Summary
Qui descriviamo un protocollo per la produzione di raccolta aghi che possono essere utilizzati per raccogliere il tessuto della pelle di pieno-spessore senza causare donatore sito cicatrici. Gli aghi possono essere combinati con un sistema di raccolta semplice raggiungere alti volumi di raccolta.
Abstract
Questo manoscritto descrive il processo di produzione per un apparecchio da laboratorio, costituito da componenti standard, che possono essere utilizzati per raccogliere microcolonne del tessuto della pelle di pieno-spessore. Le piccole dimensioni delle microcolonne permettono donatore siti di guarire rapidamente senza causare sito donatore cicatrici, durante la raccolta del tessuto di pieno-spessore consente l'inserimento di tutti i componenti cellulari ed extracellulari del tessuto della pelle, compresi quelli associato con aree cutanee più profonde e le strutture adnexal della pelle, che devono ancora essere riprodotto con successo mediante tecniche di ingegneria tissutale convenzionali. Le microcolonne possono essere applicate direttamente sulle ferite di pelle per aumentare la guarigione, o può essere utilizzati come origine delle cellule/tessuto autologo per altri approcci di ingegneria dei tessuti. Il raccolto aghi sono fatti modificando gli aghi ipodermici standard, e può essere usati da solo per la raccolta di piccole quantità di tessuto o accoppiati con un sistema di raccolta basato su aspirazione semplice (anche fatto da forniture di laboratorio comunemente disponibili) per volumi elevati di raccolta per facilitare studi in modelli animali di grandi dimensioni.
Introduction
Innesto cutaneo autologo è il cardine della riparazione della ferita, ma è limitato dalla scarsità di sito donatore e morbosità, che conduce a sforzi concertati negli ultimi decenni per sviluppare nuove opzioni terapeutiche per sostituire convenzionali l'innesto di pelle1,2 . Recentemente abbiamo sviluppato un metodo alternativo di raccolta della pelle per sfruttare i vantaggi dell'innesto di pelle di pieno-spessore, riducendo al minimo la morbilità del sito donatore. Attraverso la raccolta di pelle di pieno-spessore sotto forma di piccolo (~0.5 mm di diametro) "microcolonne", sono in grado di guarire rapidamente e senza lasciare cicatrici in circostanze normali siti donatori (per possibili eccezioni, vedere la sezione di discussione qui sotto)3. Microcolonne può essere applicato direttamente nel letto della ferita per accelerare la chiusura della ferita, ridurre la contrazione3e ripristinare una vasta gamma di tipi delle cellule epidermiche e cutanee e funzionali strutture adnexal4, molti dei quali sono privi di l'innesto di pelle di spaccare-spessore convenzionale o corrente bioingegnerizzati pelle sostituti5. La capacità di microcolonne per aumentare la guarigione e dei loro siti donatori di guarire senza cicatrici sono entrambi in modo indipendente validati da altri gruppi di ricerca6,7.
In precedenza abbiamo sviluppato un sistema di raccolta del laboratorio per consentire la raccolta di microcolonne a scala8; Tuttavia, questo sistema è composto da molti componenti personalizzati che non sono ampiamente disponibili. Qui, descriviamo in dettaglio il processo per produrre raccolta aghi, nonché sistemi di raccolta semplice, fatta da principalmente componenti normalizzati, che possono essere utilizzati per raggiungere alti volumi di raccolta. L'apparecchiatura descritta in questo manoscritto è adatto per in vitro e lavoro animale, ma non per uso in esseri umani. Un dispositivo clinico con autorizzazione della FDA per l'applicazione di questa tecnica in esseri umani è disponibile in commercio, ma non sarà discusso in dettaglio qui.
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Protocol
Tutti i lavori che coinvolgono animali vivi e campioni di tessuto animale sono stati approvati dal Massachusetts General Hospital istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC).
1. produzione di raccolta aghi
- Installazione della fase di produzione
- Garantire un raccordo luer lock femmina su un post e montare il post su un palcoscenico di rotazione in modo che luer lock è al centro del palco (Figura 1A).
- Posizionare questa prima fase di rotazione verticale e montarlo perpendicolarmente su una fase di rotazione orizzontale, secondo (Figura 1B).
- Montare la fase di rotazione orizzontale su un palcoscenico di traduzione di due assi (Figura 1B).
- Fissare la combinazione su una superficie stabile, ad esempio un tagliere ottico.
