Apparater til høstning væv Microcolumns

Summary

Her beskriver vi en protokol for at producere høst nåle, der kan bruges til at indsamle fuld-tykkelse hudvæv uden at forårsage donor site ardannelse. Nålene kan kombineres med en simpel samling system for at opnå høj-volumen høst.

Abstract

Dette manuskript beskriver produktionsproces for en laboratorieapparatur, fremstillet af off-the-shelf komponenter, der kan bruges til at indsamle microcolumns fuld-tykkelse hud væv. Den lille størrelse af microcolumns tillader donor websteder til at helbrede hurtigt uden at forårsage donor site ardannelse, mens høst fuld-tykkelse væv giver indarbejdelsen af alle cellulære og ekstracellulære komponenter af hudvæv, herunder dem, der er forbundet med dybere dermal regioner og adnexal huden strukturer har der endnu ikke gengives korrekt ved hjælp af konventionelle tissue engineering teknikker. Microcolumns kan anvendes direkte på huden sår til at forøge healing, eller de kan bruges som autologe celler/væv kilde til andre tissue engineering tilgange. Høst Nålene er lavet ved at ændre standard kanyler, og de kan anvendes alene til høst af små mængder af væv eller kombineret med en simpel suge-baseret system til indsamling (også lavet fra almindeligt tilgængelige laboratorie forsyninger) for høj-volumen høst for at lette undersøgelser i store dyremodeller.

Introduction

Autologe hudtransplantation er grundpillen i såret reparation, men det er begrænset af donor site knaphed og sygelighed, fører til samordnet indsats i de seneste årtier til at udvikle nye terapeutiske muligheder for at erstatte konventionelle hudtransplantation^1,2 . Vi har for nylig udviklet en alternativ metode til høst hud for at udnytte fordelene ved fuld-tykkelse hudtransplantation samtidig minimere donor site sygelighed. Ved at samle full-tykkelse hud i form af lille (~0.5 mm diameter) "microcolumns", donor websteder er i stand til at helbrede hurtigt og uden ardannelse under normale omstændigheder (for mulige undtagelser, se afsnittet diskussion nedenfor)³. Microcolumns kan anvendes direkte i såret senge at fremskynde sår lukning, reducere sammentrækning³, og gendanne et mangfoldigt udvalg af epidermale og dermal celletyper og funktionelle adnexal strukturer⁴, hvoraf mange mangler i konventionelle split-tykkelse hud podning eller aktuelle bioengineered hud erstatninger⁵. Microcolumns til at forøge healing og deres donor websteder til at helbrede uden ardannelse evne har både selvstændigt valideret af andre forskning grupper^6,7.

Vi har tidligere udviklet et laboratorium høst system for at aktivere indsamling af microcolumns på skalaen⁸; men dette system er sammensat af mange brugerdefinerede komponenter, der ikke er almindeligt tilgængelig. Her, beskriver vi i detaljer processen for produktion høst nåle, samt enkel samling systemer, fremstillet af det meste off-the-shelf komponenter, der kan bruges til at opnå høj-volumen høst. Det apparatur, der er beskrevet i dette håndskrift er velegnet til in vitro- og animalske arbejde, men ikke til brug i mennesker. En klinisk enhed med FDA frihøjde for at anvende denne teknik i mennesker er kommercielt tilgængelige, men vil ikke blive diskuteret i detaljer her.

Protocol

Alle arbejder med levende dyr og animalske vævsprøver er blevet godkendt af Massachusetts General Hospital institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC).

