornot только ткани морфологии, но и белка, ориентации непосредственно в ткани. Световой микроскопии использует три типа раздела: парафин, замороженные и полутонкая. Хотя cryosectioning является общим для защиты ткани антигенностью, и подготовка образца простой, морфология сохранить ткани бедных и непригодна для тонкого резания4,5. Секционирование парафин является наиболее часто используемый метод для экспонирования хорошо сохранившиеся морфологии. Как образцы полностью обезвоженной и встроенных в воск, парафиновые блоки могут храниться бессрочно. Кроме того парафин секущей производит шлифов, которые улучшают доступ к биологическим зонд в дальнейших экспериментов и уменьшить наложения слоя клеток в направлении Z.
Однако обычные парафин секционирование является утомительным и требует навыков оператора. Парафиновых срезах проходят фиксацию, обезвоживание, встраивание, резка и плавающей. Важно отметить, что передача разделе ленты из держателя ножа в водяной бане является необходимым, но трудно для младших операторов. Особенно в сухом воздухе раздел ленты будет твист из-за статического электричества и трудно разворачиваться на поверхности теплой воды. Для улучшения раздела качество, смачивая поверхность подвергается ткани между микротом лезвия проходит, охлаждения блоки воск, погружая их в ледяной воде, или повышение влажности с увлажнитель вблизи микротома рекомендуются6,7 . Новые методы для улучшения парафин секционирование включают внедрение гибридных парафин, cryosectioning8и помощи системы передачи коммерческий отдел9. Хотя эти методы частично улучшить парафин секционирование скорость и качество, они делают секционирование гораздо более громоздкими, и коммерческий отдел передачи системы являются дорогостоящими.
В этом протоколе мы показали, как создать простой, дешевой и гибкой оборудование шаг за шагом, который может быть подключен к держателю лезвия микротом роторный. Это оборудование состоит из секции канала, на водяной бане и подогреватель с переключателем обнаружения температуры. После резки, десятки разделов впадают в разделе канал и введите ванну водой непосредственно, таким образом разворачивается автоматически. Это повышает эффективность парафина секционирование и делает эту технологию более удобным. Используя этот метод, более взрослой мыши гиппокампа секции, секции почек взрослых мыши, эмбриональных 15.5 дневных (E15.5) мыши мозга секции и взрослых рыбок данио глаз разделы были собраны в меньше времени и более сохранился морфологически. Этот метод может также использоваться для других образцов тканей, которые требуют ускоренного парафин секционирование избегая потери раздела различия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование комитета университета Наньчан.
1. Монтаж оборудования и подключение микротома
- Дизайн параметр согласно требованиям (Дополнительные рис. 1).
- Представляет параметр для местной фабрике для производства акриловой доски.
- Собрать все части в последовательности: используйте хлороформ объединить 7 коммерческих Акриловые плиты в бак с раздел канала и водой ванну (рис. 1).
Предупреждение: Хлороформ производит токсичных веществ, когда он встречает света и кислорода. Соберите аппарат в зонта. - Установка трубчатых электронагревательных элементов через отверстие в акриловые Совет #1 (рисунок 2A, стрелки).
- Чтобы установить контроллер температуры, создать небольшое отверстие на #2 акриловые доске с помощью электродрели и установить датчик температуры (рисунок 2A, стрелка). Установка цифровой термостат на танк (рис. 2A).
Примечание: Датчик температуры должна быть в пределах 1 см ниже поверхности воды. - Чтобы обеспечить доступ к власти, отрегулируйте напряжения ниже 24 V до поворота на оборудовании.
- Удалите из микротома сборник обрезков.
- Свяжите канал разделы с держателя лезвий микротома с нейтральный силиконовый герметик (рис. 2B).
Примечание: Не мазок любой нейтральный силиконовый герметик выше верхней части лезвия так, чтобы старые лезвие легко заменяется. - Сухая на ночь, чтобы позволить хлороформе и нейтральный силиконовый герметик время закрепить.