- Separatamente, montare un utensile rotante sulla breadboard stesso, con lo strumento posizionato in parallelo con la breadboard e approssimativamente alla stessa altezza come il raccordo luer lock sul palco di combinazione di rotazione/traduzione (Figura 1C).
- Installare due dischi da taglio concentricamente sull'utensile rotante (una grana più piccolo, più basso cut-off mola diamantata sopra una ruota di pietra da taglio di grana più grande, più alto) (Figura 1D).
Nota: Su un 9 mm la differenza tra i diametri delle due ruote è generalmente sufficiente. - Posizione una plafoniera di origine con un braccio regolabile sull'utensile rotante, con la luce ha puntata le ruote di taglio.
- Per migliorare la visualizzazione, è possibile posizionare un microscopio per dissezione sopra il setup di produzione in modo che l'oculare si concentra sui dischi di taglio (Figura 1C).
Nota: In alternativa, gli utenti possono indossare occhiali ingrandente.
- Rimodellare la punta dell'ago
- Indossare occhiali protettivi e una mascherina chirurgica per impedire che particelle fini del metallo entrando gli occhi o delle vie aeree.
- Scegliere aghi ipodermici di appropriato valutare dimensioni, basato su requisiti sperimentali.
- Marcare la lunghezza prevista su ogni ago raccolta.
Nota: Per la raccolta da pelle suina, aghi di 8 mm sono in genere sufficienti; anche se, la lunghezza può variare in base alle esigenze sperimentali (ad es., lo spessore del tessuto cutaneo di destinazione, calibro ferri). Generalmente, un ago di calibro 19 funziona bene per pelle suina. - Abbassare l'ago perpendicolarmente all'utensile rotante con il potere, usando il bordo del disco esterno taglio per tagliare la lunghezza in eccesso dell'ago, al punto segnato al punto 1.2.3.
- Collegare l'ago smussato, abbreviato per il raccordo luer lock femmina sulla fase di produzione.
- Regolare la fase di rotazione orizzontale in modo che l'ago sia ad un angolo di 12° parallelo per i dischi di taglio dell'utensile rotativo (cambiando l'angolo avrà un impatto la forza necessaria per l'inserimento dell'ago).
- Accendere la plafoniera e regolare la sua posizione osservando l'ago sotto ingrandimento, fino a quando la luce viene riflessa dalla linea mediana (longitudinale) dell'ago.
- Accendere l'utensile rotante, quindi utilizzare la fase di traduzione per far avanzare l'ago verso l'interno (diamante) disco (Figura 2A).
- Tenere avanzando l'ago lentamente contro il disco di taglio fino a quando il disco di taglio raggiunge circa la linea mediana dell'ago (come visualizzati da riflesso della luce ambientale lungo la linea mediana).
- Spostare lentamente la superficie del taglio dell'ago dalla mola di diamante interiore contro la ruota di pietra esterna per rifinire la superficie del taglio dell'ago con uno smalto più fine (Figura 2B).
- Ritirare l'ago lontano il disco di taglio.
- Utilizzando la fase di rotazione verticale, ruotare l'ago di 180°.
- Ripetere i passaggi 1.2.9-1.2.10 per rimodellare l'altro lato dell'ago.
Nota: L'ago dovrebbe ora avere due punte di taglio di lunghezza approssimativamente uguale (Figura 2 e 2D). - Rimuovere l'ago dalla fase di produzione.
- Pulito l'interno del foro con un filo metallico che è leggermente più piccolo del diametro interno dell'ago.
- Utilizzando un bastone di legno tagliente (ad es., schioccando fuori alla fine del piccolo bastone in legno su un cotton-fioc), rimuovere eventuali sbavature che possono essere ancora attaccati ai bordi dell'ago appena costituita.
Nota: Raccolta aghi può essere elettrolucidato e sterilizzato in autoclave, se necessario.
2. pelle tessuto raccolta
- Utilizzare gli aghi raccolto per raccogliere microcolonne di pelle da ex vivo tessuto o con animali vivi.
- Per ex vivo pelle tessuto che è sottile (soprattutto da campioni dove il grasso sottocutaneo è mancante o è stato tagliato via), tenere il tessuto dell'obiettivo sopra l'apertura di un tubo di centrifuga da 50 mL, o impilare due pezzi di tessuto in cima a vicenda, per evitare di danneggiare il n Suggerimenti eedle colpendoli contro superfici dure.
Nota: Per in vivo raccolta da animali vivi, è consigliabile che epinefrina e lidocaina locale essere somministrato mediante iniezione intradermica per analgesia e per ridurre il sanguinamento. - Montare l'apparecchiatura raccolta secondo la quantità di microcolonne necessari, come descritto di seguito.
