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Engineering

अपवर्तन-सूचकांक-मिलान-बायोमेडिकल Microfluidics के लिए उपकरणों का निर्माण

doi: 10.3791/58296 Published: September 10, 2018

Summary

इस प्रोटोकॉल MY133 से microfluidic उपकरणों के निर्माण का वर्णन-V2000 कलाकृतियों कि अक्सर microchannels में microchannel संरचनाओं और एक जलीय समाधान के बीच बेमेल अपवर्तन सूचकांक के कारण पैदा को खत्म करने के लिए । इस प्रोटोकॉल एक एक्रिलिक धारक का उपयोग करता है encapsulated डिवाइस सेक, दोनों रासायनिक और यांत्रिक आसंजन में सुधार ।

Abstract

microfluidic उपकरणों का उपयोग जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक परिभाषित उपकरण के रूप में उभरा है । जब आधुनिक सूक्ष्म तकनीक के साथ संयुक्त, इन उपकरणों को एक साथ पूरक माप बनाने में सक्षम एक मजबूत मंच के हिस्से के रूप में कार्यान्वित किया जा सकता है. इन दो तकनीकों के संयोजन के द्वारा बनाई गई प्राथमिक चुनौती परंपरागत रूप से microfluidic उपकरणों बनाने के लिए इस्तेमाल किया सामग्री के बीच अपवर्तन सूचकांक में बेमेल है और जलीय आमतौर पर दवा में इस्तेमाल किया समाधान । इस बेमेल चैनल या डिवाइस किनारों के पास ऑप्टिकल कलाकृतियों बना सकते हैं । एक समाधान fluorinated बहुलक जैसे MY133-V2000 जिसका अपवर्तन सूचकांक पानी के समान है (n = १.३३) का उपयोग करके इस उपकरण के निर्माण के लिए प्रयुक्त सामग्री के अपवर्तन सूचकांक को कम करना है । यहां, एक microfluidic MY133 से बाहर कर दिया उपकरण के निर्माण नरम लिथोग्राफी तकनीकों का उपयोग कर V2000 का प्रदर्शन किया है, एक एक्रिलिक धारक के साथ संयोजन के रूप में ओ2 प्लाज्मा का उपयोग कर MY133-V2000 गढ़े उपकरण के बीच आसंजन में वृद्धि और polydimethylsiloxane (PDMS) सब्सट्रेट. डिवाइस तो यह 24 एच के लिए सेल संस्कृति मीडिया के साथ भरा एक ठेठ इमेजिंग प्रयोग के दौरान सेल संस्कृति की स्थिति बनाए रखने के लिए डिवाइस की क्षमता प्रदर्शित करने के लिए मशीन द्वारा परीक्षण किया है । अंत में, मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी (QPM) microchannel में लाइव अनुयाई कोशिकाओं के भीतर द्रव्यमान के वितरण को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस तरह, बढ़ी हुई परिशुद्धता, इस तरह के PDMS के रूप में पारंपरिक नरम लिथोग्राफी सामग्री के एवज में MY133-V2000 के रूप में अपवर्तन बहुलक के एक कम सूचकांक से डिवाइस गढ़े द्वारा सक्षम, प्रदर्शन किया है । कुल मिलाकर, microfluidic उपकरणों के निर्माण के लिए इस दृष्टिकोण को आसानी से मौजूदा नरम लिथोग्राफी कार्यप्रवाह में एकीकृत किया जा सकता है ताकि ऑप्टिकल कलाकृतियों को कम करने और माप परिशुद्धता बढ़ाने के लिए ।

Introduction

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microfluidic प्रौद्योगिकी के विकास के नए जैव चिकित्सा तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला है कि लाभ उठाने सूक्ष्म पैमाने पर प्रवाह के अद्वितीय भौतिकी1,2सक्षम है । यह नैदानिक microfluidic प्लेटफार्मों पर बनाया है कि चिकित्सकीय प्रासंगिक स्मार्क्स, सेल कठोरता3सहित, सतह मार्करों4, और विकास5शामिल हैं । एकल कोशिकाओं से छेड़छाड़ करके, microfluidic उपकरणों को भी, उदाहरण के लिए द्रोह6के एक संकेतक के रूप में, विविधता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । माइक्रोस्कोपी के साथ microfluidic अनुप्रयोगों गठबंधन करने की क्षमता आगे कई एक साथ7से अधिक मार्क्स उपाय है कि उपकरणों के लिए अनुमति देकर इन प्लेटफार्मों की उपयोगिता बढ़ गई है.

QPM एक सूक्ष्म तकनीक है कि चरण बदलाव के रूप में प्रकाश के माध्यम से गुजरता है और पारदर्शी नमूनों के अंदर इस मामले के साथ बातचीत के उपाय है । व्यक्तिगत कोशिकाओं के द्रव्यमान QPM माप से, अपवर्तन सूचकांक और बायोमास घनत्व8,9के बीच ज्ञात संबंध का उपयोग करके गणना की जा सकती है । पिछले काम से पता चला है कि QPM ऐसे सेल विकास के रूप में नैदानिक प्रासंगिक मानकों को मापने में सक्षम है10,11 और कोशिका विकार शक्ति12के माध्यम से यांत्रिक गुण । जब microfluidics के साथ संयुक्त, QPM संभावित इन विट्रो मेंएक उच्च नियंत्रित वातावरण में सेल व्यवहार को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । microfluidics के साथ QPM संयोजन का सामना करना पड़ रहा प्राथमिक चुनौतियों में से एक उच्च अपवर्तन सूचकांक सबसे पॉलिमर नरम लिथोग्राफी13के माध्यम से microfluidic चैनल का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया है ।

