Summary
Здесь мы описываем протокол для производства сбора игл, которые могут использоваться для сбора полной Толщина кожной ткани не вызывая доноров сайт рубцов. Иглы могут быть объединены с простой сбор системой обеспечения большого объема заготовки.
Abstract
Эта рукопись описывает процесс производства для Ступка, сделанные из готовых компонентов, которые могут быть использованы для сбора microcolumns полный Толщина кожной ткани. Маленький размер microcolumns позволяет доноров сайтов быстро излечить не вызывая донора сайта рубцов, во время уборки полный толщина ткани позволяет включение всех компонентов клеточной и внеклеточной ткани кожи, включая те, которые связаны с глубокий дермальный регионов и придатков кожи структур, который предстоит успешно быть воспроизведены с помощью обычных тканей, инженерной техники. Microcolumns может применяться непосредственно в раны кожи увеличить исцеления, или они могут использоваться в качестве источника аутологичных клеток/тканей для других тканей инженерных подходов. Заготовка иглы изготовлены, изменяя стандартные иглы, и они могут быть использованы только для уборки небольших количествах ткани или в сочетании с системой простой коллекции на основе всасывания (также сделаны из общедоступных лабораторных принадлежностей) высокий объем заготовки для облегчения исследования в крупных животных моделях.
Introduction
Аутологичной пересадке кожи является основой ремонта раны, но она ограничена доноров сайт дефицита и заболеваемости, приводит к согласованным усилиям в последние десятилетия для разработки новых терапевтических вариантов для замены обычных пересадки кожи1,2 . Мы недавно разработали альтернативный метод уборки кожу, чтобы использовать преимущества полного толщина пересадки кожи при сведении к минимуму доноров сайте заболеваемости. Собирая полный толщина кожи в виде небольших (~0.5 мм диаметром) «microcolumns», доноров сайты способны исцелять быстро и без рубцов при нормальных обстоятельствах (возможных исключений, см. в разделе обсуждение ниже)3. Microcolumns может применяться непосредственно в рану кровати ускорить закрытие раны, уменьшить сокращение3и восстановить широкий спектр типов клеток эпидермиса и дермы и функциональных структур придаточных4, многие из которых хватает в обычные Сплит толщина пересадки кожи или заменителей кожи текущего биоинженерных5. Способность microcolumns увеличить исцеления и их доноров сайтов исцелять без рубцов оба были независимо проверены других исследовательских групп6,7.
Ранее мы разработали систему уборки лаборатории для включения в коллекцию microcolumns на шкале8; Однако эта система состоит из многих настраиваемых компонентов, которые не являются широко доступными. Здесь мы подробно описать этот процесс для производства уборки иглы, а также простой коллекции системы, сделанные из основном готовых компонентов, которые могут использоваться для обеспечения большого объема заготовки. Аппарат, описанные в этой рукописи подходит для in vitro и животных работы, но не для использования в организме человека. Клиническое устройство с FDA Распродажа для применения этой техники в организме человека коммерчески доступных, но не будет обсуждаться подробно здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все работы с участием живых животных и образцы тканей животных были одобрены Массачусетс общее стационарное лечение для институциональных животных и использование Комитет (IACUC).
1. производство заготовки иглы
- Установка на стадии производства
- Безопасный соединитель женского luer блокировки на должность и смонтировать пост на этап вращения, так что люэровского находится в центре сцены (рис. 1А).
- Установите этот первый этап вращения вертикально и смонтировать его перпендикулярно на сцену во-вторых, Горизонтальное вращение (рис. 1Б).
- Смонтируйте горизонтального вращения этапе на этап 2 оси вращения (рис. 1Б).
- Закрепите сочетание на стабильную поверхность, например оптических макет.
- Отдельно смонтируйте роторный инструмент на же макет, с помощью инструмента расположены параллельно с макета и на приблизительно той же высоте, как luer lock разъем на сцене комбинацию вращения/перевод (рис. 1C).
- Установка двух отрезных дисков концентрически на роторный инструмент (меньше, Нижняя песок алмазный отрезной над больше, выше песка каменной отрезной) (рис. 1D).
Примечание: Около 9 мм разница между диаметрами двух колес обычно достаточно. - Позиция, накладные света источника с регулируемым рычагом над роторный инструмент, светом, направленных на отрезные круги.
- Для улучшения визуализации, расположите микроскопом рассечения над производственной установки окуляра ориентирован на отрезные (рис. 1C).
