조직 Microcolumns 수확 용

Summary

우리가 생산 하는 수확에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기 전체 간격 피부 조직 기증자를 유발 하지 않고 수집 하는 데 사용할 수 있는 바늘 흉터 사이트. 바늘 대량 수확을 달성 하는 간단한 컬렉션 시스템 결합 될 수 있다.

Abstract

이 원고는 전체 두께 피부 조직의 microcolumns를 수집 하는 데 사용할 수 있습니다 상용 구성 요소에서 만든 실험실 기구에 대 한 생산 과정을 설명 합니다. 작은 크기는 microcolumns의 수 기증자 기증자 사이트 전체 두께 조직 활성화 피부 조직의 포함 하 여 모든 세포와 세포 외 구성 요소의 관련을 수확 하면서 흉터를 유발 하지 않고 신속 하 게 치료 하는 사이트 깊은 피부 지역와 부속 피부 구조는 기존의 조직 공학 기법을 사용 하 여 성공적으로 복제를 아직 있다. microcolumns을 치료, 보강 피부 상처에 직접 적용 될 수 있다 또는 다른 조직 공학 접근에 대 한 헌 세포/조직 소스로 사용할 수 있습니다. 수확 바늘 표준 피하 주사 바늘, 수정 하 여 만들어진 고 수확 하는 적은 양의 조직에 대 한 단독 사용 하거나 간단한 흡입 기반 컬렉션 시스템 (또한 일반적으로 사용 가능한 실험실에서 만든)을 함께 수 있습니다. 높은-볼륨에서 큰 동물 모델 연구를 촉진 하기 위하여 수확.

Introduction

자가 피부 이식 상처 복구의 주류 이지만 그것은 기증자 사이트 부족 및 병 적 상태, 기존의 피부 이식^{1,2 대체 하는 새로운 치료 옵션을 개발 하 최근 몇 십년 간에서 공동된 노력을 선도 의해 제한} . 우리는 최근 기증자 사이트 사망률을 최소화 하면서 전체 간격 피부 이식의 혜택을 활용 하는 피부를 수확의 다른 방법 개발. 소형 (~0.5 m m 직경) "microcolumns"의 형태로 전체 간격 피부 수집, 기증자 사이트 신속 하 고 정상적인 상황에서 흉터 없이 치유 수 있습니다 (잠재적인 예외 아래 토론 섹션 참조)³. Microcolumns 가속 상처 폐쇄, 수축³, 줄이고 상처 침대에 직접 적용할 수 있으며 다양 한 표 피 및 피부 세포 유형 및 기능 부속 구조⁴에서 결여 되는 많은 복원 기존의 분할 간격 피부 이식 또는 현재 bioengineered 피부 대체⁵. 치유 증가 시키기 위해 microcolumns의 능력과 그들의 기증자 사이트 흉터 없이 치료 하는 둘 다 독립적으로 유효성이 검증 되지 다른 연구 그룹^6,7.

우리는 이전 규모⁸; microcolumns 컬렉션을 사용 하기 실험실 수확 시스템 개발 그러나,이 시스템은 널리 사용할 수 있는 여러 사용자 지정된 구성 요소 구성 된다. 여기, 우리가 자세히 설명 과정에서 주로 상용 구성 요소, 대량 수확을 달성 하는 데 사용할 수 있습니다 만든 간단한 컬렉션 시스템, 뿐만 아니라 바늘, 수확 생산. 이 원고에 설명 된 장치는 적합 한 시험관 및 동물 작업, 그러나 인 간에 있는 사용. 인 간에 있는이 기술을 적용 하기 위한 임상 장치 FDA 허가를 상업적으로 사용할 수 있지만 여기에서 다루지 않습니다.

Protocol

모든 작업 관련 된 살아있는 동물 그리고 동물 조직 샘플 매사추세츠 일반 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. 바늘의 생산