विभिन्न सूक्ष्म तकनीक के साथ microfluidics के संयोजन का सामना करना पड़ रहा एक महत्वपूर्ण चुनौती पानी के अपवर्तन सूचकांक के सापेक्ष उपकरण सामग्री के अपवर्तन सूचकांक के बीच बेमेल है14,15. यह पता करने के लिए एक विधि एक कम अपवर्तन सूचकांक बहुलक जैसे CYTOP16 या MY133-V200013के उपयोग के माध्यम से है । बाद एक fluorinated पराबैंगनी (यूवी)-इलाज acrylate बहुलक कि एक अपवर्तन सूचकांक पानी के समान है (n = १.३३) और है कि नरम लिथोग्राफी तकनीकों के साथ संगत है, कई स्थापित microfluidic में एक चिकनी एकीकरण के लिए अनुमति उपकरण निर्माण कार्यप्रवाह । यह microfluidic डिवाइस निर्माण के लिए MY133-V2000 ही उपयुक्त नहीं है, लेकिन यह भी आसानी से QPM और अन्य सूक्ष्म दृष्टिकोण के साथ संयुक्त होने की अनुमति देता है, दोनों कॉलोनी में और एक एकल सेल पैमाने पर सेल व्यवहार को मापने के लिए. MY133-V2000 प्रकाश पानी-MY133 इंटरफेस के माध्यम से गुजरता है के रूप में किसी भी, चरण बदलाव, थोड़ा उत्पादन द्वारा unwrappinging के कारण कलाकृतियों को समाप्त ।

अपवर्तन सूचकांक में बेमेल को नष्ट करने पर, fluorinated पॉलिमर से गढ़े गए उपकरणों से जुड़ी एक प्रमुख चुनौती, जैसे MY133-V2000, काँच या PDMS जैसे अन्य सामग्रियों का कम पालन है । वर्तमान काम नरम लिथोग्राफी का उपयोग कर एक MY133-V2000 microfluidic डिवाइस के निर्माण को दर्शाता है । एक कस्टम निर्मित एक्रिलिक धारक के साथ संयुक्त दोनों चैनल और PDMS सब्सट्रेट की सतह का इलाज करने के लिए हे2 प्लाज्मा का उपयोग सुनिश्चित करता है कि डिवाइस सब्सट्रेट करने का पालन करता है, एक सील चैनल बनाने. यह डिवाइस सेल कल्चर और QPM के लिए उपयुक्त है जो चैनल में कोशिकाओं के द्रव्यमान को मापने के लिए है, जो जीवित कोशिकाओं के विकास को मापने के लिए महत्वपूर्ण अनुप्रयोग है और कोशिका बायोमास के intracellular परिवहन, दोनों जिनमें से नैदानिक प्रासंगिकता नैदानिक है दवा और दवा की खोज ।

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Protocol

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1. Polydimethylsiloxane नकारात्मक का निर्माण