Примечание: Кроме того, пользователи могут носить увеличительное очки.
- Реорганизация кончик иглы
- Надевайте защитные очки и хирургические маски для предотвращения проникновения в глаза или дыхательные пути мелкие металлические частицы.
- Выберите иглы соответствующего калибровочных размер, на основе экспериментальных требований.
- Марк от предполагаемой длины на каждой уборки иглы.
Примечание: Для сбора урожая из свиной кожи, иглы 8 мм, обычно достаточно; Хотя, может изменяться длина на основе экспериментальных потребностей (например., толщина целевой кожной ткани, Размер колеи иглы). Как правило 19-иглы работает хорошо для свиной кожи. - Ниже иглы перпендикулярно к роторный инструмент с властью, с использованием края наружной отрезного диска срезать избыток длину иглы, в точке отмечен на шаге 1.2.3.
- Соедините укороченные, тупой иглой с женской luer блокировки на стадии производства.
- Отрегулируйте Горизонтальное вращение стадии, так что иглу под углом 12° параллельно отрезные диски на роторный инструмент (изменив угол повлияет на силу, необходимые для иглы).
- Включите свет накладные и скорректировать свою позицию при соблюдении иглы под увеличением, до тех пор, пока свет отражается от срединной (продольная) иглы.
- Мощность на роторный инструмент, а затем использовать стадии перевода для продвижения иглы к внутренней (алмаз) резки диск (рисA).
- Держать продвижения иглы медленно против отрезного диска, пока режущий диск достигнет примерно midline иглы (как визуальное отражение накладных света вдоль средней линии).
- Медленно перемещайте поверхности среза иглы от внутренней алмазного режущего диска на внешний каменной колесо отделать поверхность среза иглы с тоньше лак (рис. 2B).
- Убрать иглы от режущего диска.
- Использование вертикального вращения этапе, поверните иглу 180°.
- Повторите шаги 1.2.9-1.2.10 чтобы изменить другой стороне иглы.
Примечание: Иглы должны теперь иметь два резки советы приблизительно одинаковой длины (рис. 2 c и 2D). - Удалите иглу из стадии производства.
- Чистый внутренний родила с металлической проволокой, немного меньше, чем внутренний диаметр иглы.
- Используя острый деревянной палочкой (например., путем привязки от конца небольшой деревянной палочкой на аппликатор отзыв хлопок), удалите заусенцы, которые могут по-прежнему привязаны к краям новообразованной иглы.
Примечание: Заготовка иглы могут быть электрополированной и стерилизации в автоклаве при необходимости.
2. кожа ткань уборка
- Используйте уборочной иглы для сбора microcolumns кожи от живых животных или ex vivo ткани.
- Для ex vivo кожи ткани, тонкие (особенно от образцов где подкожный жир отсутствует или был отделан прочь), держать ткани-мишени над отверстием 50 мл пластиковых пробирок, или стек две части ткани поверх друг друга, чтобы избежать повреждения n Советы eedle, ударяя их против твердых поверхностей.
Примечание: Для в естественных условиях сбора урожая от живых животных, рекомендуется, что местные лидокаина и адреналина управляться внутрикожные инъекции для обезболивания и уменьшить кровотечение. - Соберите уборочной аппарат по количеству microcolumns необходимости, как описано ниже.
- Низкий средний объем вариант:
- Для уборки малых и средних объемов microcolumns, просто заполните Стандартный шприц (10-20 мл шприцы обычно работают хорошо) с физиологическим и подключить его к уборочной иглы.
- Полностью вставьте уборочной иглы в кожу доноров, а затем убрать его.
- Нажмите на поршень шприца для сброса физиологического раствора через уборочной иглу и высылать microcolumn, который подал в отверстие иглы.
- Чтобы ускорить процесс сбора урожая, повторите шаг 2.4.2 3 до 5 раз до высылки microcolumns шаге 2.4.3.
Примечание: Это обычно удобно высылать microcolumns в стандартной ячейки сито, чтобы облегчить последующие коллекции microcolumns. - Если иглы засоряются, усилить давление на поршень высылать застрял ткани и удалить засорить. Если недостаточно просто увеличение давления, родила вставить металлический провод через отверстие кончик иглы для очистки забивать в иглу.
- Держите microcolumns, погруженной в соленой или средней до использования для предотвращения высыхания.
Примечание: С опытным оператором, метод, описанный выше может использоваться для сбора microcolumns со скоростью примерно 1 microcolumn в секунду.
