Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Engineering

Fabricage van refractieve-index-matched apparaten voor biomedische Microfluidics

doi: 10.3791/58296 Published: September 10, 2018

Summary

Dit protocol beschrijft de fabricage van microfluidic apparaten van MY133-V2000 te elimineren artefacten die zich vaak in microchannels als gevolg van de verschillen brekingsindices tussen microchannel structuren en een waterige oplossing voordoen. Dit protocol maakt gebruik van een acryl houder voor het comprimeren van de ingekapselde apparaat, verbetering van hechting, zowel chemisch als mechanisch.

Abstract

Het gebruik van microfluidic apparaten heeft ontpopt als een definiërende hulpmiddel voor biomedische toepassingen. Wanneer gecombineerd met moderne microscopie technieken, kunnen deze apparaten worden geïmplementeerd als onderdeel van een robuust platform staat om gelijktijdige aanvullende metingen. De voornaamste uitdaging gemaakt door de combinatie van deze twee technieken is de mismatch in brekingsindex tussen de materialen traditioneel gebruikt voor het maken van microfluidic apparaten en de waterige oplossingen doorgaans gebruikt in de medische biologie. Deze wanverhouding kunt optische artefacten in de buurt van de randen van het kanaal of apparaat. Een oplossing is het verminderen van de brekingsindex van het materiaal gebruikt voor het fabriceren van het apparaat met behulp van een gefluoreerde polymeer zoals MY133-V2000 waarvan brekingsindex vergelijkbaar met die van water is (n = 1.33). Hier, de bouw van een microfluidic apparaat gemaakt uit MY133-V2000 met behulp van zachte lithografie technieken is aangetoond, met behulp van O2 plasma in combinatie met een acrylaat houder te verhogen van de hechting tussen de MY133-V2000 vervaardigd apparaat en de Polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat. Het apparaat wordt vervolgens getest door het gevuld met cel voedingsbodems voor 24 h om aan te tonen van het vermogen van het apparaat voorwaarden te handhaven cel cultuur in de loop van een typische imaging experiment aan het broeden. Ten slotte, kwantitatieve fase microscopie (QPM) wordt gebruikt voor het meten van de verdeling van massa binnen de levende Adherente cellen in de microchannel. Op deze manier wordt de verhoogde precisie, ingeschakeld door het fabriceren van het apparaat van een lage brekingsindex polymeer zoals MY133-V2000 in plaats van traditionele lithografie van zachte materialen zoals PDMS, aangetoond. Over het algemeen kan deze benadering voor het fabriceren van microfluidic apparaten gemakkelijk worden geïntegreerd in bestaande zachte lithografie werkstromen om optische artefacten verminderen en precisie van de meting te vergroten.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De ontwikkeling van microfluidic technologie heeft een breed scala van nieuwe biomedische technieken die gebruik maken van de unieke fysica van microscopische schaal stromen1,2. Het gaat hierbij om de diagnostische technieken die gebouwd op microfluidic platforms die kwantificeren van klinisch relevante biomarkers, met inbegrip van cel stijfheid3, oppervlakte markeringen4en groei5. Door het manipuleren van afzonderlijke cellen, kunnen microfluidic apparaten ook worden gebruikt voor het meten van biomerker heterogeniteit, bijvoorbeeld als een indicator van maligniteit6. De mogelijkheid om het combineren van microfluidic toepassingen met microscopie is het nut van deze platforms verder toegenomen doordat voor apparaten die gelijktijdig meerdere biomarkers meten7.

QPM is een microscopie techniek die de faseverschuiving maatregelen licht passeert en samenwerkt met de zaak binnen transparante monsters. De massa van afzonderlijke cellen kan worden berekend uit metingen van de QPM, met behulp van de bekende relatie tussen de brekingsindex en de biomassa dichtheid8,9. Vorige werk heeft aangetoond dat QPM voor het meten van klinisch relevante parameters, zoals de cel groei10,11 en cel mechanische eigenschappen via disorder kracht12. Wanneer gecombineerd met microfluidics, kan QPM hormoon worden gebruikt voor het meten van de werking van de cel in een sterk gecontroleerde omgeving in vitro. Een van de belangrijkste uitdagingen voor combineren QPM met microfluidics is de hoge brekingsindex van de meeste polymeren gebruikt voor de constructie van microfluidic kanalen via zachte lithografie13.