  1. polydimethylsiloxane की तैयारी
    1. PDMS सिलिकॉन elastomer और इलाज रिएजेंट के १.८ ग्राम के 18 जी उपाय । elastomer युक्त एक मापने नाव में इलाज एजेंट डालो ।
    2. मिश्रण elastomer और इलाज एजेंट जोरदार 1 मिनट के लिए और 30 मिनट के लिए एक निर्वात चैंबर में मिश्रण डाल दिया ।
    3. निर्वात से PDMS निकालें, नकारात्मक पर 15 जी डालना एक कुकी कटर का उपयोग (त्रिज्या = ३.८ सेमी) से PDMS रखने के लिए बंद की ओर चल रहा है, और शेष PDMS मिश्रण को कवर ।
    4. 10 मिनट के लिए निर्वात चैंबर में PDMS युक्त मोल्ड रखो ।
    5. निर्वात चैंबर से PDMS युक्त मोल्ड निकालें, यह ६० मिनट के लिए इलाज के लिए १५० ° c करने के लिए सेट एक गर्म थाली पर जगह है, और यह एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर ।
    6. एक औंधा गिलास पेट्री डिश पर शेष PDMS डालो (व्यास में 10 सेमी), एक मोल्ड के रूप में एक और कुकी कटर का उपयोग कर, PDMS के एक पैड बनाने के लिए । इस निर्वात चैंबर में डाल जब तक PDMS नकारात्मक पूरी तरह से ठीक हो गया है ।
    7. ६० मिनट के लिए १५० डिग्री सेल्सियस पर इलाज करने के लिए गरम गर्म थाली को वैक्यूम से PDMS के साथ पेट्री डिश स्थानांतरण ।
  2. polydimethylsiloxane के प्लाज्मा भूतल उपचार
    1. PDMS और कुकी कटर के नीचे एक तेज उस्तरा ब्लेड डालें और ध्यान से PDMS को नकारात्मक से दूर करें ।
    2. PDMS का बड़ा टुकड़ा से नकारात्मक कटौती करने के लिए एक तेज शौक चाकू का प्रयोग करें; यह पर्याप्त बफर क्षेत्र के साथ कटौती की जानी चाहिए नकारात्मक निरोधक के बिना इसके बारे में शीर्ष पर PDMS का एक टुकड़ा देते हैं ।
    3. पेट्री डिश से PDMS को सावधानीपूर्वक निकालने के लिए नेगेटिव के साथ ठीक PDMS के नीचे एक तेज रेजर ब्लेड डालें ।
    4. एक शौक चाकू का प्रयोग करें बाहर पैड कि नकारात्मक के लिए काट टुकड़ा के रूप में एक ही आकार है से PDMS का एक टुकड़ा काट । फिर, एक आयत में कटौती करने के लिए पर्याप्त कमरे के साथ PDMS के नए टुकड़े से बाहर यह microchannel के आसपास फिट जब यह नकारात्मक के शीर्ष पर रखा गया है ।
    5. PDMS के दोनों टुकड़े रखो (एक फ्लैट सब्सट्रेट पर नकारात्मक और आयत) (जैसे कांच, क्वार्ट्ज, polystyrene, या अंय सामग्री से बना स्लाइड के रूप में) और उंहें एक रेडियो आवृत्ति (आरएफ) प्लाज्मा क्लीनर में डालें । दरवाजा बंद करें और एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर हवा को खाली करके चैंबर सील । एक डिजिटल वैक्यूम दबाव नियंत्रक का उपयोग कर ४०० mTorr के दबाव के लिए हवा इंजेक्षन ।
      नोट: यदि प्लाज्मा सफाई के लिए इस्तेमाल सब्सट्रेट प्लाज्मा क्लीनर में इस्तेमाल नहीं किया गया है, यह प्लाज्मा क्लीनर में डाल ६० एस के लिए पहले नकारात्मक इलाज करने के लिए, आदेश में सब्सट्रेट करने के लिए चिपके से एक्रिलिक बेस परत को रोकने के लिए.
    6. उच्च करने के लिए आरएफ सेटिंग बारी है, और एक गुलाबी हवा प्लाज्मा देखने विंडो में प्रकट होना चाहिए । प्लाज्मा-30 एस के लिए PDMS के दो टुकड़े का इलाज, तो बंद आरएफ सेटिंग बारी । हवा की अनुमति के लिए धीरे चैंबर में प्रवेश के क्रम में चैंबर की सामग्री परेशान से एक अशांत हवा के प्रवाह को रोकने के लिए ।
    7. प्लाज्मा क्लीनर से PDMS निकालें और यह एक benchtop पर जगह है । फिर, ध्यान से नकारात्मक पर PDMS आयत उलटा और यह संदंश की एक जोड़ी के साथ नीचे प्रेस । PDMS के दो टुकड़े एक दूसरे का पालन करने की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए इसे आराम करते हैं ।
  3. polydimethylsiloxane नकारात्मक के Fluorosilane भूतल उपचार
    1. एक ड्रॉपर का प्रयोग करें trichloro के 2 बूंदें डाल करने के लिए (1, 4, 2H, 2H-perfluoro-octyl) silane (PFOTS) एक छोटे से वजन नाव में और यह एक गिलास निर्वात चैंबर में डालें ।
    2. उलटा एल्यूमीनियम पंनी का एक टुकड़ा पर PDMS (ताकि microchannel नकारात्मक ऊपर की ओर चेहरे) और यह ग्लास निर्वात चैंबर में डाल दिया । फिर, 24 ज के लिए लगातार चैंबर खाली ।