1. 생산 단계의 설정
   1. 게시물에 여성 luer 잠금 커넥터 연결 하 고는 luer 잠금 (그림 1A) 무대의 중앙에 회전 무대에 게시물을 탑재.
   2. 이 첫 번째 회전 무대를 세로로 놓고 수직으로 (그림 1B) 두 번째, 수평 회전 단계에 그것을 마운트.
   3. 2-축 번역 단계 (그림 1B)에 수평 회전 무대를 탑재 합니다.
   4. 광학 브레드보드 등 안정적인 표면 결합 고정.
   5. 별도로 회전/번역 조합 단계 (그림 1C)에 병렬로 브레드보드와 luer 잠금 커넥터와 대략 같은 높이에 위치 하는 도구와 같은 브레드보드 회전 도구를 탑재 합니다.
   6. 회전 도구 (더 작은, 낮은 모래 다이아몬드 컷 바퀴 더 큰, 더 높은 모래 돌 잘라 바퀴 위에)에 동심 두 잘라 바퀴를 설치 (그림 1D).
      참고: 9 m m에 대 한 두 바퀴의 직경 차이 일반적으로 충분 한.
   7. 가벼운 오버 헤드가 절단 바퀴를 겨냥 하는 빛과 회전 도구를 통해 조정 가능한 팔으로 소스 위치입니다.
   8. 을 강화 하기 위해 시각화를 놓고 해 현미경 생산 설치 되도록 접 안 렌즈 (그림 1C) 절단 디스크에 초점을 맞추고.
      참고: 또는 사용자가 입을 수 있습니다 돋보기 안경.
2. 바늘 팁의 모양 변경
   1. 보호 안경 및 눈 또는 항공에서 미세 금속 입자를 방지 하기 위해 수술 용 마스크를 착용 하십시오.
   2. 피하 주사 바늘의 적절 한 측정 실험 요구 사항에 따라 크기를 선택 합니다.
   3. 각 수확 바늘에 원하는 길이를 표시 합니다.
      참고: 돼지 피부에서 수확에 대 한 8 m m 바늘은 일반적으로 충분 한; 길이 다를 수 있지만 실험 요구에 따라 (예., 대상 피부 조직, 바늘 게이지 크기의 두께). 일반적으로, 19-게이지 바늘은 돼지 피부.
   4. 낮은 회전 도구, 파워와 수직으로 바늘을 바늘의 초과 길이 잘라 외부 절단 디스크의 가장자리를 사용 하 여 지점에서 표시 1.2.3 단계에서.
   5. 생산 단계에 단축, 무딘 바늘 여성 luer 잠금 커넥터에 연결 합니다.
   6. 바늘은 12 ° 각도 절단 디스크에 평행 하 게 회전 도구 (변경 각도 바늘 삽입에 필요한 힘에 영향을 줄 것 이다)에 수평 회전 무대를 조정 합니다.
   7. 오버 헤드 라이트를 켜고 빛 바늘의 중간 (세로) 떨어져 반영 될 때까지 확대, 아래 바늘을 관찰 하는 동안 그것의 위치를 조정.
   8. 내부 (다이아몬드) 디스크 (그림 2A) 절단으로 바늘을 회전 도구를 다음 번역 단계를 사용 하 여 전원.
   9. 절단 디스크 (로 오버 헤드 라이트의 반사는 중간 선 따라 시각) 바늘의 약 중간에 도달할 때까지 천천히 절단 디스크에 대 한 바늘을 전진 계속.
   10. 서서히 미세한 폴란드어 (그림 2B)으로 잘라 바늘 표면 마무리 외부 돌 바퀴에 내부 다이아몬드 바퀴에서 컷된 바늘 표면을 이동 합니다.
   11. 절단 디스크에서 바늘을 철회.
   12. 수직 회전 무대를 사용 하 여 바늘 180 ° 회전 합니다.
   13. 바늘의 다른 측면의 모양을 변경 하려면 단계 1.2.9-1.2.10를 반복 합니다.
       참고: 바늘 지금 약 길이 (그림 2C 및 2D)의 두 절단 팁을 가져야 한다.
   14. 생산 단계에서 바늘을 제거 합니다.
   15. 깨끗 한 내부 바늘의 내경 보다 약간 작은 금속 와이어로 낳았다.
   16. 날카로운 나무 막대기를 사용 하 여 (예., 목화 제보 주걱에 작은 나무 막대기의 끝에서 스냅 여), 새로 형성 된 바늘의 가장자리에 아직도 붙어 있을지도 모른다 어떤 털 제거.
       참고: 수확 바늘 전해 수 있으며 필요한 경우 압력솥에 의해 소독.

