Summary
在这里, 我们描述了一个生产收集针的协议, 可用于收集全厚度的皮肤组织, 而不会造成捐赠部位疤痕。针头可以与一个简单的收集系统结合, 以实现大容量收割。
Abstract
本手稿描述了由现成组件制成的实验室设备的生产过程, 可用于收集水样的全厚度皮肤组织。小尺寸的水样允许供体部位快速愈合, 而不会造成供体部位瘢痕, 而采集全厚度组织则可将皮肤组织的所有细胞和细胞外成分包括在内。有更深的真皮区域和附件皮肤结构, 尚未成功再现使用传统的组织工程技术。水样可直接应用于皮肤伤口, 以增加愈合, 也可用作其他组织工程方法的自体细胞/组织来源。收集针是通过修改标准皮下注射针, 它们可以单独用于收割少量的组织或与一个简单的吸基于收集系统 (也由通常可用的实验室用品)大容量收割, 以促进大型动物模型的研究。
Introduction
自体皮肤移植是创面修复的主要支柱, 但由于供血部位缺乏和发病率的限制, 导致近几十年来共同努力开发替代传统皮肤移植的新治疗方案1,2.我们最近开发了一种替代方法来收获皮肤, 利用全厚度的皮肤移植的好处, 同时尽量减少捐献者的部位发病率。通过收集全厚度的皮肤以小 (约0.5 毫米直径) "水样", 捐助者的网站能够在正常情况下快速愈合和没有疤痕 (对于潜在的例外, 请参阅下面的讨论部分)3。水样可直接应用于伤口床上, 以加速伤口闭合, 减少收缩3, 恢复各种表皮和真皮细胞类型和功能性附件结构4, 其中许多缺乏传统的剥离厚度皮肤移植或当前生物工程皮肤替代5。水样的能力, 以增加愈合和他们的捐助者的网站愈合没有疤痕都已独立验证的其他研究组6,7。
我们以前开发了一个实验室收割系统, 以使收集的水样在规模8;但是, 该系统由许多未广泛使用的自定义组件组成。在这里, 我们详细描述了生产收获针的过程, 以及简单的收集系统, 由大多数现成的组件制成, 可用于实现大容量收割。本手稿中描述的仪器适合于体外和动物工作, 但不适用于人类。在人类中应用这种技术的临床设备具有 FDA 许可, 但在这里将不会详细讨论。
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Protocol
所有涉及活体动物和动物组织样本的工作均已获得马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。
1. 收获针的生产
- 生产阶段的设置
- 将一个母鲁尔锁连接器固定在柱子上, 然后将开机自检安装到旋转台上, 以便鲁尔锁位于舞台的中心 (图 1a)。
- 垂直放置第一个旋转阶段, 并垂直安装到第二个水平旋转阶段 (图 1B)。
- 将水平旋转阶段安装到两轴平移阶段 (图 1B)。
- 将组合固定在稳定的表面上, 如光学面包板。
- 将旋转工具单独安装到相同的面包板上, 工具与面包板平行放置, 与旋转/平移组合阶段的鲁尔锁连接器的高度大致相同 (图 1C)。
- 安装两个切割轮同心到旋转工具 (一个较小的, 较低的砂砾金刚石切割轮超过一个更大, 更高的砂砾石切割轮) (图 1D)。
注: 两个轮子的直径相差大约9毫米, 一般就足够了。 - 在旋转工具上放置一个可调节臂的架空光源, 其光瞄准切割轮。
- 为了增强可视化效果, 请将解剖显微镜放置在生产设置上, 以便目镜聚焦在切割盘上 (图 1C)。
注意: 或者, 用户可以佩戴放大镜。
- 重塑针头尖端
- 佩戴防护眼镜和手术面罩, 防止细金属颗粒进入眼睛或呼吸道。
- 根据实验要求, 选择合适规格尺寸的皮下注射针。
- 标记每个收割针的预期长度。
注: 对于从猪皮肤收割, 8 毫米针通常是足够的;虽然, 长度可能会根据实验需求 (例如, 靶皮肤组织的厚度, 针规格大小) 而有所不同。一般来说, 19 口径的针对猪皮肤很有效。 - 将针垂直地向下旋转工具与开机, 使用外切割盘的边缘切断针的多余长度, 在步骤1.2.3 中标记的点。