2. MY133 Microchannel का निर्माण

  1. MY133-V2000 microchannel संरचना का गठन
    1. MY133-V2000 के ४०० µ l के साथ PDMS निगेटिव भरें ।
      नोट: नकारात्मक थोड़ा भरा होना चाहिए ।
    2. किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए 2 एच के लिए निर्वात चैंबर में MY133-V2000-भरा PDMS नकारात्मक प्लेस ।
    3. निकालें MY133-वैक्यूम से V2000 और धीरे से थोड़ा के शीर्ष के खिलाफ एक गिलास स्लाइड प्रेस MY133-V2000 की एक सपाट सतह बनाने के लिए नकारात्मक और बहुलकीकरण बाधा से ऑक्सीजन को रोकने के लिए ।
      नोट: PDMS, चैनल की सतह पर, आंशिक रूप से बहुलकीकरण को बाधित करेगा, बाद के चरणों में संबंध को सक्षम करने से । ग्लास स्लाइड एक थोड़ा कम यूवी पारदर्शिता (३५%) क्वार्ट्ज, जो ठीक डिवाइस के किसी भी तेजाब को रोकने में मदद करता है की तुलना में है ।
    4. डालें MY133-V2000 एक ४०० W यूवी ओवन में और यूवी विकिरण सेट ३०० एस के लिए अधिकतम तीव्रता के ५०% करने के लिए MY133-V2000 microchannel इलाज ।
      नोट: पीक तरंग दैर्ध्य के बारे में 25 एनएम के एक बैंडविड्थ के साथ लगभग ३७५ एनएम है डिवाइस का इलाज करने के लिए इस्तेमाल किया । लगभग ४,५००/cm2 पावर के microchannel, जो थोड़ा से अधिक है ंयूनतम इलाज के निर्माता द्वारा अनुशंसित शक्ति डबल इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
  2. ऐक्रेलिक धारक का निर्माण
    1. एक वेक्टर ड्राइंग सॉफ्टवेयर का उपयोग एक्रिलिक बेस परत ड्रा । सुनिश्चित करें कि आधार परत एक आयत है कि १.५ मिमी मोटी, ७५ मिमी लंबी और 25 मिमी चौड़ा है, एक केंद्रित आयत के साथ कि 25 मिमी x 11 मिमी उपाय है ।
    2. ऐक्रेलिक मध्य परत ड्रा एक वेक्टर सॉफ्टवेयर ड्राइंग का उपयोग कर । सुनिश्चित करें कि मध्य परत एक आयत (१.५ मिमी मोटी, ७५ मिमी लंबी है, और 25 मिमी चौड़ा) के साथ एक केंद्रित वर्ग (5 मिमी x 5 मिमी) और दो हलकों (दोनों 3 मिमी के व्यास के साथ) 15 मिमी से अलग है ।
    3. एक वेक्टर ड्राइंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक्रिलिक शीर्ष परत ड्रा । सुनिश्चित करें कि शीर्ष परत एक आयत (3 मिमी मोटी, 30 मिमी लंबी है, और 25 मिमी चौड़ा) एक केंद्रित वर्ग के साथ (5 मिमी x 5 मिमी) और दो हलकों (दोनों 3 मिमी के व्यास के साथ) 15 मिमी से अलग है ।
    4. एक लेज़र कटर के साथ वेक्टर ड्राइंग सॉफ्टवेयर में बनाया डिवाइस डिजाइन में कटौती । १००% पावर और 30% की गति का नमूना सेटिंग्स का उपयोग करें । इस कार्यक्रम को दो बार चलाने के लिए सुनिश्चित करें कि एक्रिलिक काट रहा है ।
    5. ऐक्रेलिक शीर्ष परत में छेद ठोकर एक आकार M5 ०.८०-mm दोहन उपकरण का उपयोग कर ।
    6. एसीटोन के साथ एक्रिलिक टुकड़े पोंछ किसी भी अवशिष्ट निशान या जलता हटाने के लिए ।
  3. MY133-V2000 के बंधन में एक्रिलिक धारक
    1. इस तरह के cyanoacrylate सुपर गोंद के रूप में एक चिपकने वाला का उपयोग कर कांच सब्सट्रेट करने के लिए एक्रिलिक के आधार परत देते हैं । एक्रिलिक के किनारों पर दो छोटी बूंदें प्लेस और फिर एक डिस्पोजेबल उपकरण का उपयोग करने के लिए समान रूप से गोंद फैल गया । ऐक्रेलिक पर कांच सब्सट्रेट प्लेस और गोंद कांच के वजन का उपयोग करने के लिए इसे जगह में पकड़ सूखी अनुमति देते हैं ।
    2. कोट एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग कर PDMS के १०० µ एल के साथ उजागर कांच; फिर, एक वैक्यूम स्पिन कोट में आधार परत डालें और यह 2 मिनट के लिए १,५०० rpm के लिए सेट समान रूप से एक PDMS फिल्म के साथ कांच लगभग 10-µm मोटी ।
    3. स्पिन कोट से बेस परत निकालें और ध्यान से दूर पोंछे किसी भी अतिरिक्त PDMS कि एसीटोन और कागज तौलिया के साथ एक्रिलिक लेपित । सावधान रहें PDMS को परेशान न करें ।
    4. PDMS इलाज के लिए 2 घंटे के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में PDMS के साथ आधार परत सेंकना ।
    5. पिपेट एक गिलास स्लाइड पर PDMS के 1 मिलीलीटर और, फिर, एक और ग्लास स्लाइड का उपयोग करने के लिए समान रूप से PDMS फैल जब तक यह पक्ष बाहर रसना शुरू होता है । 10 मिनट के लिए १५० ° c पर एक गर्म थाली पर इस इलाज ।
    6. MY133-V2000 डिवाइस के रूप में एक ही आयाम के साथ एक आयत में ठीक PDMS कट और, तो, एक सांचे में ढालना के रूप में एक्रिलिक के मध्य परत का उपयोग, जलाशय के लिए छेद पंच और PDMS में एक वर्ग को देखने खिड़की काट PDMS गैसकेट बनाने के लिए ।
    7. MY133-V2000, चैनल साइड ऊपर, एक ही या एक समान फ्लैट सब्सट्रेट के रूप में प्लाज्मा के लिए इस्तेमाल किया-कदम 1.2.5 में PDMS के इलाज पर रखें । एक्रिलिक बेस ओ2 प्लाज्मा क्लीनर में MY133-V2000 चैनल के साथ ठीक PDMS सब्सट्रेट युक्त परत प्लेस । २०० mTorr और आरएफ स्तर को उच्च और सतह के लिए वैक्यूम दबाव सेट करें-30 एस के लिए चैनल और कांच सब्सट्रेट का इलाज
    8. संदंश का प्रयोग, तुरंत MY133-V2000 चैनल पक्ष-बेस परत एक्रिलिक के आयताकार कटआउट में नीचे ऐसी है कि MY133-V2000 संपर्क PDMS जगह ।
    9. MY133-V2000 डिवाइस के शीर्ष पर PDMS गैसकेट प्लेस, डिवाइस में जलाशयों के साथ गैसकेट में छेद अस्तर ।
    10. डिवाइस विधानसभा के लिए एक clamping सतह प्रदान करने के लिए बेंच के ऊपर एक उठाया मंच पर अधूरा डिवाइस रखें ।
    11. एक सिरिंज का उपयोग कर एक्रिलिक सीमेंट के 3 मिलीलीटर निकालें । एक पतली कोटिंग प्रदान करने के लिए आधार परत के शीर्ष पर पर्याप्त एक्रिलिक सीमेंट वितरित । के रूप में भी संभव के रूप में कोट बनाने के लिए और चैनल में सामग्री रिसाव जाने नहीं है ।
    12. आधार परत एक्रिलिक के शीर्ष पर मध्य परत एक्रिलिक टुकड़ा प्लेस । सुनिश्चित करें कि छेद MY133-V2000 चैनल के जलाशयों के साथ लाइन ।
    13. 3 छोटे clamps का उपयोग करने के लिए आधार परत और मध्य परत एक साथ पकड़ के रूप में कस 2 मिनट के लिए संभव के रूप में जबकि एक्रिलिक सीमेंट सख्त, एक साथ एक्रिलिक के टुकड़े बांड । सुनिश्चित करें कि जलाशयों MY133-V2000 डिवाइस के नीचे फंसे होने से हवा को रोकने के लिए इस कदम के दौरान बाधित नहीं कर रहे हैं ।
    14. डिवाइस से दबाव निकालें और एक्रिलिक सीमेंट के ऊपर परत के साथ प्रत्याशित संपर्क के स्थानों में मध्य परत पर एक्रिलिक सीमेन्ट जगह है ।
    15. एक्रिलिक के मध्य परत टुकड़ा पर एक्रिलिक के शीर्ष परत प्लेस, यह सुनिश्चित करना है कि छेद जलाशयों के साथ गठबंधन कर रहे हैं, और 2 मिनट के लिए बेंच पर आराम की अनुमति जबकि ऐक्रेलिक सीमेंट सूख जाता है ।