Een belangrijke uitdaging voor de combinatie van microfluidics met verschillende microscopie technieken is de wanverhouding tussen de brekingsindex van het apparaat materiaal ten opzichte van de brekingsindex van water14,15. Een methode om aan te pakken dit is door het gebruik van een lage brekingsindex polymeer zoals CYTOP16 of MY133-V200013. Dit laatste is een gefluoreerde ultraviolet (UV)-drogende acrylaat polymeer dat een soortgelijk aan water brekingsindex heeft (n = 1.33) en die compatibel is met zachte litho-technieken, waardoor een vlotte integratie in vele gevestigde microfluidic apparaat fabricage werkstromen. Dit maakt MY133-V2000 niet alleen geschikt voor de fabricage van microfluidic apparaat, maar ook in staat stelt om gemakkelijk gecombineerd worden met QPM en andere benaderingen microscopie, voor het meten van de cel probleem zowel op de kolonie op de schaal van een eencellige. MY133-V2000 elimineert artefacten als gevolg van fase uitpakken door het produceren van weinig of geen, faseverschuiving als lichte passen via de water-MY133-interface.

Hoewel het elimineren van de mismatch in brekingsindex, is een belangrijke uitdaging die zijn gekoppeld aan de apparaten vervaardigd uit gefluoreerde polymeren, zoals MY133-V2000, de lage hechting met andere materialen zoals glas of PDMS. Het huidige werk toont de fabricage van een MY133-V2000 microfluidic-apparaat met behulp van zachte lithografie. O2 plasma voor de behandeling van het oppervlak van zowel het kanaal en de PDMS substraat gecombineerd met een aangepaste-verzonnen acryl houder zorgt ervoor dat het apparaat voldoet aan de ondergrond, het creëren van een verzegelde kanaal. Dit apparaat is geschikt voor celkweek en QPM voor het meten van de massa van de cellen in het kanaal, dat belangrijke toepassingen heeft voor het meten van de groei van levende cellen en de intracellulaire vervoer van cel biomassa, die beide klinische relevantie in diagnose hebben geneeskunde en drug discovery.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. fabricage van de negatieve Polydimethylsiloxaan

  1. Voorbereiding van Polydimethylsiloxaan
    1. Maatregel 18 g PDMS silicone-elastomeer en 1,8 g van het genezen reagens. Giet de uithardende reagens in een meetinstrument boot met de elastomeer.
    2. Meng de elastomeer en het genezen reagens krachtig gedurende 1 minuut en doe het mengsel in een vacuuemcel gedurende 30 minuten.
    3. Verwijderen van het PDMS van het vacuüm, pour 15 g op de negatieve met behulp van een cookie cutter (straal = 3.8 cm) te houden van het PDMS uitgevoerd van de kant, en betrekking hebben op de resterende PDMS mengsel.
    4. Zet de schimmel met de PDMS in de Vacuuemcel gedurende 10 minuten.
    5. Verwijderen van de schimmel met de PDMS van de Vacuuemcel, plaatst u deze op een hete plaat ingesteld op 150 ° C gedurende 60 minuten te genezen, bedekken met aluminiumfolie.
    6. Giet de resterende PDMS op een omgekeerde glas petrischaal (10 cm in diameter), gebruik een andere cookie cutter als een mal, voor het maken van een pad voor PDMS. Zet dit in de Vacuuemcel totdat de PDMS negatieve volledig is genezen.
    7. Overdracht de petrischaal met de PDMS van het vacuüm naar de voorverwarmde verwarmingsplaat te genezen bij 150 ° C gedurende 60 min.
  2. Oppervlaktebehandeling van het plasma van Polydimethylsiloxaan
    1. Invoegen van een scherp scheermesje onder het PDMS en de cookie-cutter om zorgvuldig de PDMS van de negatieve.
    2. Gebruik een scherp hobby mes te snijden uit het negatieve uit de grotere stuk PDMS; het moet worden gesneden met genoeg buffer gebied hechten een ander stuk van PDMS bovenop het zonder te belemmeren de negatieve.
    3. Een scherp scheermesje onder de uitgeharde PDMS invoegen met behulp van de negatieve naar Verwijder voorzichtig het PDMS van de petrischaal.
    4. Gebruik een hobby mes te snijden uit een stuk van PDMS uit de pad die is van dezelfde grootte als het stuk gesneden voor de negatieve. Knip een rechthoek uit het nieuwe stuk van PDMS met voldoende ruimte om te passen rond de microchannel wanneer deze wordt geplaatst op de top van de negatieve.
    5. Beide stukken voor PDMS (de negatieve en de rechthoek) zetten op een vlakke ondergrond (zoals een dia gemaakt van glas, kwarts, polystyreen of ander materiaal) en deze invoegen in een radiofrequentie (RF)-plasma reiniger. De deur dicht en verzegel de kamer door de lucht met behulp van een vacuümpomp te evacueren. Injecteer lucht tot een druk van 400 mTorr met behulp van een digitale vacuüm druk-controller.
      Opmerking: Als het substraat gebruikt voor het reinigen van de plasma niet is gebruikt in het plasma reiniger, zet het in het plasma schoner door zelf voor 60 s voorafgaande aan de behandeling van de negatieve, om te voorkomen dat de acryl basislaag vasthouden aan het substraat.
    6. Schakel de instelling van de RF op hoog en een plasma roze lucht moet worden weergegeven in het weergavevenster. Plasma-traktatie de twee stukken van PDMS voor 30 s, vervolgens de RF-instelling uitschakelen. Laat lucht langzaam opnieuw invoeren van de kamer om te voorkomen dat een turbulente luchtstroom verstoring van de inhoud van de meetkamer.
    7. Verwijderen van het PDMS uit het plasma reiniger en plaats deze op een benchtop. Vervolgens voorzichtig omkeren de PDMS rechthoek over de negatieve en druk er met een paar pincet. Laat het rusten gedurende 10 minuten zodat de twee stukken van PDMS aan elkaar te houden.
  3. Oppervlaktebehandeling van het Fluorosilane van de negatieve Polydimethylsiloxaan
    1. Gebruik een druppelaar te zetten 2 druppels trichloor (1H 1U, 2U, 2H-perfluoro-octyl) silane (PFOTS) in een kleine boot weeg en plaatst u deze in een vacuuemcel glas.
    2. Omkeren van het PDMS op een stuk aluminiumfolie (zodat de microchannel-negatieve naar boven gezichten) en zet het in het glas Vacuuemcel. Vervolgens het evacueren van de kamer voortdurend gedurende 24 uur.