- 将缩短的钝针连接到生产台上的母鲁尔锁连接器。
- 调整水平旋转阶段, 使针在与旋转工具上的切割盘平行的12°角 (改变角度将影响针插入所需的力)。
- 打开头顶灯并调整其位置, 同时观察针在放大倍率下, 直到光线从针的中线 (纵向) 反射出来。
- 在旋转工具上通电, 然后使用平移阶段将针头推进到内 (金刚石) 切割盘 (图 2A)。
- 继续缓慢地向切割盘前进, 直到切割盘接近针的中线 (由架空光线沿中线的反射可视化)。
- 慢慢地将切割针表面从内钻轮移到外石轮上, 以更精细的抛光完成切割针表面 (图 2B)。
- 将针头从切割盘上缩回。
- 使用垂直旋转阶段, 旋转针180°。
- 重复步骤 1.2. 9-1. 2.10 以重塑针头的另一侧。
注: 针现在应该有两个近似相等长度的切削尖 (图 2C和2D)。 - 从生产阶段取出针头。
- 用比针头内径稍小的金属丝清洁内孔。
- 使用锋利的木棍 (e., 通过捕捉在棉花尖端涂抹器上的小木棒的末端), 去除可能仍然附着在新形成的针的边缘的任何毛刺。
注: 如有必要, 可通过热压罐电解抛光和灭菌。
2. 皮肤组织收获
- 使用收获针收集皮肤水样从前活体组织或活的动物。
- 对于体外皮肤组织 (特别是从皮下脂肪缺失或被修剪掉的样品), 将靶组织放在50毫升离心管的开口处, 或将两块组织堆叠在一起, 以避免损坏 n咿小贴士通过撞击坚硬的表面。
注:在活体动物体内采集时, 建议使用皮内注射进行局部利多卡因和肾上腺素的镇痛, 减少出血。 - 根据所需的水样量组装收割器具, 如下所述。
- 低中容量选项:
- 要收获小到中等数量的水样, 只需用生理盐水填充标准注射器 (10-20 毫升注射器通常工作正常), 并将其连接到收获针。
- 将收割针完全插入捐献者皮肤, 然后缩回。
- 按下注射器的活塞, 通过采集针冲洗盐水, 并排出在针头孔中的微柱。
- 要加快收割过程, 请重复步骤 2.4.2 3 到5次, 然后在步骤2.4.3 中驱逐水样。
注意: 通常情况下, 将水样到标准的细胞过滤器中是很方便的, 以方便后续的水样收集。 - 如果针头堵塞, 增加活塞的压力以排出滞留的组织并去除堵塞。如果仅仅增加压力是不够的, 插入一个金属线通过针头开口, 以清除堵塞在针孔。
- 将水样浸泡在盐水或培养基中, 直到用于防止脱水。
注意: 使用经验丰富的操作员, 上述方法可用于以每秒大约1微柱的速度收割水样。
- 高容量选项:
- 创建一个简单的吸力辅助装置, 可以构造, 以方便收集大量的水样。
注: 该设备包括一个收获针, 20 毫升注射器与鲁尔锁喷嘴, 吸入适配器通常用于吸脂 (图 3a), 和无菌的吸入罐。 - 从20毫升注射器中取出柱塞。
- 将注射器连接到吸入适配器。
- 通过将收割针附着在注射器上 (图 3B) 完成装配。
- 使用一条无菌吸气管将吸入适配器连接到无菌吸尘罐。确保收割设备连接到罐体输入, 使流体能够畅通无阻地流入罐中 (这可能需要连接到标记为流出而不是流入的容器端口)。
- 将设备连接到负压源。
注: 所需压力取决于针头直径和长度, 如前所述8。对于本手稿中描述的仪器, 典型手术室内的吸尘系统一般都足够。 - 将收割针连接到注射器。
- 通过将收割针插入皮肤, 收获水样。
注: 水样将通过吸力吸入注射器, 然后冲入吸入罐中。 - 在收割过程中间歇性地将收割针浸入无菌盐水容器中, 以冲洗系统。
注意: 这种盐水冲洗有利于微柱的运输, 并确保它们保持水合。或者, MFF 鲁尔适配器可以连接到注射器的鲁尔锁, 并通过连接油管, 也到挂盐水滴袋。 - 保持手上的金属线, 或较小的量规针, 这是略小于收割针的内径。如果针头堵塞, 可以通过将金属丝插入针孔来清除。
- 当所需的水样量在容器中积聚时, 请断开设备与吸力的连接, 然后通过过滤器将吸入罐的内容倒出, 以收集水样。
- 创建一个简单的吸力辅助装置, 可以构造, 以方便收集大量的水样。