3. परीक्षण और MY133-V2000 डिवाइस का उपयोग

  1. रिसाव परीक्षण
    1. आसंजन और प्रवाह के लिए परीक्षण करने के लिए जलाशय छेद में से एक में खाद्य डाई या जल के 10 µ एल जोड़कर MY133-V2000 डिवाइस का परीक्षण करें ।
    2. एक ट्यूब (बाहरी व्यास में एक 1/8 के साथ) जलाशय में डालें और एक वैक्यूम जाल के लिए दूसरे छोर से कनेक्ट करें । एक सफल डिवाइस बनाया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए चैनल के माध्यम से डाई या पानी खींचने के लिए पर निर्वात बारी.
    3. एक खुर्दबीन के नीचे की जांच करने के लिए सत्यापित करें कि चैनल या जलाशय में कोई लीक कर रहे हैं, इथेनॉल के साथ जलाशय भरने, और इथेनॉल 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए अनुमति देते हैं । फिर, निर्वात का उपयोग कर के माध्यम से इथेनॉल खींच, डाई या चैनल से बाहर पानी साफ करने के लिए.
    4. इथेनॉल के साथ चैनल स्प्रे और यह एक बाँझ polystyrene पकवान में डाल दिया । यह parafilm के साथ कसकर लपेटें और यह एक बाँझ वातावरण में स्टोर जब तक की जरूरत है ।
      नोट: इस बिंदु पर, डिवाइस aseptically नियंत्रित किया जाना चाहिए ताकि दूषण को रोकने के लिए । जब उपकरण का उपयोग करने के लिए तैयार है, कंटेनर के बाहर इथेनॉल का उपयोग कर निष्फल किया जाना चाहिए और कंटेनर खोलने से पहले एक सुरक्षा कैबिनेट में लाया ।
  2. MY133-V2000 डिवाइस में MCF7 कोशिकाओं चढ़ाना
    1. एक पूरा Dulbecco के ंयूनतम आवश्यक माध्यम (DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन-streptomycin, glutamine, और गैर आवश्यक अमीनो एसिड से मिलकर मीडिया में 10 सेमी पेट्री व्यंजन पर MCF7 कोशिकाओं हो जाना, एक सेल संस्कृति मशीन में है कि ३७ ° c के तापमान पर 5% CO2 और 20% O2 युक्त आर्द्र वातावरण रखता है । microchannel में बीज बोने से पहले कोशिकाओं को लगभग ८०% संगम तक बढ़ाएं ।
    2. सबसे पहले, ७०% इथेनॉल के साथ microchannel युक्त polystyrene पकवान स्प्रे । फिर, यह परिवेश प्रयोगशाला पर्यावरण से चैनल की रक्षा parafilm को हटाने से पहले एक सुरक्षा कैबिनेट में ले आओ ।
    3. मानव-प्लाज्मा-व्युत्पन्न fibronectin को microchannel सतह पर कमजोर करके उसे Dulbecco के फास्फेट-बफर खारा (DPBS) में १० µ ग्राम/ फिर, इस समाधान के चैनल में 20 µ एल इंजेक्षन और ४५ मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर यह मशीन ।
    4. चैनल में सेल संस्कृति मीडिया के 20 µ एल इंजेक्शन द्वारा चैनल के बाहर fibronectin समाधान धोने, और यह 10 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के लिए अनुमति देते हैं ।
    5. DPBS के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें, और 1x trypsin की 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं trypsinize । 7 मिनट के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन । पूरा मीडिया के 9 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर ।
    6. चैनल में कोशिकाओं के 20 µ एल इंजेक्षन और ४५-१२० मिनट के लिए ३७ ° c पर उन्हें गर्मी से पहले इमेजिंग करने के लिए लगाव सब्सट्रेट करने के लिए अनुमति देने के लिए.