2. de fabricage van de Microchannel MY133

  1. Vorming van de MY133-V2000 microchannel-structuur
    1. Vul de negatieve PDMS met 400 µL van MY133-V2000.
      Opmerking: De negatieve moet worden iets overfilled.
    2. Plaats de MY133 V2000-gevulde PDMS negatief in de Vacuuemcel voor 2 h tot alle bubbels verwijderen.
    3. MY133-V2000 verwijderen uit het vacuüm en druk langzaam op een glasplaatje tegen de top van de enigszins overvolle negatieve om een platte oppervlak van MY133-V2000 te maken en te voorkomen dat zuurstof remming van de polymerisatie.
      Opmerking: PDMS, aan het kanaal oppervlak, zal gedeeltelijk remmen de polymerisatie, waardoor lijmen in latere stadia. Het glasplaatje heeft een enigszins verminderde UV transparantie (35%) in vergelijking met kwarts, die helpt om te voorkomen dat een geelverkleuring van de uitgeharde apparaat.
    4. MY133-V2000 invoegen met een 400 W UV oven en de UV-straling ingesteld op 50% van de maximale intensiteit voor 300 s om te genezen van de MY133-V2000 microchannel.
      Opmerking: De golflengte van de piek gebruikt voor het genezen van het apparaat is ongeveer 375 nm met een bandbreedte van ongeveer 25 nm. Ongeveer 4.500 mJ/cm2 van kracht werd gebruikt voor het genezen van de microchannel, die is iets meer dan verdubbelen het genezen van macht door de fabrikant aanbevolen minimum.
  2. Opbouwen van de acryl houder
    1. Trekken de acryl basislaag met behulp van een vector tekening software. Zorg ervoor dat de basislaag is een rechthoek die 1.5 mm dik, 75 mm lang, 25 mm breed, met een gecentreerde rechthoek die 25 mm x 11 mm maat.
    2. Trekken de acryl mid laag met behulp van een vector tekening software. Controleer of dat de midden laag is een rechthoek (1.5 mm dik, 75 mm lang en 25 mm breed) met een gecentreerd kwadraat (5 x 5 mm) en twee cirkels (beide met een diameter van 3 mm) gescheiden door 15 mm.
    3. Trekken de acryl toplaag met behulp van een vector tekening software. Zorg ervoor dat de bovenste laag is een rechthoek (3 mm dik, 30 mm lang en 25 mm breed) met een gecentreerd kwadraat (5 x 5 mm) en twee cirkels (beide met een diameter van 3 mm) gescheiden door 15 mm.
    4. Knip de apparaat ontwerpen gemaakt in de vector tekening software met een laser cutter. Gebruik de instellingen van de steekproef van 100% vermogen en 30% snelheid. Voer het programma tweemaal om ervoor te zorgen dat de acryl is uitgesneden.
    5. Tik op de gaten in de acryl toplaag met behulp van een hulpprogramma size M5 0,80 mm te onttrekken.
    6. Veeg de acryl stukken met aceton voor het verwijderen van alle resterende merken of brandwonden.
  3. Verlijmen van MY133-V2000 in het acryl houder
    1. De basislaag van de acryl hechten aan het glas-substraat met behulp van een kleefmiddel is bevestigd, zoals cyanoacrylaat superlijm. Plaats twee kleine druppels op de randen van het acryl en gebruik vervolgens een wegwerp hulpmiddel om gelijkmatig op de lijm. Plaats van het glas-substraat op de acryl en laat de lijm drogen met behulp van het gewicht van het glas om het op zijn plaats houden.