1. produktionen af høst nåle

1. Opsætning af produktionsleddet
   1. Sikre en kvindelig luer lock stik på en post, og montere indlæg ind på en rotation scene, således at luer lock er på midten af scenen (fig. 1A).
   2. Placer denne første rotation fase lodret, og montere det vinkelret på en anden, vandret rotation fase (figur 1B).
   3. Monter på vandrette drejningsvinkler scenen på en to-akse oversættelse scene (figur 1B).
   4. Fastgør kombination på en stabil overflade, såsom en optisk breadboard.
   5. Separat montere en roterende værktøj på den samme breadboard, med værktøjet placeret parallelt med breadboard og på omtrent samme højde som luer lock stik på rotation/oversættelse kombination scenen (figur 1C).
   6. Installere to skæreskiver koncentrisk på det roterende værktøj (en mindre, lavere grus diamantskæreskive over en større, højere grus sten cut-off hjul) (fig. 1D).
      Bemærk: Om en 9 mm forskel mellem de to hjul diameter er normalt tilstrækkeligt.
   7. Holdning en overhead lys kilde med en justerbar arm over den roterende værktøj, med lyset sigter mod at skære hjul.
   8. For at forbedre visualisering, skal du placere et dissekere mikroskop over opsætningen af produktion, så okularet er fokuseret på de skære skiver (figur 1C).
      Bemærk: Alternativt, brugere kan bære Forstørrelsesglas briller.
2. Omformningen nål-spids
   1. Bære beskyttelsesbriller og en kirurgisk maske til at forhindre, at fine metal partikler ind i øjne eller luftveje.
   2. Vælg kanyler for den pågældende måle størrelse, baseret på eksperimentel krav.
   3. Mærke off den forventede længde på hver høst nål.
      Bemærk: For høst fra svin hud, 8 mm nåle er typisk tilstrækkelige; selv om længden kan variere baseret på eksperimentel behov (fx., tykkelsen af huden målvæv, nål gauge størrelse). Generelt, en 19-gauge kanyle fungerer godt for svin hud.
   4. Lavere nål vinkelret på den roterende værktøj med magt på, ved hjælp af kanten af den ydre skæring disk for at afskære overskydende længde af nålen, på tidspunkt markeret i trin 1.2.3.
   5. Tilslut den forkortede, stump nål til kvindelige luer lock stik på produktionsleddet.
   6. Juster den vandrette drejningsvinkler fase, så nålen er i en 12° vinkel parallel til at skære skiverne på det roterende værktøj (ændre vinklen vil påvirke den nødvendige for nål indsættelse kraft).
   7. Tænde lys overhead og justere dens position under iagttagelse nål under forstørrelse, indtil lyset reflekteres fra midterlinjen (på langs) af nålen.
   8. Magt på den roterende værktøj, så brug den oversættelse fase at fremme nål mod den indre (diamant) skære disken (fig. 2A).
   9. Holde fremme nål langsomt mod skære disken, indtil skæring disken når ca midterlinjen af nål (som visualiseret ved den overhead lys refleksion langs midterlinjen).
   10. Langsomt flytte skære nål overfladen fra den indre diamantskiven på den ydre sten hjul til slut skære nål overfladen med en finere polsk (figur 2B).
   11. Trække nålen fra at skære disken.
   12. Ved hjælp af lodrette rotation scenen, rotere nål 180°.
   13. Gentag trin 1.2.9-1.2.10 for at omforme anden siden af nålen.
       Bemærk: Nålen skal nu have to cutting tips af omtrent samme længde (fig. 2 c og 2D).
   14. Fjern nålen fra produktionsleddet.
   15. Rengøre indersiden kede med en metaltråd, der er lidt mindre end den nål indvendige diameter.
   16. Ved hjælp af en skarp træpind (fx., af snapping off i slutningen af den lille træpind på en bomuld spids applikator), fjerne eventuelle grater, der stadig kan fastgøres til kanterne af den nydannede nål.
       Bemærk: Høst nåle kan være elektropoleret og steriliseres ved autoklavering, hvis nødvendigt.