- Высокий объем вариант:
- Создайте простое устройство всасывания содействие, которое могут быть построены для облегчения сбора большого количества microcolumns.
Примечание: Устройство состоит из уборочной иглы, 20 мл шприц с luer блокировки сопла, всасывающий адаптер, обычно используется для липосакция (рисA) и стерильные всасывающий фильтр. - Выньте поршень из 20 мл шприц.
- Прикрепите шприц всасывания адаптер.
- Завершите Ассамблея, придавая уборочной иглой шприца (рис. 3B).
- Используйте кусок стерильной всасывающей трубы для подключения всасывания адаптер к стерильным всасывания канистру. Убедитесь, что заготовка аппарат подключен к канистре ввода, что позволяет жидкости течь в канистру беспрепятственный (что может потребоваться подключение к порту канистру, который помечен для оттока, вместо того, чтобы приток).
- Подключите аппарат к источнику отрицательное давление.
Примечание: Давление, необходимое зависит от иглы диаметром и длиной, как описано выше8. Для аппарат, описанные в этой рукописи как правило, достаточно вытяжки в типичных операционных залов. - Подключите уборочной иглой шприца.
- Урожай microcolumns, вставив уборочной иглы в кожу.
Примечание: Microcolumns будет обращено в шприц всасывания, а затем промыть в всасывания канистру. - Периодически окуните уборочной иглу в контейнер стерильного физиологического раствора во время уборочной процедуры для сброса системы.
Примечание: Это физиологический флеш облегчает транспорт microcolumn и гарантирует, что они остаться гидратированный. MFF luer адаптер может быть подключен к ресиверу люэровского шприца и через соединения труб, также висит сумка физиологическим капельного. - Держите под рукой металлической проволокой, или меньше манометра, что немного меньше, чем внутренний диаметр уборочной иглы. Если игла засоряется, его можно очистить, вставив металлический провод в отверстие иглы.
- Когда нужное количество microcolumns накопили в канистру, отключите устройство от всасывания, а затем вылить содержимое всасывающий фильтр, через фильтр для сбора microcolumns.
- Создайте простое устройство всасывания содействие, которое могут быть построены для облегчения сбора большого количества microcolumns.
- После сбора урожая, применить актуальных мазь с антибиотиком над сайтами доноров.
Примечание: Дополнительные перевязочные материалы, как правило, не требуется для сайтов доноров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Заготовка иглы должны быть в состоянии собрать microcolumns полный Толщина кожной ткани с примерно 80-90% успеха, и каждый microcolumn должен содержать эпидермиса, дермы и некоторые подкожного жира (рис. 4). Если уровень успеха уборки является низким, или если она становится трудно вставлять иголку в ткань, Новая игла скорее всего необходима. Если показатель успеха для уборки неизменно низкими, даже с новой иглы, затем иглы, вероятно, слишком коротким.
Если используется в vivo, сайты доноры должны заживают быстро, как эпителизация обычно происходит в течение нескольких дней3. Microcolumns могут быть применены непосредственно к ране кровати для увеличения заживления3,4, или они могут сочетаться с различными матрица материалы для производства сочетание конструкций. Microcolumns также могут поддерживаться в культуре in vitro исследования9.
Рисунок 1 : Иглы, делая аппарат. (A) мужской luer блокировки разъем обеспеченные через пост монтажа на сцену вертикально расположенных вращения, так что люэровского находится в центре сцены. (B вертикального вращения этапе устанавливается перпендикулярно на сцену во-вторых, Горизонтальное вращение (черная стрелка). Горизонтальное вращение этап крепится к этап 2 оси вращения (белая стрелка). (C) позиционирование роторный инструмент, параллельно макетов (белая стрелка) и рассечения Микроскоп над иглой Изготовление аппарата (красная стрелка). (D) концентрических отрезные смонтированы на роторный инструмент, с алмазные на внутренней (черная стрелка) и каменные колесо на внешней стороне (белая стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : После резки иглы до нужной длины, роторный инструмент используется для измельчения новые концы иглы. (A) во-первых алмазный отрезной используется для «грубой» отрубы сформировать новые советы резки и поверхностей. (B) после с алмазного режущего диска образуются новые советы резки, игла перемещается в каменных колесо для тонкой полировки. (C) Готовая заготовка иглы, смотреть спереди и (D) со стороны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Ассамблея для большого объема заготовки. (A) отдельных компонентов Ассамблеи, в том числе (слева направо) всасывающий адаптер, 20 мл шприц с luer lock сопла и уборки иглы. (B) показан завершенный Ассамблея, готовы для подключения к источнику отрицательное давление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Представитель кожи microcolumns собирают с помощью аппарата, описанные в этой рукописи. Каждый microcolumn содержит эпидермиса (1), полный дермы (2) и некоторые подкожного жира (3). Галочки на рисунке представляют 1 мм. Эта цифра была изменена от там и др. 4 в соответствии с условиями соответствующей лицензии creative commons. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные здесь методы предназначены для включения в коллекцию тканей microcolumns в достаточных количествах для в естественных условиях крупных исследований на животных, используя инструменты, изготовленные из коммерчески доступных лабораторных принадлежностей. Этот аппарат был использован ранее в уборке ткани от кожи подакцизным человека4,9 , а также живой свиной кожи3. Конкретные параметры являются те, которые были признаны наиболее подходит для использования в свиней. Ожидается, что же аппарата могут быть модифицировать и адаптировать для сбора ткани от грызунов и других мелких животных, но это не было протестировано в нашей лаборатории.