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Representative Results

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इस प्रोटोकॉल MY133-V2000, एक कम अपवर्तन के साथ एक fluorinated बहुलक के निर्माण का वर्णन है कि पानी की मिलान सूचकांक । इस प्रोटोकॉल की एक प्रमुख विशेषता यह है कि कैसे आसंजन की कमी को दूर करने के लिए है कि ऑक्सीजन प्लाज्मा का उपयोग करके fluorinated पॉलिमर की विशेषता है और एक एक्रिलिक धारक के भीतर डिवाइस के निर्माण के लिए अतिरिक्त यांत्रिक बल प्रदान करने के लिए चैनल सील की आवश्यकता PDMS सब्सट्रेट (चित्रा 1) के खिलाफ. अंतिम डिवाइस का कम अपवर्तन सूचकांक एक macroscopic स्केल (चित्रा 2) पर स्पष्ट रूप से दिखाया गया है । इस सामग्री से बने चैनल के किनारों को स्पष्ट रूप से हवा (चित्रा 2) में देखा जाता है लेकिन अपवर्तन सूचकांक में घनिष्ठ मेल के कारण जल (चित्रा 2बी) में डूबे हुए भेद करना कठिन हो जाता है । यह निर्माण के बाद सामग्री के ऑप्टिकल गुणों की एक त्वरित जांच प्रदान करता है । एक सफलतापूर्वक पूरा डिवाइस चित्रा 2सीमें दिखाया गया है, जहां MY133-V2000 microchannel एक्रिलिक कि अतिरिक्त यांत्रिक बल प्रदान करता है microchannel सील करने के लिए आवश्यक द्वारा encapsulated देखा जा सकता है । एक सफल उपकरण डिवाइस और सब्सट्रेट के बीच अच्छा आसंजन (हवा बुलबुले से मुक्त) दिखाने चाहिए । डिवाइस चैनल के केंद्र में एक हवाई बुलबुले की उपस्थिति इंगित करता है कि हवा बंधन के दौरान भागने की अनुमति नहीं थी, सबसे जलाशयों की एक रुकावट के कारण होने की संभावना है जब एक्रिलिक सीमेंट सेट । इस उपकरण को भी अच्छी तरह से का पालन पता चलता है एक्रिलिक/ इस क्षेत्र में समस्याओं या तो एक्रिलिक और कांच परतों के बीच चिपकने से अधिक समान रूप से फैल या microfluidic डिवाइस की मोटाई को कम करने के लिए धारक पर तनाव को रोकने के द्वारा संबोधित किया जा सकता है । अंत में, सभी तीन पैनलों में जलाशयों किनारों पर कोई हवा अंतराल के साथ, स्पष्ट किनारों दिखाते हैं । इस उपकरण सब्सट्रेट आसंजन कि छिड़काव बंदरगाहों में बनाया के साथ एक डिवाइस मोल्ड के उपयोग के द्वारा समाप्त हो गया है के लिए एक और संभावित समस्या क्षेत्र है

एक सूक्ष्म पैमाने पर, कुछ, यदि कोई हो, कलाकृतियों microchannel और सेल संस्कृति मीडिया के अपवर्तन सूचकांक का मिलान करके चरण unwrappinging के कारण पेश कर रहे हैं । यह दर्शाता है कि कोशिकाओं के द्रव्यमान ठीक भी चैनल दीवारों के आसपास में quantified जा सकता है (चित्रा 3). सामूहिक रूप से, इन परिणामों को दिखाने के लिए, दोनों एक macroscopic पैमाने पर और एक सूक्ष्म पैमाने पर, एक fluorinated बहुलक का उपयोग करने microchannel के निर्माण सामग्री के बीच अपवर्तन के सूचकांक से मेल करने के लिए जलीय कोशिका संस्कृति मीडिया के लाभ ।

Figure 1
चित्रा 1 : MY133-V2000 सॉफ्ट लिथोग्राफी कार्यप्रवाह. () MY133-V2000 के साथ मोल्ड भरने के बाद, meniscus एक सपाट सतह बनाने और एक यूवी ओवन में ठीक करने के लिए एक गिलास स्लाइड का उपयोग कर संकुचित है । ध्यान दें कि जलाशयों के नकारात्मक की ऊंचाई मोल्ड की ऊंचाई के बराबर है गहरे जलाशयों बनाने के लिए 3 मिमी व्यास में । () एक्रिलिक काटने के बाद, नीचे एक्रिलिक परत एक गिलास coverslip से चिपके से पहले स्पिन-PDMS के साथ कोटिंग है । शीर्ष दो एक्रिलिक परतें एक साथ फाड़ा एक्रिलिक सीमेंट का उपयोग कर रहे हैं । () ठीक MY133-V2000 डिवाइस (चैनल साइड अप) और coverslip सतह-इलाज कर रहे हे2 प्लाज्मा का उपयोग कर रहे हैं । () अंत में, यन्त्र के सतह-स्वास्थ्यकर्मी पक्षों का पालन करते हुए यंत्र को इकट्ठे किया जाता है और एक साथ coverslip है. PDMS गैसकेट तो MY133-V2000 डिवाइस के शीर्ष पर रखा गया है और एक्रिलिक एक्रिलिक सीमेंट का उपयोग कर संलग्न है, दोनों PDMS गैसकेट के छेद के साथ और मध्य ऐक्रेलिक अस्तर की परत जलाशयों के साथ । इकट्ठे डिवाइस तो 2 मिनट के लिए हाथ से clamped है जब तक एक्रिलिक सीमेंट सूख जाता है । () उपकरण का एक विस्फोट दृश्य दिखाता है कि डिवाइस कैसे इकट्ठे है । () एक ड्राइंग समाप्त डिवाइस के microchannel के माध्यम से पार अनुभाग से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : पूर्ण MY133-V2000 उपकरणों की छवियां । () MY133-V2000 यंत्र के किनारों की हवा में भेद दिखाई देता है. () जब पानी में जलमग्न हो जाता है, तो अपवर्तन सूचकांकों में घनिष्ठ मेल के कारण एक ही MY133-V2000 यंत्र के किनारे अदृश्य हो जाते हैं. () यह तस्वीर एक एक्रिलिक धारक के साथ एक समाप्त उपकरण से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : सेल मास ठीक microchannel संरचनाओं के पास quantified जा सकता है । MY133-V2000 microchannel में हौसले से वरीयता प्राप्त MCF7 कोशिकाओं के सेल द्रव्यमान की माप कोई कलाकृतियों के पास चरण लपेटन के कारण ( और बी) दीवार या () चैनल के केंद्र. चैनल मटेरियल और सेल कल्चर मीडिया के बारीकी से मिलाए गए अपवर्तन सूचकांकों की वजह से इन कलाकृतियों को MY133-V2000 चैनल में टाला जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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MY133-V2000 ऐसे PDMS के रूप में पारंपरिक नरम लिथोग्राफी निर्माण सामग्री के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । पिछले काम PDMS के रूप में अपवर्तन के एक उच्च सूचकांक के साथ कि सामग्री से पता चला है, चैनल के अंदर निर्माण सामग्री और जलीय समाधान के बीच अपवर्तन के बेमेल सूचकांकों के कारण चैनलों की दीवारों के पास महत्वपूर्ण कलाकृतियों परिचय 13. MY133-V2000 आमतौर पर जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में इस्तेमाल जलीय समाधान के लिए microfluidic डिवाइस के अपवर्तन सूचकांक मिलान सक्षम बनाता है । यह इमेजिंग कलाकृतियों कम कर देता है जब उंनत सूक्ष्म तकनीक के साथ microfluidics संयोजन, पारंपरिक microfluidic निर्माण सामग्री पर एक विशिष्ट लाभ प्रदान करते हैं । microfluidic चैनल में विरूपण साक्ष्य कमी इस प्रणाली के द्वारा संभव बनाया प्रतिदीप्ति और मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) संकेतों को और अधिक ठीक हो quantified, यहां तक कि microchannel संरचनाओं13के करीब निकटता में ।