2. hud væv høst

1. Brug høst nåle til at indsamle hud microcolumns fra ex vivo væv eller levende dyr.
2. For ex vivo hud væv, der er tynd (især fra prøver hvor den spæk mangler eller var trimmet væk), holde målvæv over åbningen af et 50 mL centrifugeglas, eller stable to stykker af væv oven på hinanden, at undgå at beskadige n eedle tips ved at ramme dem mod hårde overflader.
   Bemærk: I vivo høst fra levende dyr, det anbefales at lokale lidokain og adrenalin administreres ved intradermal indsprøjtning for analgesi og til at reducere blødning.
3. Samle høst apparatet ifølge mængden af microcolumns behov, som beskrevet nedenfor.
4. Lav-medium volumen indstilling:
   1. For at høste små til mellemstore mængder af microcolumns, blot udfylde en standard sprøjte (10-20 mL sprøjter normalt fungerer godt) med normal saltvand og slutte den til en høst nål.
   2. Helt indsætte høst nålen ind i donor huden og derefter trække den.
   3. Tryk på stempel sprøjte til at skylle saltvand gennem høst nålen og udvise den microcolumn, der er indgivet i nål boringen.
   4. For at fremskynde den høst proces, Gentag trin 2.4.2 3 til 5 gange før udvisning microcolumns i trin 2.4.3.
      Bemærk: Det er normalt bekvemt at udvise microcolumns ind i en standard celle si til at lette den efterfølgende indsamling af microcolumns.
   5. Hvis nåle bliver tilstoppet, øge presset på stempel til at udvise den stak væv og fjerne tilstoppe. Hvis blot stigende pres er utilstrækkelig, bar Indsæt en metaltråd gennem nålen tip åbning at rydde tilstoppes i nålen.
   6. Holde microcolumns neddykket i saltvand eller mellemlang indtil brug til at forhindre udtørring.
      Bemærk: Med en erfaren operatør, den ovenfor beskrevne metode kan bruges til at høste microcolumns med en hastighed på ca. 1 microcolumn pr. sekund.
5. Høj volumen indstilling:
   1. Oprette en simpel suge-assisteret enhed, der kan konstrueres til at lette samling af store mængder af microcolumns.
      Bemærk: Enheden består af en høst nål, 20 mL sprøjte med luer lock dyse, suge adapter bruges typisk ved Fedtsugning (fig. 3A), og sterile suge beholder.
   2. Fjerne stemplet fra 20 mL sprøjte.
   3. Tillægge en suge adapter sprøjten.
   4. Komplet samling ved at knytte en høst nål til sprøjte (figur 3B).
   5. Brug et stykke af sterile suge rør til at forbinde den suge adapter til en steril suge dunk. Sørg for høst apparatet er forbundet til en dunk input, der giver mulighed for væske til at flyde ind i beholderen uhindret (som måske kræver forbindelse til en dunk-port, der er markeret til udstrømning snarere end indstrømning).
   6. Apparatet forbindes et undertryk kilde.
      Bemærk: Det pres der kræves afhænger af nålen diameter og længde, som tidligere beskrevet⁸. For apparatet beskrevet i dette manuskript, er suge systemet fundet i typiske operationsstuer normalt tilstrækkeligt.
   7. Tilslut en høst nål til sprøjten.
   8. Høst af microcolumns ved at indsætte den høst nål ind i huden.
      Bemærk: Microcolumns vil være trukket ind i sprøjten af suge, så skyllet ind suge beholderen.
   9. Periodisk dyppe høst nålen i en beholder med sterilt saltvand under den høstning procedure at skylle systemet.
      Bemærk: Denne saltvand flush letter transport af microcolumn og sikrer de bo hydreret. Alternativt kan en FFR luer adapter tilsluttes til luer lock af sprøjten, og gennem en tilslutningsslange, også til en hængende saltvand drypper taske.
   10. Holde på hånd en metaltråd, eller mindre gauge kanyle, der er lidt mindre end den høst nål indvendige diameter. Hvis nålen bliver tilstoppet, kan det blive ryddet ved at indsætte den metaltråd i nål boringen.
   11. Når den ønskede mængde af microcolumns har akkumuleret i beholderen, frakoble enheden fra suge, så hæld indholdet af suge beholderen ud igennem et filter til at indsamle microcolumns.
6. Efter høst, skal du anvende et aktuelt antibiotisk salve over donor websteder.
   Bemærk: Yderligere forbindinger er generelt ikke påkrævet for donor websteder.