Важные шаги в этом протоколе включают обеспечение уборочной иглы имеют достаточную длину (неэффективность сбора обусловлено обычно иглы, будучи слишком коротким), сохраняя microcolumns погружать в жидкость на протяжении всего процесса уборки для предотвращения сушки и по крайней мере периодически Промывка системы с солевой раствор (в противном случае существует высокая вероятность засорения отверстия иглой microcolumns). Основным ограничением этой методики является скорость; например в этой демонстрации, при содействии всасывания аппарата можно обычно урожай 120 мг ткани в минуту, что является достаточным для небольших размеров раны, обычно используется в подопытных животных. Это, вероятно, будет технически сложным, чтобы использовать этот подход для очень больших ран (например., в крупных записать травмы модели). Датчик иглы-это еще одно ограничение - чем меньше датчик иглы, тем более восприимчивы это выпучивания, который является режимом главный провал этой техники (в отличие от этого, метод относительно нечувствительны к иглы, притупляя во время процедуры). Для свиной кожи мы обычно используем 19-датчик иглы, которые механически достаточно прочным, что они редко пряжкой. Кроме того, каждое животное эксперимент (обычно с участием о 3000-5000 microcolumns) обычно требует только 2-3 иглы. 25-го калибра — самый маленький размер иглы, которые мы использовали с этой техникой.
Мелких кожных ран способностью стимулировать регенерацию тканей является основополагающим принципом позади клинических процедур, таких как Фракционная лазерная шлифовка12 и microneedling13. Эти процедуры известны улучшить косметический внешний вид кожи photoaged и совсем недавно, показано побудить ремоделирования шрамов и улучшить функцию и дефекты кожи шрамы14,15. Обширный клинический опыт с этими методами также предоставляет дополнительные проверки, что кожа способна исцелять без рубцов после этих фисуры в подавляющем большинстве случаев, за некоторыми исключениями (дробных лазерной шлифовки сообщается 3.8% случаев рубцов, почти всегда в результате инфекции16, подчеркнув важность ухода за кожей после процедуры). Кроме того люди с историей келоидных рубцов или гипертрофические рубцы могут быть восприимчивы к рубцеванию даже с этих мелких травм; Таким образом процедур, связанных с производством фисуры может быть противопоказан.
Хотя наши предыдущие исследования были сосредоточены на непосредственное применение microcolumns в раны кожи для улучшения заживления, возможность собирать значительное количество ткани, не вызывая другие долгосрочной заболеваемости сайт доноров (рубцы, контрактуры и т.д.) могут быть полезным для широкого круга других приложений. Кожи microcolumns может служить в качестве источника ткани для подходов, включающих расширение культуры или диссоциации и дисперсия аутологичной кожи клетки10. Кроме того, microcolumns обеспечивают дополнительные преимущества минимизации доноров сайт заболеваемости и включая типы кожных клеток, например, связанные с придаточных структур и различных стволовых/прародитель клеточных популяций, которые находятся в более глубоких частях Дерма11 (которые не доступны с традиционными методами, которые используют Сплит толщина кожи как исходного материала). Аутологичные microcolumns может также использоваться в ex vivo анализов для изучения ткани ответ на различные стимулы, такие, как наркотики или косметических продуктов, в которых, в отличие от обычных ячеек на основе культуры анализов, клеточной и внеклеточной структур в каждом microcolumn поддерживаются в форматах их соответствующих природных Организации. Вообще microcolumn, уборки подход также может быть широко применяется для предоставления аутологичных клеток и тканей для различных целей инженерии/регенеративной медицины ткани (для кожи и других органов), как основной принцип малых доноров раны, проходящих полный и scarless исцеление, вероятно быть обобщению для других типов тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы – Сопредседатель изобретателей на патенты, касающиеся технологии, описанные в этой статье, от которого они получили лицензирования и роялти доходы через их учреждение, Massachusetts General Hospital. J. Tam также консультирует Medline Industries, Inc, которая содержит коммерческую лицензию для этой технологии.