2. 피부 조직 수확

1. 수확 바늘을 사용 하 여 비보 전 조직이 나 살아있는 동물에서 스킨 microcolumns를 수집.
2. Ex vivo 피부에 대 한 (특히 샘플에서 피하 지방 누락 되거나 멀리 손질 했다), 얇은 조직 대상 조직 50 mL 원심 분리기 튜브의 개통에 또는 서로의 위에, n의 손상을 방지 하려면 조직의 두 가지 스택 eedle 팁 하드 표면에 대하여 그들을 쳐서입니다.
   참고: vivo에서 살아있는 동물에서 수확에 대 한 로컬 lidocaine과 피 네 프 린 진통 및 출혈을 줄이기 위해 피부 주입에 의해 관리 될 것이 좋습니다.
3. 아래 설명 된 대로 필요, microcolumns의 양에 따라 수확 기구를 조립 한다.
4. 낮은 중간 볼륨 옵션:
   1. Microcolumns의 중간 금액을 작은 수확, 단순히 표준 주사기 작성 (10-20 mL 주사기는 일반적으로 잘 작동) 일반적인 염 분으로 수확 바늘에 연결.
   2. 완전히 기증자 피부에 수확 바늘을 삽입 한 다음 그것을 철회.
   3. 수확 바늘을 통해 염 분을 제거 하 고 바늘 구멍에 박 혀 microcolumn 추방에 주사기의 피스톤을 눌러.
   4. 수확 과정을 속도를, 반복 단계 2.4.2 3 ~ 5 번 단계 2.4.3에서에서 microcolumns를 추방 하기 전에 합니다.
      참고: 일반적으로 microcolumns의 후속 컬렉션을 쉽게 하기 위해 표준 셀 스 트레이너에 있는 microcolumns를 추방 하는 편리 하다.
   5. 바늘 막힌 될 경우 추방 걸린된 조직 덩어리를 제거 하는 피스톤에 압력을 증가. 간단 하 게 증가 하는 압력 충분 하지 않으면, 삽입 바늘에 덩어리를 바늘 팁 개방을 통해 금속 와이어 낳았다.
   6. 계속에 빠져들 microcolumns 염 분 또는 중간까지 건조를 방지 하기 위해 사용.
      참고: 숙련 된 연산자, 위에서 설명한 방법은 초당 약 1 microcolumn의 속도로 microcolumns 수확 사용할 수 있습니다.
5. 높은 볼륨 옵션:
   1. 많은 양의 microcolumns의 컬렉션을 촉진 하기 위하여 건설 될 수 있는 간단한 흡입 기반 장치를 만듭니다.
      참고: 장치 수확 바늘, 20 mL 주사기 luer 잠금 노즐, 흡입 (그림 3A), 및 살 균 흡입 용기에 일반적으로 사용 하는 흡입 어댑터와 함께 구성 되어 있습니다.
   2. 20 mL 주사기에서 플런저를 제거 합니다.
   3. 주사기 흡입 어댑터에 연결 합니다.
   4. 수확 바늘 주사기 (그림 3B)에 연결 하 여 어셈블리를 완료 합니다.
   5. 살 균 흡입 배관의 일부를 사용 하 여 살 균 흡입 용기에 흡입 어댑터를 연결 하. 수확 기구 수 유체 흐름 (유출 보다는 유입에 대 한 표시 된 용기 포트 연결을 해야 합니다)이 한 시 빨리 벗어나게 하는 용기에는 용기 입력에 연결 되어 있는지 확인 합니다.
   6. 부정적인 압력 소스에 장치를 연결 합니다.
      참고: 필요한 압력 앞에서 설명한⁸로 하는 바늘 직경 및 길이에 따라 다릅니다. 이 원고에 설명 된 장치에 대 한 일반적인 수술 실에 흡입 시스템은 일반적으로 충분 합니다.
   7. 수확 바늘 주사기를 연결 합니다.
   8. 추수는 수확을 삽입 하 여 microcolumns 피부에 바늘.
      참고: microcolumns는 주사기로 흡입, 이끌려 다음 흡입 용기에 플러시 될 것입니다.
   9. 시스템을 플러시 수확 절차 동안 수확 바늘 메 마른 염 분의 용기에 간헐적으로 찍어.
      참고:이 분 플러시는 microcolumn의 수송을 용이 하 게 하 고 그들은 수 화 된 유지 되도록 합니다. 또는, MFF luer 어댑터 luer 잠금 주사기, 그리고 매달려 염 분 드립 부 대에 또한 연결 튜브를 통해에 연결할 수 있습니다.
   10. 계속 손에서 금속 와이어 또는 작은 수확 바늘의 내경 보다 약간 작은 바늘 계기. 바늘 막힌 된다, 바늘 구멍에 금속 와이어를 삽입 하 여 지울 수 있습니다.
   11. 때 microcolumns 원하는 양의 용기에 축적, 흡입에서 장치를 분리 한 후는 microcolumns를 수집 하는 필터를 통해 밖으로 흡입 용기의 내용을 붓는 다.
6. 수확 후 기증자 사이트에 국 소 항생제 연 고를 적용 합니다.
   참고: 추가 드레싱 일반적으로 필요 하지 않습니다 기증자 사이트.