Representative Results

Høst nålene bør være i stand til at indsamle microcolumns fuld-tykkelse hud væv med cirka et 80-90% succesrate, og hver microcolumn bør indeholde epidermis, dermis og nogle spæk (figur 4). Hvis succesraten for høst er lavt, eller hvis det bliver svært at indsætte en nål i væv, er en ny nålen sandsynligvis nødvendig. Hvis succesraten for høst er konsekvent lav, selv med nye nåle, derefter er nåle sandsynligvis alt for kort.

Hvis brugt i vivo, skal donor websteder helbrede hurtigt, da re epithelialization forekommer typisk inden for et par dage³. Microcolumns kan anvendes direkte til at sår senge for at øge sårheling^3,4, eller de kan kombineres med forskellige matrix materialer til at fremstille kombination konstruktioner. Microcolumns kan også holdes i kultur til in vitro- undersøgelser⁹.

Figur 1 : Nål gør apparater. (A) en mandlig luer lock stik sikret via en montering post på et vertikalt placerede rotation scene, således at luer lock er midt på scenen. (B) lodret rotation fase er monteret vinkelret på en anden, vandret rotation scene (sort pil). Den vandrette drejningsvinkler fase er sikret til en to-akse oversættelse fase (hvid pil). (C) positionering af det roterende værktøj parallelt breadboard (hvid pil) og dissekere mikroskopet over nål-making apparater (rød pil). (D) koncentriske skæreskiver monteret på roterende værktøj med diamant hjul på indersiden (sort pil) og sten hjul på ydersiden (hvid pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Efter opskæring nålen til den ønskede længde, den roterende værktøj bruges til at slibe nye nål tips. (A) for det første bruges diamantskæreskive til at gøre "ru" nedskæringer at danne nye cutting tips og overflader. (B) efter de nye cutting tips er dannet med diamantskiven, er nålen flyttet til sten hjulet for fine polering. (C) færdig høst nålen set forfra og (D) fra siden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Samling til høj-volumen høst. (A) individuelle komponenter af den forsamling, herunder (venstre mod højre) suge adapter, 20 mL sprøjte med luer lock dyse og høst nål. (B) vist er den afsluttede forsamling, klar til at oprette forbindelse til undertryk kilde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Repræsentant hud microcolumns høstet med det apparatur, der er beskrevet i dette håndskrift. Hver microcolumn indeholder epidermis (1), fuld dermis (2), og nogle spæk (3). Sæt hak i figur repræsenterer 1 mm. Dette tal er blevet ændret fra Tam mfl. ⁴ i henhold til betingelserne i det tilsvarende creative commons licens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Metoderne beskrevet her er beregnet til at aktiverer samling af væv microcolumns i tilstrækkelige mængder til, i vivo store dyreforsøg, ved hjælp af værktøjer fra kommercielt tilgængelige laboratorie forsyninger. Dette apparat er blevet brugt tidligere i høst væv fra skåret menneskelige hud^4,9 samt levende svin hud³. Specifikke parametre er dem, der fandtes for at være mest velegnet til brug i svin. Det forventes at samme apparatur kan ændres og tilpasses for at indsamle væv fra gnavere og andre små dyr, men dette er ikke blevet testet i vores laboratorium.