Acknowledgments
Эта работа частично поддержали армии, ВМС, низ, военно-воздушных сил, VA и вопросам здравоохранения для поддержки усилий AFIRM II, под № премии W81XWH-13-2-0054. США армия медицинских исследований приобретение деятельность, 820 Чандлер Street, Форт Detrick, MD 21702-5014 является награждения и управляющие приобретения. Мнения, толкований, выводы и рекомендации являются мнениями автора и не обязательно одобрены министерством обороны.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diamond wheel | Dremel | 545 | |
| Hypodermic needle (19G) | Fisher Scientific | 14-840-98 | Other needle sizes could be used, depending on experimental needs |
| Stone wheel | Dremel | 540 | |
| Syringe (20mL with luer lock) | Fisher Scientific | 22-124-967 | |
| Suction adapter | Tulip Medical | PA20BD | Optional, for high volume harvesting |
| Suction canister | Fisher Scientific | 19-898-212 | Optional, for high volume harvesting. Sterilize before use. |
| Suction tubing | Medline | DYND50216H | Optional, for high volume harvesting |
References
- Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
- Singh, M., et al. Challenging the Conventional Therapy: Emerging Skin Graft Techniques for Wound Healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (4), 524-530 (2015).
- Tam, J., et al. Fractional Skin Harvesting: Autologous Skin Grafting without Donor-site Morbidity. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 1 (6), 47 (2013).
- Tam, J., et al. Reconstitution of full-thickness skin by microcolumn grafting. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (10), 2796-2805 (2017).
- Huang, C., et al. Regeneration of hair and other skin appendages: A microenvironment-centric view. Wound Repair and Regeneration. 24 (5), 759-766 (2016).
- Fernandes, J. R., et al.
- Rettinger, C. L., Fletcher, J. L., Carlsson, A. H., Chan, R. K. Accelerated epithelialization and improved wound healing metrics in porcine full-thickness wounds transplanted with full-thickness skin micrografts. Wound Repair and Regeneration. 25 (5), 816-827 (2017).
- Franco, W., et al. Fractional skin harvesting: device operational principles and deployment evaluation. Journal of Medical Devices. 8 (4), 041005 (2014).
- Rasmussen, C. A., et al. Chimeric autologous/allogeneic constructs for skin regeneration. Military Medicine. 179, 8 Suppl 71-78 (2014).
- Ter Horst, B., Chouhan, G., Moiemen, N. S., Grover, L. M. Advances in keratinocyte delivery in burn wound care. Advanced Drug Delivery Reviews. 123, 18-32 (2018).
- Wong, V. W., Levi, B., Rajadas, J., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Stem cell niches for skin regeneration. International Journal of Biomaterials. 2012, 926059 (2012).
- Manstein, D., Herron, G. S., Sink, R. K., Tanner, H., Anderson, R. R. Fractional photothermolysis: a new concept for cutaneous remodeling using microscopic patterns of thermal injury. Lasers in Surgery and Medicine. 34 (5), 426-438 (2004).
- Iriarte, C., Awosika, O., Rengifo-Pardo, M., Ehrlich, A.
- Anderson, R. R., et al. Laser treatment of traumatic scars with an emphasis on ablative fractional laser resurfacing: consensus report. Journal of the American Medical Association Dermatology. 150 (2), 187-193 (2014).
- Hogan, S., Velez, M. W., Ibrahim, O. Microneedling: a new approach for treating textural abnormalities and scars. Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery. 36 (4), 155-163 (2017).
- Manuskiatti, W., Fitzpatrick, R. E., Goldman, M. P. Long-term effectiveness and side effects of carbon dioxide laser resurfacing for photoaged facial skin. Journal of the American Academy of Dermatology. 40 (3), 401-411 (1999).