- Opzione di basso-medio volume:
- Per raccogliere le piccole e medie quantità di microcolonne, semplicemente riempire una siringa standard (10-20 mL siringhe di solito funzionano bene) con soluzione salina e collegarlo ad un ago raccolto.
- Completamente inserire l'ago raccolta la pelle del donatore, quindi ritirarlo.
- Spingere il pistone della siringa per pulire salino attraverso l'ago di raccolta ed espellere la microcolonna che è depositato nel foro dell'ago.
- Per accelerare il processo di raccolta, ripetere il passaggio 2.4.2 3 a 5 volte prima di espellere le microcolonne al punto 2.4.3.
Nota: È solitamente conveniente per espellere le microcolonne in un colino di cella standard per facilitare la successiva raccolta di microcolonne. - Se gli aghi sono ostruiti, aumentare la pressione sul pistone per espellere il tessuto bloccato e rimuovere lo zoccolo. Se semplicemente aumentando la pressione non è sufficiente, inserire un filo metallico attraverso l'apertura di punta dell'ago per cancellare lo zoccolo nell'ago foro.
- Mantenere le microcolonne sommerse in Salina o medie fino all'utilizzo per evitare il disseccamento.
Nota: Con un operatore esperto, il metodo sopra descritto può essere utilizzato per raccogliere microcolonne ad un tasso di circa 1 microcolonna al secondo.
- Opzione ad alto volume:
- Creare un semplice dispositivo di aspirazione assistita che può essere costruito per facilitare la raccolta di grandi quantità di microcolonne.
Nota: Il dispositivo è costituito da un ago raccolto, siringa da 20 mL con ugello luer lock, adattatore di aspirazione in genere utilizzato per liposuzione (Figura 3A) e contenitore sterile. - Togliere lo stantuffo dalla siringa da 20 mL.
- Collegare la siringa a un adattatore di aspirazione.
- Completare il montaggio collegando un raccolta dell'ago sulla siringa (Figura 3B).
- Utilizzare un pezzo di tubo di aspirazione sterile per collegare l'adattatore di aspirazione in un contenitore sterile. Assicurarsi che l'apparato di raccolta è collegato ad un ingresso di scatola metallica che permette fluido nel contenitore senza impedimenti (che potrebbe richiedere la connessione a una porta bombola che è contrassegnata per deflusso anziché afflusso).
- Collegare l'apparecchio a una fonte di pressione negativa.
Nota: La pressione necessaria dipende dal diametro dell'ago e la lunghezza, come descritto in precedenza8. Per l'apparecchiatura descritta in questo manoscritto, il sistema di aspirazione trovato nelle tipiche sale operatorie è generalmente sufficiente. - Connettere un raccolta dell'ago alla siringa.
- Raccogliere le microcolonne inserendo l'ago raccolta nella pelle.
Nota: Le microcolonne saranno aspirate nella siringa di aspirazione, poi scaricate nel contenitore. - In modo intermittente immergere l'ago raccolta in un contenitore di soluzione salina sterile durante la procedura di raccolta per lavare il sistema.
Nota: Questa soluzione salina facilita il trasporto della microcolonna e assicura che loro rimanere idratati. In alternativa, può essere collegato un adattatore luer QFP al luer lock della siringa e attraverso un tubo di collegamento, anche per un sacchetto di flebo salina d'attaccatura. - Tenere in mano un filo metallico, o più piccolo calibro dell'ago, che è leggermente più piccolo del diametro interno dell'ago raccolta. Se l'ago si ostruisce, può essere cancellata inserendo il filo metallico nel foro dell'ago.
- Quando la quantità desiderata di microcolonne hanno accumulato nel canister, scollegare il dispositivo di aspirazione, quindi versare il contenuto del contenitore fuori attraverso un filtro per raccogliere le microcolonne.
- Creare un semplice dispositivo di aspirazione assistita che può essere costruito per facilitare la raccolta di grandi quantità di microcolonne.
- Dopo la raccolta, è necessario applicare un unguento antibiotico topico sui siti donatori.
Nota: Ulteriori medicazioni non sono generalmente necessari per siti donatori.
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Representative Results
Gli aghi raccolto dovrebbero essere in grado di raccogliere microcolonne del tessuto della pelle di pieno-spessore con circa un tasso di successo di 80-90%, e ogni microcolonna dovrebbe contenere epidermide, derma e qualche grasso sottocutaneo (Figura 4). Se il tasso di successo della raccolta è basso, o se diventa difficile inserire un ago nel tessuto, quindi un nuovo ago è probabilmente necessaria. Se il tasso di successo per la raccolta è sempre basso, anche con nuovi aghi, gli aghi sono probabilmente troppo brevi.