Representative Results

수확 바늘 microcolumns 약 80-90% 성공 속도, 전체 두께 피부 조직의 수집 수 그리고 각 microcolumn 표 피, 진 피, 그리고 피하 지방을 (그림 4)를 포함 해야 합니다. 수확의 성공률은 낮은, 또는 조직에 바늘을 삽입 하기 어려워진 경우 새로운 바늘 가능성이 필요 하다. 수확에 대 한 성공률도 새 바늘으로 일관 되 게 낮은 경우 바늘 너무 짧은 아마 있습니다.

Vivo에서사용 하는 경우 다시 epithelialization는 일반적으로 몇 일³이내 발생 기증자 사이트는 신속 하 게 치료 한다. Microcolumns^3,4, 치유 하는 상처를 증가 시키기 위해 침대 상처에 직접 적용할 수 있습니다 또는 그들이 다른 매트릭스 재료 조합 구조를 생산 하기 위해 결합 될 수 있습니다. Microcolumns는 또한 생체 외에서 연구⁹문화에 유지할 수 있습니다.

그림 1 : 바늘 만드는 기구. (A)는 남성 luer 잠금 커넥터는 luer 잠금 무대의 중심에 수직으로 배치 회전 무대에 장착 포스트를 통해 확보. (B) 수직 회전 무대는 두 번째, 수평 회전 무대 (검은색 화살표)에 수직으로 장착 됩니다. 수평 회전 단계 2-축 번역 단계 (흰색 화살표)에 확보 된다. (C) 회전 도구 브레드보드 (흰색 화살표), 그리고 바늘 만드는 장치 (빨간색 화살표)을 통해 해 현미경에 평행의 위치. (D) 동심 잘라 바퀴 회전 도구를 내부에 다이아몬드 휠에 장착 (검은색 화살표)과 외부에 돌 바퀴 (흰색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 원하는 길이로 바늘을 절단 후 회전 도구 새로운 바늘 팁을 사용 됩니다. (A) 먼저, 다이아몬드 절단 바퀴 새로운 절단 팁 및 표면 형성을 "거친" 상처를 확인 하는 데 사용 됩니다. (B) 후 새로운 절단 팁은 다이아몬드 휠, 바늘을 잘 연마 돌 바퀴에 이동 됩니다. (C) 측면에서 본 전면 및 (D)에서 바늘을 수확 완료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 대량 수확에 대 한 어셈블리. (A) 개별 구성 요소 (왼쪽에서 오른쪽)를 포함 하 여 어셈블리의 흡입 어댑터, 20 mL 주사기 luer 잠금 노즐, 및 수확 바늘. (B) 표시 하는 것은 부정적인 압력 소스에 연결할 준비가 완료 된 어셈블리입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 :이 원고에 설명 된 장치를 사용 하 여 수확 하는 대표적인 피부 microcolumns. 각 microcolumn 표 피 (1), 전체 진 피 (2), 그리고 일부 피하 지방 (3)에 포함 되어 있습니다. 그림에서 표시가 1 밀리미터를 나타냅니다. 이 그림은 탐 외에서 수정 되었습니다. ⁴ 해당 크리에이 티브 커먼즈 라이센스의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

여기에 설명 된 방법은 비보에 큰 동물 연구, 상용 실험실에서 만든 도구를 사용 하 여 충분 한 수량에 조직 microcolumns 컬렉션을 사용 하기 위한 것입니다. 이 장치는 이전 조직 삭제 인간의 피부^4,9 라이브 돼지 피부³에서 수확에 사용 되었습니다. 설명 하는 특정 매개 변수는 돼지에 사용 하기 위해 가장 적합 하는 것을 발견 했다. 그것은 같은 장치를 수정 및 설치류와 다른 작은 동물에서 수집 하는 조직에 대 한 적응 수 있습니다 하지만이 우리의 실험실에서 테스트 되지 않았습니다으로 예상 된다.