- 收获后, 在捐赠部位涂抹外用抗生素软膏。
注: 捐助场所通常不需要额外的敷料。
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Representative Results
收获针应该能够收集水样的全厚度皮肤组织与大约80-90% 的成功率, 每个微柱应包含表皮, 真皮, 和一些皮下脂肪 (图 4)。如果收获的成功率很低, 或者如果在组织中插入针头变得困难, 那么可能需要新的针头。如果收获的成功率一直很低, 即使用新的针头, 那么针头可能太短。
如果在体内使用, 捐助者的网站应迅速愈合, 因为上皮通常在几天内发生3。水样可以直接应用于缠绕床上, 以增加伤口愈合3,4, 或者它们可以结合不同的基质材料来产生组合结构。水样还可以保持在培养体外研究9。
图 1: 制针设备.(a) 通过安装柱固定在垂直放置的旋转舞台上的雄性鲁尔锁连接器, 使鲁尔锁位于舞台的中心。(B) 垂直旋转阶段竖直安装到第二个水平旋转阶段 (黑色箭头)。水平旋转阶段被固定到两轴平移阶段 (白色箭头)。(C) 平行于面包板 (白色箭头) 的旋转工具的定位, 以及在制针设备 (红色箭头) 上的解剖显微镜。(D) 安装在旋转工具上的同心切割轮, 内侧有钻石轮 (黑色箭头), 外侧有石轮 (白色箭头)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 将针头切割成所需长度后, 旋转工具用于研磨新的针头尖端.(A) 首先, 钻石切割轮用于进行 "粗糙" 切割, 形成新的切削尖端和表面。(B) 在新的切削尖端与金刚石砂轮形成后, 将针头移到石轮上进行精细抛光。(C) 从正面和 (D) 从侧面观察到的已完成的收割针。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 用于大容量收割的组装.(A) 装配体的各个组件, 包括 (从左到右) 吸入适配器, 20 毫升注射器, 带鲁尔锁喷嘴, 以及收获针。(B) 所示为已完成的装配体, 准备连接到负压源。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 使用本手稿中所述的器具收割的代表皮肤水样.每个微柱包含表皮 (1), 全真皮 (2) 和一些皮下脂肪 (3)。图中的复选标记代表1毫米。这个数字已被修改从谭等 al。4按照相应的创意共享许可条款。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
这里描述的方法旨在使组织水样的收集足够数量的体内大型动物研究, 使用工具从商业上可用的实验室用品。本仪器以前在收割组织从被切除的人皮肤4,9以及活的猪皮肤3。所描述的具体参数是那些被发现最适合在猪中使用。预计同样的仪器可以修改和适应收集从啮齿动物和其他小动物的组织, 但这在我们的实验室没有测试。
本议定书的关键步骤包括确保收获针的长度足够 (效率低下的收获通常是由于针头太短), 使水样在整个收割过程中浸入液体中, 以防止脱水, 至少间歇性地用盐水冲洗系统 (否则水样堵塞针孔的可能性更高)。该技术的主要局限性是速度;例如, 在我们的演示中, 抽吸辅助装置通常每分钟可以收获120毫克的组织, 这足以用于动物实验中通常使用的较小伤口尺寸。将这种方法用于非常大的伤口 (例如, 在主要烧伤损伤模型中), 可能会有后勤上的挑战。针规是另一个限制-针规越小, 就越容易屈曲, 这是这种技术的主要失效模式 (相比之下, 该技术在过程中对针消光相对不敏感)。对于猪的皮肤, 我们通常使用19针, 这是机械坚固足够, 他们很少扣。在此基础, 每个动物实验 (通常涉及约 3,000-5, 000 水样) 通常只需要2到3针。25-量规是我们使用这种技术最小的针尺寸。