Se utilizzato in vivo, donor site dovrebbero guarire rapidamente, come riepitelizzazione avviene in genere entro pochi giorni3. Microcolonne possono essere applicati direttamente per letti per aumentare3,4di cicatrizzazione di ferita, o essi possono essere combinati con materiali di matrice diversa per la produzione di costrutti di combinazione. Microcolonne può anche essere mantenute in coltura per in vitro studi9.
Figura 1 : Ago fare apparato. (A) un maschio luer lock femmina protetto tramite un post di montaggio su un palcoscenico di rotazione posizionato verticalmente, in modo che luer lock è al centro del palco. (B) la fase di rotazione verticale è montata perpendicolarmente su un rotazione orizzontale, secondo stadio (freccia nera). La fase di rotazione orizzontale è fissata ad una fase di traduzione di due assi (freccia bianca). (C) posizionamento dello strumento rotante parallelo alla breadboard (freccia bianca) e il microscopio per dissezione sopra l'apparato di ago-making (freccia rossa). (D) dischi da taglio concentrico montato su utensile rotante, con un disco diamantato all'interno (freccia nera) e ruota di pietra all'esterno (freccia bianca). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Dopo aver tagliato l'ago alla lunghezza desiderata, l'utensile rotante è usato per macinare nuove punte dell'ago. (A) in primo luogo, il disco di taglio del diamante è utilizzato per fare tagli "grezzi" per formare le nuove punte di taglio e le superfici. (B) dopo le nuove punte di taglio sono formate con il disco diamantato, l'ago viene spostato la ruota di pietra per lucidatura fine. (C) finito dell'ago, visualizzato dalla parte anteriore e (D) dal lato di raccolta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Assemblea per la raccolta di volumi elevati. (A) singoli componenti dell'Assemblea, tra cui (da sinistra a destra) l'adattatore di aspirazione, siringa da 20 mL con ugello luer lock e ago raccolta. (B) indicato è l'assembly completato, pronto per connettersi all'origine di pressione negativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Pelle rappresentante microcolonne raccolte utilizzando l'apparecchiatura descritta in questo manoscritto. Ogni microcolonna contiene l'epidermide (1), derma completo (2) e qualche grasso sottocutaneo (3). Segni di spunta nella figura rappresentano 1 mm. Questa figura è stata modificata da Tam et al. 4 secondo i termini della licenza creative commons corrispondente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I metodi descritti qui sono destinati a consentire la raccolta di tessuto microcolonne in quantità sufficienti per in vivo grandi studi sugli animali, utilizzando strumenti realizzati da forniture di laboratorio disponibili in commercio. Questo apparecchio è stato utilizzato in precedenza nella raccolta del tessuto da pelle umana asportata4,9 , nonché suini vivi pelle3. I parametri specifici descritti sono quelli che sono stati trovati per essere più adatto per l'uso nei suini. Si prevede che la stessa apparecchiatura può essere modificata e adattata per la raccolta di tessuto da roditori e altri piccoli animali, ma questo non è stato testato nel nostro laboratorio.
Punti critici in questo protocollo anche assicurare che il raccolto aghi sono di lunghezza sufficiente (raccolta inefficiente è solitamente dovuto aghi troppo breve), mantenendo le microcolonne immersi in liquido durante tutto il processo di raccolta per evitare essiccazione e vampate di calore il sistema con soluzione fisiologica almeno a intermittenza (altrimenti c'è una maggiore probabilità di microcolonne intasamento del foro dell'ago). La limitazione principale di questa tecnica è velocità; ad esempio, nella nostra dimostrazione, l'apparato di aspirazione-assistita può generalmente raccolto 120 mg di tessuto al minuto, che è sufficiente per ferita di piccola dimensioni in genere utilizzata negli esperimenti sugli animali. Probabilmente sarebbe logisticamente impegnativo da utilizzare questo approccio per ferite molto grandi (ad es., in maggiore bruciare modelli di lesione). Calibro dell'ago è un altro limite - il più piccolo calibro dell'ago, più suscettibile è a carico di punta, che è la modalità di guasto principale di questa tecnica (al contrario, la tecnica è relativamente insensibile ai ferri opacizzare durante la procedura). Per la pelle suina, normalmente usiamo aghi 19 gauge, che sono meccanicamente abbastanza robusti che essi raramente fibbia. Futhermore, ogni esperimento sugli animali (in genere che coinvolgono circa 3.000-5.000 microcolonne) di solito richiede solo 2 o 3 aghi. calibro 25 è la più piccola dimensione dell'ago che abbiamo usato con questa tecnica.