एक fluorinated बहुलक के रूप में, MY133-V2000 आम तौर पर चैनल संरचना और अंय सामग्री के बीच कम आसंजन प्रदर्शित, इस प्रकार एक प्रमुख सीमा शुरू जब पारंपरिक निर्माण सामग्री की तुलना में । इस चुनौती को दूर करने के लिए, दोनों रासायनिक सतह उपचार (ओ2 प्लाज्मा) यांत्रिक संपीड़न के अलावा उपकरण फैलाएंगे और सब्सट्रेट के बीच PDMS गैसकेट और एक्रिलिक का एक टुकड़ा के बीच उपयोग किया जाता है द्वारा बनाई गई । PDMS के निचले लोचदार मापांक (MY133-V2000 की तुलना में) से यांत्रिक बल के स्थानांतरित करने के लिए महत्वपूर्ण है एक्रिलिक से MY133-V2000 डिवाइस, क्योंकि यह पर्याप्त रूप से संकुचित हो, यह जगह में microchannel धारण करने की अनुमति है, जबकि इसके साथ ही रख यह सब्सट्रेट के खिलाफ सील ।

जब इस विधि का उपयोग कर microchannels गढ़े और समस्या निवारण जब ध्यान दिया जाना चाहिए विफलता के दो महत्वपूर्ण बिंदुओं का सामना किया जा सकता है । ये जहां यांत्रिक संपीड़न से बल कम से कम है चैनल के केंद्र से अतिरिक्त लावा और रिसाव के कारण जलाशय से रिसाव कर रहे हैं । यहां तक कि जलाशयों के लिए छेद छिद्रण से लावा की एक छोटी राशि सब्सट्रेट ठीक से पालन करने से जलाशय को रोका । जलाशय से रिसाव को रोकने के लिए, microchannel नकारात्मक छोटे स्तंभों में शामिल हैं, व्यास में 3 मिमी, कि मोल्ड के रूप में ऊंचाई में समान हैं, ताकि जलाशयों जलाशयों के लिए छेद पंच करने के लिए एक उपकरण का उपयोग करने के लिए बिना microchannel के एक भाग के रूप में डाली जा सकती है. इलाज के बाद जलाशयों के लिए छेद छिद्रण लावा कि चैनल को नुकसान पहुंचाने के बिना दूर धोया जाना चाहिए बनाता है (चित्रा 1A) । इस अभ्यास में हासिल करना मुश्किल है । चैनल के केंद्र से लीक को रोकने के लिए, यह महत्वपूर्ण नहीं था विधानसभा के दौरान जलाशयों को कवर क्रम में हवा डिवाइस के नीचे से बचने के लिए अनुमति देने के लिए । यदि जलाशयों बाधित कर रहे है जब एक साथ डिवाइस gluing, डिवाइस के नीचे हवा से बचने में असमर्थ है, तरल पदार्थ के लिए एक जगह बनाने के लिए चैनल से बाहर रिसाव ।