    2. Jas het blootgestelde glas met 100 µL van PDMS met behulp van een precisiepipet volumetrische; vervolgens de basislaag in een vacuüm spin-coater invoegen en zet deze op 1500 rpm gedurende 2 min. gelijkmatig jas het glas met een PDMS film ongeveer 10-µm dik.
    3. Verwijder de basislaag van de spin-coater en zorgvuldig veeg weg overtollige PDMS die bekleed het acryl met aceton en papier handdoek. Wees voorzichtig niet te verstoren, de niet-uitgeharde PDMS.
    4. Bak de basislaag met het PDMS in een oven bij 65 ° C gedurende 2 uur om te genezen van de PDMS.
    5. Pipetteer 1 mL PDMS op een glasplaatje en gebruik vervolgens een ander glasplaatje om gelijkmatig het PDMS totdat het begint te sijpelt uit de zijkanten. Genezen dit op een hete plaat bij 150 ° C gedurende 10 minuten.
    6. Snijd de gerookte PDMS in een rechthoek met dezelfde afmetingen als het MY133-V2000 apparaat en vervolgens met de mid laag van de acryl als een schimmel, punch gaten voor het reservoir en een kijkvenster in het PDMS om de pakking PDMS vierkant gesneden.
    7. Plaats de MY133-V2000, kanaal kant omhoog, op dezelfde of een soortgelijke vlakke ondergrond zoals gebruikt voor de plasma-behandeling de PDMS in stap 1.2.5. Plaats de acryl basislaag met het genezen PDMS substraat naast het kanaal van de MY133-V2000 in het O2 plasma reiniger. De vacuüm druk ingesteld op 200 mTorr en de RF op hoog niveau en oppervlakte-traktatie het kanaal en glas substraat voor 30 s.
    8. Pincet onmiddellijk plaats met de MY133-V2000 kanaal kant-down in de rechthoekige uitsparing van de acryl van de basislaag zodanig dat de MY133-V2000 contact op met de PDMS.
    9. Plaats de PDMS pakking op de top van de MY133-V2000 apparaat, die voering van de gaten in de pakking met de reservoirs in het apparaat.
    10. Plaats het onvoltooide apparaat op een verhoogd platform boven de Bank te verstrekken een klemmen oppervlak voor montage van het apparaat.
    11. Pak 3 mL acryl cement met een injectiespuit. Distribueren genoeg acryl cement op de top van de basislaag te voorzien van een dunne coating. De vacht als zelfs mogelijk en laat niet de materiële seep in het kanaal maken
    12. Plaats het midden laag acryl stuk op de top van de basislaag acryl. Ervoor te zorgen dat de gaten met de reservoirs van de MY133-V2000 kanaal line-up.
    13. Gebruik 3 kleine klemmen te houden van de basislaag en mid laag samen zo strak mogelijk gedurende 2 minuten terwijl de acryl cement verhardt, obligatie van de stukken van acryl samen. Zorg ervoor dat de reservoirs zijn niet belemmerd tijdens deze stap om te voorkomen dat lucht wordt gevangen onder de MY133-V2000 apparaat.
    14. De druk uit het apparaat verwijderen en plaatsen van de acryl cement op de mid laag in de plaatsen van verwachte contact met de bovenste laag van de acryl.
    15. Plaats de bovenste laag van de acryl op het stuk van de mid laag van de acryl, ervoor te zorgen dat de gaten zijn afgestemd op de stuwmeren, en laat ze rust op de Bank gedurende 2 minuten, terwijl de acryl cement droogt.