- Установите лезвие в держатель лезвий. Налейте воду в водяной бане (рис. 2 c). Поверхность воды необходимо просто коснуться верхней части лезвия (голова стрелка2D фигура, ).
2. парафин секционирование
Примечание: Мусора часто накапливаются на верхнего или нижнего края блока воска и поверхности воды. Этот мусор должен регулярно очищаться.
-
Выполните секционирование10обычных парафина.
- Зажим парафин врезанных образца на микротом роторный и поместите лезвие в держатель лезвий.
- Поверните маховик и раздел образца.
- Передача парафин секционного ленты в ванну теплой водой 38,5 ° С.
- Подберите секции на Микроскоп скользить от поверхности воды после разворачивается.
- Сухие слайды в духовке при 42 ° C на ночь.
-
Улучшенная парафин секционирование (рис. 3)
- Включите оборудование.
- Откройте нагреватель с обнаружения переключатель температуры и задайте целевой температуры между 38,0 ° C до 40.0 ° C для 1 h заранее для теплой воды.
- Изменение блока парафин, приобретенного путем встраивания парафин; затем поместите блок парафина на микротом кассетный зажим и зафиксируйте его.
Примечание: Верхние и нижние границы парафин блока должна быть изменена горизонтально для предотвращения разделе ленты от формирования дуги и становится не в состоянии потока через узких каналов. - Быстро подход образец путем резки толще секций.
- Приспособиться к толщине подходящего раздела (10 мкм для взрослых мыши мозги, почки взрослого мыши и мозги эмбриона мыши, 4 мкм для глаз данио рерио). Поверните маховик и разделы автоматически войдет в разделах канала и ванны.
- Раздел образца в медленный и единообразных резки инсульта (рис. 3A).
Примечание: Thethickness первой секции будут изменены после маховичок был остановлен на несколько минут. Одноразовые лезвия должны быть заменены, если секции имеют подряд царапин. - Руководство разделы в зале ванна плавать в линии (рис. 3B, 3 C).
Примечание: Если раздел head придерживается к стенке камеры, используйте кисть руководство держать его плавающим. - Придерживаться секции на скольжениях микроскопа. После разделов полностью разворачиваться на водяной бане, несколько секций с помощью пинцета. Затем забираете их из водяной бани на скольжениях микроскопа (рис. 3D).
Примечание: Секции должна быть подобрана из задней водяной бане, как те в разделах канала и передней водяной ванны не еще будет полностью развернута. - Сухие слайды, помещая их в 42 ° C печь на ночь. Слайды можно затем храниться при комнатной температуре на неопределенный срок.
- Используйте гематоксилином-эозином (он) пятная ради оценки усовершенствованный метод8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Улучшенный метод увеличилось количество нетронутыми парафиновых срезах. Мы протестировали этот новый метод на взрослых мыши гиппокампа ткани, взрослых мыши почки, мозги эмбриона мыши и данио рерио глаза. Вода была добавлена в бак, и температура воды поддерживался между 38,0 ° C до 40.0 ° C. После серийно подготовки образцов тканей, они были секционного и по сравнению с обычными секционирование. Новый метод избегать потери секции и увеличению доли нетронутыми секций в взрослых мыши гиппокампа, взрослые мыши почки, мозг мыши E15.5 и взрослых рыбок данио глаза (рис. 4A4 C, 4E, 4 G). В заключение наш метод улучшения, секционирование путем предотвращения потери секции и уборки больше нетронутыми секции за образец.
Улучшенный метод сократилось время, проведенное за образец. Сравнивая время между традиционным методом и наш усовершенствованный метод, мы провели всего серии секционирование (от первой секции в секцию последнего органа) на взрослых мыши гиппокампа, взрослые мыши почки, мозги E15.5 мышь и взрослого Данио рерио глаза. Результаты показывают, что усовершенствованный метод ускоренного парафин, секционирование скорость всех испытанных образцов (Рисунок 4B4 D, 4F, 4 Ч). В общем наш метод позволил для разрезания быстрее высокого качества парафина.