Kritiske trin i denne protokol omfatter sikring af høst Nålene er af tilstrækkelig længde (ineffektiv høst er normalt på grund af nåle bliver for kort), at holde microcolumns nedsænkes i væske i hele den høst oparbejde hen til forhindre udtørring, og rødmen system med saltvand mindst intermitterende (ellers er der en højere sandsynlighed for microcolumns tilstopning nål boring). Den største begrænsning af denne teknik er hastighed; for eksempel i vores demonstration, kan suge-assisteret apparater generelt høst 120 mg af væv per minut, som er tilstrækkelige for mindre sår størrelser typisk brugt i dyreforsøg. Det ville sandsynligvis være logistisk udfordrende at bruge denne fremgangsmåde til meget store sår (fx., i major brænde skade modeller). Nål gauge er en anden begrænsning - jo mindre nålen måle, jo mere modtagelige det er at buckling, som er den vigtigste svigt af denne teknik (derimod teknikken er relativt ufølsomme over for nål bliver sløve under proceduren). For svin hud bruger vi normalt 19-gauge nåle, der er mekanisk robust nok, at de sjældent spænde. Desuden, hver animalske eksperiment (typisk involverer omkring 3.000-5.000 microcolumns) kræver som regel kun 2 til 3 nåle. 25-gauge er den mindste nål størrelse vi har brugt med denne teknik.

Lille hud sår evne til at stimulere væv revitalisering er det grundlæggende princip bag kliniske procedurer såsom Fraktioneret laser resurfacing¹² og microneedling¹³. Disse behandlinger er kendt for at forbedre det kosmetiske udseende af huden, photoaged, og for nylig vist sig at fremkalde ar remodellering og forbedre funktionen og cosmesis af hud ar^14,15. Den omfattende klinisk erfaring med disse teknikker giver også yderligere validering, at huden er i stand til at helbrede uden ardannelse efter disse microinjuries i langt de fleste tilfælde, med visse undtagelser (Fraktioneret laser resurfacing efter sigende har en 3,8% forekomsten af ardannelse, næsten altid som følge af infektion¹⁶, fremhæve vigtigheden af post proceduremæssige hudpleje). Desuden, kan mennesker med en historie af keloider eller hypertrofisk ardannelse være modtagelige for ardannelse selv med disse mindre skader; således, behandlinger, der involverer produktion af microinjuries kan være counterindicated.

Mens vores tidligere undersøgelser har fokuseret på direkte anvendelse af microcolumns i huden sår til at forbedre healing, evnen til at indsamle betydelige mængder af væv uden at forårsage andre kan langsigtede donor site morbiditet (ardannelse, kontraktur, etc.) være nyttige for en bred vifte af andre programmer. Hud microcolumns kan tjene som væv kilde for tilgange, der inddrager kultur udvidelse eller dissociation og spredning af autolog hud celler¹⁰. Derudover microcolumns giver ekstra fordelene ved minimering donor site sygelighed og herunder dermal celletyper, som dem, der er tilknyttet adnexal strukturer og de forskellige stem/stamceller cellepopulationer, der bor i dybere dele af den dermis¹¹ (som ikke er tilgængelige med konventionelle metoder, der udnytter split-tykkelse hud som råvaren). Autolog microcolumns kan også bruges i ex vivo assays til at studere væv respons på forskellige stimuli som lægemidler eller kosmetiske midler, i modsætning til konventionelle celle kultur-baserede assays, de cellulære og ekstracellulære strukturer i hver microcolumn vedligeholdes i deres respektive naturlige organisation formater. Mere generelt kan microcolumn høst tilgang også være bredt gældende at levere autologe celler og væv til forskellige væv engineering/regenerativ medicin formål (for huden og andre organer), som det underliggende princip for små donor sår gennemgår komplet og scarless healing er tilbøjelige til at være et generaliserbart til andre vævstyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diamond wheel	Dremel	545
Hypodermic needle (19G)	Fisher Scientific	14-840-98	Other needle sizes could be used, depending on experimental needs
Stone wheel	Dremel	540
Syringe (20mL with luer lock)	Fisher Scientific	22-124-967
Suction adapter	Tulip Medical	PA20BD	Optional, for high volume harvesting
Suction canister	Fisher Scientific	19-898-212	Optional, for high volume harvesting. Sterilize before use.
Suction tubing	Medline	DYND50216H	Optional, for high volume harvesting