小皮肤伤口刺激组织再生的能力是临床程序的基础原理, 如分数激光重铺12和微针13。这些治疗是已知改善光老化皮肤的外观, 最近, 显示诱导疤痕重塑和改善皮肤疤痕的功能和美容14,15。这些技术的广泛临床经验还提供了进一步的验证, 皮肤能够愈合没有疤痕后, 这些 microinjuries 在绝大多数情况下, 与某些例外 (分数激光重铺据说有一个3.8% 的疤痕发生率, 几乎总是由于感染16, 突出了后程序性皮肤护理的重要性)。此外, 有瘢痕疙瘩或增生性瘢痕的人可能容易结疤, 即使这些较小的伤害;因此, 涉及生产 microinjuries 的治疗可能是 counterindicated 的。
虽然我们以前的调查重点是直接应用水样到皮肤伤口, 以提高愈合, 收集大量的组织的能力, 而不会导致其他长期供体部位的发病率 (疤痕, 挛缩等) 可能适用于各种其他应用。皮肤水样可以作为组织来源的方法涉及培养扩张或分离和分散的自体皮肤细胞10。此外, 水样提供了额外的好处, 尽量减少捐助者的部位发病率, 包括真皮细胞类型, 如与附件结构和各种茎/祖细胞种群, 居住在更深的部分真皮11 (这是不可用的传统方法, 利用剥离厚度皮肤作为起始材料)。自体水样也可用于体内实验, 研究组织对各种刺激物的反应, 如药物或化妆品, 与传统细胞培养的检测不同, 细胞和细胞外结构在每个微柱按照各自的自然组织格式进行维护。更普遍地说, 微柱收获方法也可以广泛适用于为各种组织工程/再生医学目的 (皮肤和其他器官) 提供自体细胞和组织, 作为小捐助者的根本原则伤口的完整和无瘢痕愈合可能是推广其他组织类型。
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Disclosures
作者是与本文所述技术相关的专利的共同发明者, 他们通过其机构-马萨诸塞州总医院获得了许可和版税收入。j. Tam 还为 Medline 工业公司提供咨询, 后者持有该技术的商业许可证。
Acknowledgments
这项工作部分由陆军、海军、NIH、空军、VA 和卫生事务部支持, 以支持一家 II 的努力, 根据奖号。W81XWH-13-2-0054。美国陆军医学研究收购活动, 820 钱德勒街, 德特里克堡, MD 21702-5014 是授予和管理收购办公室。意见、解释、结论和建议是作者的观点, 并不一定得到国防部的认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diamond wheel | Dremel | 545 | |
| Hypodermic needle (19G) | Fisher Scientific | 14-840-98 | Other needle sizes could be used, depending on experimental needs |
| Stone wheel | Dremel | 540 | |
| Syringe (20mL with luer lock) | Fisher Scientific | 22-124-967 | |
| Suction adapter | Tulip Medical | PA20BD | Optional, for high volume harvesting |
| Suction canister | Fisher Scientific | 19-898-212 | Optional, for high volume harvesting. Sterilize before use. |
| Suction tubing | Medline | DYND50216H | Optional, for high volume harvesting |
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