Серии разделы данио рерио оптические сетчатки наблюдалось H и E пятнать. Для серии секционирование сегмента оптический диск данио рерио сетчатки, разделы, собирают из метода улучшения были лучше имеет лучшую целостность чем те от обычных парафин, секционирование метод (рис. 5А, 5Б). Существует никакого существенного различия между этими двумя методами относительно качества наиболее заготовленной секции (рис. 5 c, 5 D). Иногда, качество секций, собранного из обычного метода были относительно низкими (Рисунок 5E, 5F).
Рисунок 1: процесс сборки 7 коммерческих Акриловые плиты в цистерну. (A) общий вид 7 Акриловые плиты. (B-G) Ступенчатые Ассамблея бака от Совета # 1 Совет #7. (H) основной танк после сборки. (I) Общие танк размер; защитные мембраны на поверхности бака был удален для дальнейшей установки. L = 400 мм, L' = 220 мм, H = 122 мм, W = 200 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: надлежащим образом смонтированного оборудования, готов к использованию. (A) нетронутыми оборудование после подключения к микротом роторный. Стрелка индикации, датчик температуры устанавливается через небольшое отверстие электродрель. Голова стрелка, подогреватель (электрические) устанавливается через отверстие в борту #1. (B) усиленные пунктирной области в, особенность связь между держателя лезвий микротома и разделы канала. Голова стрелка, держатель лезвия и канал секции соединены нейтральный силиконовый герметик. (C) так же, как B, с водой заливается и установки лезвия. (D) сбоку области Пунктирная стрелка C. голову, поверхности воды близка к краю лезвия. VT: трансформатор напряжения; ВБ: водяная баня; DT: цифровой термостат; B: лезвие; BH: держатель лезвия; SC: разделы канал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: улучшение парафин, секционирование процесса. Цифры, расположенные в левом нижнем углу являются соответственно усиливается пунктирные районы в A-D. Стрелка индикации, первый раздел. (, A') Раздел входит в разделах канал сразу и непосредственно после резки. (B, B') Разделы лентой пересекает границу между разделы канала и воды ванны. (C, C') В разделах всплывают кзади водяной ванны и полностью развернута. (D, D') Разделы подбираются микроскопа, когда они достигают задней водяной ванны и полностью развернута. SC: разделы канал; ВБ, водяной бане. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: метод улучшения секущей улучшить уровень эффективности и доходности значительно для всей серии секций. Доходность составила доля нетронутыми разделов во всех разделах отрезока. Данные отображаются как среднее ± SEM и приобретенные одним оператором. (A, C, E, G) Улучшенный метод предотвратить потери раздел взрослых мыши гиппокампа (91.04 ± 1.429% N = 3, против 97.63 ± 0.4864% N = 3, p = 0.0120), взрослые мыши почек (92.30 ± 0.5689% N = 3, против 95.99 ± 0.7055% N = 3, p = 0.0153), E15.5 мыши мозга (90.67 ± 1.549%, N = 3 против 97.01 ± 0.2816%, N = 3, p = 0.0158) и глаза взрослых рыбок данио (91.27 ± 0.9734% N = 4 против 96.32 ± 0.7217% N = 4, p = 0.0059). (B, D, F, H) Улучшенный метод сохранения времени по сравнению с традиционным методом для взрослых мыши гиппокампа (126.0 3.606 мин против 79.67 ± 1.856 мин, N = 3, p = 0.0003), взрослые мыши почек (66.67 1,764 мин против 41,33 ± 2,186 мин, N = 3, p = 0,0008 г), E15.5 мыши br Аин (99.67 3.480 мин против 52.33 ± 4.333 мин, N = 3, p = 0,0010) и глаза взрослых рыбок данио (48.00 2.160 мин против 30,75 ± 1.797 мин, N = 4, p = 0,0009). * P < 0,05, ** P < 0.01, *** P < 0,005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: H и E окрашивание всей серии разделов сегмента оптический диск данио рерио глаза приобрели от обычных методов и улучшение парафин секционирование, тот же оператор сравнения. (A) обычных парафин секционирование (21 статьи). (B) повышение парафин резания (24 статьи). (C) пунктирной области A6. (D) пунктирной области B7. (E) пунктирной области A17. (F) пунктирной области В19. Звездочки, разделы с относительно низкого качества. Стрел, диск зрительного нерва; Стрелки, серьезный разрыв сетчатки тканей. Шкалы бар = 200 мкм (A и B); Шкалы бар = 50 мкм (C, D, E, F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный рисунок 1: измерение параметров 7 коммерческих Акриловые плиты. Число представляет длину края соответствующего Совета. Единицы: мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для улучшения парафин раздела морфология и решить проблему потери времени при резании обычных парафин, мы создали более парафин, секционирование метод, который сочетает в себе резки и разворачивается. Этот улучшенный метод основывается на простой оборудования, которое включает раздел канала, на водяной бане и подогреватель с переключателем обнаружения температуры. На ленте в разделе входит водяной бане через канал раздела и автоматически разворачивается во время резки. Таким образом этот метод улучшает парафин, секционирование качества и эффективности, которая была подтверждена парафин секционирование взрослых мыши гиппокампа, взрослые мыши почек, E15.5 мозг мыши и взрослых рыбок данио глаза.
Чтобы избежать секции, керлинг во время обычных парафин секционирование, многие коррективы были внесены, таких как увлажнять поверхность ткани, охлаждения блока воска, повышение влажности и объединения cryosectioning6,7, 8; Однако эти изменения делают парафин секционирование более утомительным. Коммерческий отдел передачи системы, которая опирается на жидкости вода была более успешной. В этой системе раздел контакты поверхности воды сразу после резки, и поток воды с электрическим приводом передает разделы из держателя лезвия нижняя ванна теплой воды9. Из-за ее механизм статическое электричество не тормозят, секционирование, что приводит к улучшению раздела качество. Кроме того как эта система позволяет избежать вручную передачи Секции из держателя лезвий на водяной бане, легко повредить хрупкие секции, она также помогает в приобретении высококачественных тоньше секций.
С нашей усовершенствованный метод простой оборудования опирается на опыт системы передачи коммерческий отдел с некоторыми преимуществами. Во-первых оборудование дешевле, который мог бы популяризировать этот метод в лабораториях в развивающихся регионах и могут дополнить систему передачи коммерческий отдел. Во-вторых вода в оборудование является статическим и никогда не мешает секции, что позволяет получить тоньше секций. Мы последовательно секционного данио рерио глаза толщиной 2 мкм, с помощью метода улучшение, и приобретенных разделы были более высокого качества. В-третьих больше баня резервуар используется в оборудовании, которое позволяет по крайней мере 40 секций разворачиваться и плавать одновременно, позволяя два оператора сотрудничать. Один человек может разрезать образец ткани непрерывно и другие могут непосредственно Выудите разделы. Это уменьшает время ожидания для секций разворачиваться. Последовательных резки с единой резки инсульта также улучшает качество секции.
Структура и внешний вид нашей простой оборудования требует улучшения. Например компоненты, такие как сила, обогреватель и регулятор температуры, может быть интегрирована сделать это оборудование более неотъемлемой и портативный. Кроме того коммерческие роторный Микротомы имеют разные размеры. Чтобы подключиться к другим Микротомы, угол и высота этого оборудования должна быть скорректирована. Парафин секционирование, в сочетании с другими молекулярных методов широко используется в нейробиологии, морфологии тканей и другие исследования поля11,12,13. Возможно этот метод может улучшить клинические проверки эффективности14,15 и других биологических образцов за пределами трех ткани типы, используемые здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют патент на это устройство и объявить не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (Грант № 31400936, 31460260) и естественные науки фонд Цзянси провинции из Китая (20171BAB215020). Мы также благодарим совместной программы университета Наньчан и королевы Марии Лондонского университета за поддержку этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
- Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
- Sabaliauskas, N. A., et al.
- Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
- Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).