이 프로토콜의 중요 한 단계 수확 바늘은 충분 한 길이 (비효율적인 수확은 일반적으로 너무 짧은 되 고 바늘 때문)의 보장, 방지 하기 위해 수확 과정을 통해 액체에서 침수는 microcolumns를 유지 건조, 그리고 적어도 일시적으로 식 염 수와 시스템을 플러시 (그렇지 않으면 microcolumns 바늘 구멍 막힘의 더 높은 가능성은). 이 기술의 주요 한계는 속도; 예를 들어 우리의 데모에서 흡입 보조 기구 수 일반적으로 수확 조직의 일반적으로 동물 실험에서 사용 하는 작은 상처 크기에 대 한 충분 한 분당 120 밀리 그램. 그것은 가능성이 매우 큰 상처에 대 한이 접근을 사용 하는 물류 도전 것 (예., 주요 화상 부상 모델). 바늘 계기는 또 다른 한계-작은 바늘 계기, 더 취약 그것은 변형, 하는이 기술은의 주요 실패 모드 (반면, 기술은 상대적으로에 과민 하지 않다 절차 동안 dulling 바늘). 돼지 피부, 우리는 일반적으로 기계적으로 강력한 충분히 그들은 거의 버클은 19-게이지 바늘을 사용 합니다. 또한, 각 동물 실험 (일반적으로 대 한 관련 된 3000-5000 microcolumns) 일반적으로 2-3 바늘을 요구 한다. 25-게이지 우리는이 기술을 사용 하는 작은 바늘 크기가입니다.

조직 재생을 자극 하는 작은 피부 상처의 능력¹² 및 장점¹³를 재포장 하는 분수 레이저 등 임상 절차의 뒤에 기본 원리 이다. 이러한 치료는 알려진 photoaged 피부, 화장품 모양을 개선 하 고 더 최근에, 개장 하는 흉터를 유발 하 고 기능을 향상을 표시 cosmesis 피부의 흉터^14,15. 이 기술로 광범위 한 임상 경험 또한 제공 한다 추가 피부는 대부분의 경우, 특정 예외에 이러한 microinjuries 후 흉터 없이 치료 할 수 있는 유효성 검사 (있다 재포장 하는 분수 레이저는 거의 항상 감염¹⁶, 포스트 절차 피부 관리의 중요성을 강조 결과로 흉터의 3.8% 발생). 또한, hypertrophic 흉터 또는 켈 로이드의 역사를 가진 사람 수 있습니다 이러한 작은 부상;으로 흉터 따라서, 치료와 관련 된 microinjuries의 생산을 counterindicated 수 있습니다.

우리의 이전 조사는 직접 피부 상처 치유, 다른 원인이 없이 조직의 상당수를 수집 하는 능력을 향상 시키기 위해에 microcolumns을 적용에 초점을 맞춘 반면 장기 기증자 사이트 morbidities (흉터, contracture, 등) 수 있습니다. 다른 응용 프로그램의 광범위 한 범위에 유용할. 피부 microcolumns 문화 확장 또는 분리와 헌 피부 세포¹⁰의 분산을 포함 하는 방법에 대 한 조직 소스 역할을 수 있습니다. 또한, 기증자 사이트 사망률 최소화의 추가 혜택을 제공 하는 microcolumns 및 부속 구조와의 더 깊은 부분에 있는 다양 한 줄기/시 조 세포 인구와 관련 된 피부 세포 유형, 등을 포함 하 여는 진 피¹¹ (이 시작 물자로 분할 두께 피부를 활용 하는 전통적인 방법으로 사용할 수 없습니다). 있으 나 헌 microcolumns 마약 등 다양 한 자극에 조직 반응을 하 비보 전 분석 실험에도 사용할 수 있습니다 또는 기존과 달리, 화장품 셀 문화 기반 분석, 각 세포와 extracellular 구조 microcolumn는 그들의 각각 자연 조직 형태로 유지 됩니다. 더 일반적으로, microcolumn 접근을 수확 작은 기증자의 기본 원칙으로 헌 세포와 조직 (피부 및 다른 기관)에 대 한 다양 한 조직 공학/재생 의학 목적을 위해 제공에 광범위 하 게 적용할 수도 있습니다. 완전 하 고 scarless 치유 받고 상처 다른 조직 형식으로 일반화할 수 것입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diamond wheel	Dremel	545
Hypodermic needle (19G)	Fisher Scientific	14-840-98	Other needle sizes could be used, depending on experimental needs
Stone wheel	Dremel	540
Syringe (20mL with luer lock)	Fisher Scientific	22-124-967
Suction adapter	Tulip Medical	PA20BD	Optional, for high volume harvesting
Suction canister	Fisher Scientific	19-898-212	Optional, for high volume harvesting. Sterilize before use.
Suction tubing	Medline	DYND50216H	Optional, for high volume harvesting