La possibilità di ferite della pelle piccolo per stimolare la rigenerazione dei tessuti è il principio di fondo dietro procedure cliniche come fractional laser resurfacing12 e microneedling13. Questi trattamenti sono conosciuti per migliorare l'aspetto estetico della pelle photoaged e più recentemente, indicati per indurre il rimodellamento della cicatrice e migliorare la funzione e il cosmesis della pelle cicatrici14,15. La vasta esperienza clinica con queste tecniche, inoltre fornisce ulteriore convalida che la pelle è in grado di guarire senza cicatrici dopo queste microlesioni nella stragrande maggioranza dei casi, con alcune eccezioni (laser resurfacing frazionale ha riferito un 3,8% incidenza di cicatrici, quasi sempre a seguito di infezione16, evidenziando l'importanza della cura della pelle post-procedurale). Inoltre, persone con una storia di cicatrici ipertrofiche o cheloidi possono essere suscettibili di cicatrici anche con queste lesioni più piccole; così, trattamenti che coinvolgono la produzione di microtraumi possono essere counterindicated.
Mentre le nostre indagini precedenti hanno focalizzato sull'applicazione direttamente microcolonne nelle ferite della pelle per migliorare la guarigione, la capacità di raccogliere quantità significative di tessuto senza causare altre morbidità di sito donatore a lungo termine (cicatrici, contrattura, ecc.) possono essere utile per una vasta gamma di altre applicazioni. Microcolonne di pelle può servire come la fonte di tessuto per approcci che coinvolgono cultura espansione o dissociazione e dispersione di pelle autologo cellule10. Inoltre, microcolonne forniscono i benefici aggiuntivi di minimizzare la morbilità del sito donatore e compresi i tipi di cellula cutanea, quali quelli connessi con strutture adnexal e le varie popolazioni di cellule staminali/progenitrici che risiedono nelle parti più profonde della derma11 (che non sono disponibili con i metodi convenzionali che utilizzano pelle di spaccare-spessore come materiale di partenza). Microcolonne autologo può essere utilizzato anche nel analisi ex vivo per studiare la risposta del tessuto ai vari stimoli quali farmaci o prodotti cosmetici in cui, a differenza dei convenzionali delle cellule saggi basati su cultura, le strutture cellulari ed extracellulari in ciascuna microcolonna sono mantenuti nel loro formato naturale rispettiva organizzazione. Più in generale, la microcolonna raccolta approccio possono anche essere ampiamente applicabile a fornire cellule autologhe e tessuti per vari scopi di medicina ingegneria/rigenerativa del tessuto (per la pelle e altri organi), come il principio di fondo del piccolo donatore ferite in fase di guarigione completa e senza cicatrici sono probabile essere generalizzabile ad altri tipi di tessuto.
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Disclosures
Gli autori sono co-inventori su brevetti relativi alla tecnologia descritta in questo articolo, da cui hanno ricevuto licenze e royalty ricavi attraverso la loro istituzione, il Massachusetts General Hospital. J. Tam consulta anche per Medline Industries, Inc., che detiene la licenza commerciale per questa tecnologia.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato in parte di esercito, Marina, NIH, aeronautica, VA e Health Affairs per sostenere lo sforzo di AFIRM II, con il Premio n. W81XWH-13-2-0054. L'US Army Medical acquisizione attività di ricerca, 820 Chandler Street, Fort Detrick, MD 21702-5014 è l'ufficio di acquisizione di aggiudicazione e amministrazione. Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle dell'autore e non sono necessariamente approvati dal dipartimento della difesa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diamond wheel | Dremel | 545 | |
| Hypodermic needle (19G) | Fisher Scientific | 14-840-98 | Other needle sizes could be used, depending on experimental needs |
| Stone wheel | Dremel | 540 | |
| Syringe (20mL with luer lock) | Fisher Scientific | 22-124-967 | |
| Suction adapter | Tulip Medical | PA20BD | Optional, for high volume harvesting |
| Suction canister | Fisher Scientific | 19-898-212 | Optional, for high volume harvesting. Sterilize before use. |
| Suction tubing | Medline | DYND50216H | Optional, for high volume harvesting |
References
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