इस प्रोटोकॉल, इसलिए, दोनों सतह के उपचार के माध्यम से आसंजन में सुधार और एक एक्रिलिक धारक में डिवाइस बढ़ते, बहुलक के चिपकने वाले गुणों पर fluorination के नकारात्मक प्रभाव को कम करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है । उपकरणों तरल पदार्थ से भर गया और अप करने के लिए 24 घंटे की मशीन, प्रदर्शन है कि डिवाइस एक ठेठ इमेजिंग प्रयोग की अवधि के लिए कार्यात्मक रहता है । MY133-V2000, एक microfluidic डिवाइस के लिए एक निर्माण सामग्री के रूप में, कोशिका बायोमास को मापने के लिए QPM के साथ जोड़ा जा सकता है । इससे पहले, QPM पारंपरिक17दृष्टिकोण से एक अधिक से अधिक परिशुद्धता के साथ जीवित कोशिकाओं के विकास को मापने के लिए दिखाया गया है । QPM का प्रयोग, एक जीवित सेल दवा प्रतिक्रिया एकल सेल संकल्प11,18,19के साथ मापा जा सकता है । जब MY133-V2000 के साथ संयोजित किया जाता है, तो कक्षों को कम से 1 d के लिए चैनल में प्रसंस्कृत कर सकते हैं, कोशिकाओं की विकास दर को ठीक से निर्धारित करना सक्षम बनाता है. दोनों microfluidics और QPM के लाभ के संयोजन के विकास और नियंत्रित परिस्थितियों में कोशिकाओं के रहने की दवा प्रतिक्रियाओं के माप के लिए अनुमति देता है ।

इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों को शामिल इसे और अधिक उंनत microfluidic और मात्रात्मक सूक्ष्म प्रयोगों में । MY133 की लोच-V200013 इस तरह सांस का वाल्व के रूप में उन्नत microfluidic तकनीकों के साथ संगत है, आगे जटिल geometries और प्रयोगात्मक डिजाइन के निर्माण को सक्षम करने. यहां प्रस्तुत परिणाम मात्रात्मक माप QPM का उपयोग करने के लिए इस सामग्री का उपयोग प्रदर्शित करता है । MY133-V2000 भी अंय मात्रात्मक सूक्ष्म तकनीक के साथ संगत होना चाहिए, जैसे Frster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण या प्रतिदीप्ति लाइफटाइम माइक्रोस्कोपी । इस दृष्टिकोण भी डिवाइस के लिए अनुमति देता है पर और एक PDMS सब्सट्रेट के खिलाफ बंद कर दिया, इस तरह सब्सट्रेट में fluorophores encapsulating के रूप में उन्नत प्रयोगात्मक डिजाइन को सक्षम करने के लिए । कुल मिलाकर, MY133-V2000 कलाकृतियों जब microchannels में जलीय समाधान में मात्रात्मक माप कर कम कर देता है, यह उच्च परिशुद्धता जैव चिकित्सा माप बनाने के लिए microfluidic चैनलों के निर्माण के लिए एक आदर्श सामग्री बना ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम अनुसंधान के लिए उपाध्यक्ष के यूटा विश्वविद्यालय के कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, साथ ही अनुदान P30 CA042014 व्याध कैंसर संस्थान के लिए और व्याध कैंसर संस्थान में सीआरआर कार्यक्रम को संमानित किया के साथ संयोजन के रूप में धन के द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MY133-V2000 MY Polymers MY133-V2000
Sylgard 184 Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fisher Premium microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
.118"(3.0mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet United States Plastic Corp 44290
.060"(1.5mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet United States Plastic Corp 44200
SCIGRIP 3 Very Fast Set Acrylic Cement United States Plastic Corp 45735
Standard Aluminum Foil (.6 mm thick) VWR 89107-726
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666
Insta-Cure+ Super Glue Bob Smith Industries BSI-109
1/8" PVC tubing McMaster Carr 5231K55
McCormick Food Coloring Target 13353207
X-Acto #1 Precision Knife X-Acto X3201
X-Acto #18 Heavyweight wood chiseling blade X-Acto X218
VWR Razor Blades VWR 55411-055
Surface Treated Cell Culture Dishes Fisher Scientific FBO12922
Fibronectin Human Plasma Sigma-Aldritch F0895-1MG
Trypsin-EDTA 10x Fisher Scientific 15-400-054
Corning Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific MT21030CM
Gibco Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-148
HyClone Nonessential Amino Acids 100x Fisher Scientific SH3023801
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-12
Corning DMEM with L-glutamine and glucose Fisher Scientific MT10013CV
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldritch 448931 Reacts violently with water
Ethanol, 200 proof Decon Labs Fisher Scientific 04-355-223
Acetone Fisher Scientific A18P-4
Bel-Art 42025 Plastic Dessicator Cole-Parmer EW-06514-30
Epilog Fusion Laser Cutter, 120 W Epilog Laser Epilog Fusion M2 32 Laser
Isotemp Stirring Hotplate Fisher Scientific SP88850200
Ateco 14111 1.5 inch stainless steel cutter Ateco 14111
Pyrex Glass Cell Culture Dish Fisher Scientific 08-747B
Radio Frequency Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G Used with Oxygen gas
Black Hole Laboratories Digivac Black Hole Laboratories Model 215
Intelli-Ray Ultraviolet Oven Uvitron UVO338
Compact Spin Coater MTI Corporation VTC-100A
Fisher Brand Isotemp Oven Fisher Scientific 15-103-0510 Forced Air Convection
Gilson Positive Displacement Pipette P1000 Fisher Scientific FD10006G
HeraCell VIOS 160i Fisher Scientific 13 998 212PM

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References

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अपवर्तन-सूचकांक-मिलान-बायोमेडिकल Microfluidics के लिए उपकरणों का निर्माण
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Polanco, E. R., Western, N., Zangle, T. A. Fabrication of Refractive-index-matched Devices for Biomedical Microfluidics. J. Vis. Exp. (139), e58296, doi:10.3791/58296 (2018).More

Polanco, E. R., Western, N., Zangle, T. A. Fabrication of Refractive-index-matched Devices for Biomedical Microfluidics. J. Vis. Exp. (139), e58296, doi:10.3791/58296 (2018).

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