3. testen en het gebruik van het MY133-V2000 apparaat

  1. Lekken testen
    1. Test de MY133-V2000 apparaat door 10 µL van voedsel kleurstof of gedeïoniseerd water toe te voegen in één van de gaatjes van het reservoir om te testen voor de hechting en stroom.
    2. Plaats een buis (met een 1/8-in buitendiameter) in het reservoir en sluit het andere uiteinde aan op een vacuüm val. Draai de vacuüm op trekken de kleurstof of het water via het kanaal om ervoor te zorgen dat een succesvolle apparaat is gemaakt.
    3. Controleer onder een microscoop om te controleren of er geen lekken in het kanaal of het reservoir Vul het reservoir met ethanol en toestaan dat de ethanol te zitten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Vervolgens trekken de ethanol door het gebruik van de leegte, de kleurstof of het water uit het kanaal schoon te maken.
    4. Spray het kanaal met ethanol en zet het in een steriele polystyreen schotel. Wikkel het strak met parafilm en opslaan in een steriele omgeving totdat het nodig is.
      Opmerking: op dit punt het apparaat moet worden omgegaan aseptisch ter voorkoming van verontreiniging. Als u klaar bent om het apparaat te gebruiken, moet de buitenkant van de container met behulp van ethanol en gebracht in een kabinet vóór het openen van de container bioveiligheid worden gesteriliseerd.
  2. Beplating MCF7 cellen in het MY133-V2000 apparaat
    1. MCF7 cellen op 10-cm petrischalen in een volledige media bestaande Dulbecco van minimale essentiële medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum, penicilline-streptomycine, glutamine en niet-essentiële aminozuren, in een cel cultuur incubator groeien dat onderhoudt een vochtige atmosfeer met 5% CO2 en 20% O2 bij een temperatuur van 37 ° C. De cellen groeien tot ongeveer 80% samenkomst voordat ze in de microchannel zaaien.
    2. Eerst spray de polystyreen schotel met de microchannel met 70% ethanol. Dan, breng het in de kast voor het verwijderen van de bescherming van het kanaal van de ambient labo-omgeving parafilm bioveiligheid.
    3. Immobiliseren mens-plasma bereide fibronectine op het oppervlak van de microchannel door verdunning van het in de Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) tot 10 µg/mL. Vervolgens injecteren 20 µL van deze oplossing in het kanaal en Incubeer het bij 20 ° C gedurende 45 minuten.
    4. Wassen van de fibronectine oplossing uit het kanaal door injecterend 20 µL van cel voedingsbodems in het kanaal, en laat ze broeden bij 20 ° C gedurende 10 minuten.
    5. Wassen van de cellen met 10 mL van de DPBS, en trypsinize van de cellen door toevoeging van 1 mL 1 x trypsine. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 7 min. neutraliseren de trypsine met 9 mL van volledige media.
    6. Injecteren van 20 µL van de cellen in het kanaal en hen Incubeer bij 37 ° C gedurende 45-120 min om de bijlage aan de ondergrond vóór imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol beschrijft de fabricage van MY133-V2000, een gefluoreerde polymeer met een lage brekingsindex overeenkomen met die van water. Een belangrijk kenmerk van dit protocol is hoe te overwinnen van het gebrek aan hechting dat kenmerkend is voor gefluoreerde polymeren met behulp van zuurstof plasma en door het fabriceren van het apparaat binnen een acryl houder de extra mechanische kracht die nodig is om het zegel van het kanaal tegen het PDMS substraat (Figuur 1). De lage brekingsindex van het laatste apparaat wordt duidelijk aangetoond op macroscopische schaal (Figuur 2). De randen van een kanaal gemaakt van dit materiaal zijn duidelijk te zien in de lucht(Figuur 2), maar wordt het lastig om te onderscheiden wanneer ondergedompeld in water (Figuur 2B) als gevolg van de nauwe wedstrijd in brekingsindex. Dit biedt een snelle controle van de optische eigenschappen van het materiaal na fabricage. Een succesvol afgeronde apparaat wordt weergegeven in Figuur 2C, waar de MY133-V2000 microchannel kan worden gezien door het acryl waarmee de extra mechanische kracht die nodig is voor het afdichten van de microchannel ingekapseld. Goede hechting (vrij van luchtbellen) tussen het apparaat en het substraat moet worden weergegeven door een succesvolle apparaat. De aanwezigheid van een luchtbel in het midden van het kanaal van het apparaat geeft aan dat de lucht niet te ontsnappen tijdens bonding, waarschijnlijk als gevolg van een obstructie van de stuwmeren wanneer het acryl cement sets was toegestaan. Dit apparaat geeft ook goed zelfklevend acryl/glas lagen met minimale buigen van het glas-substraat. Problemen op dit gebied kunnen worden aangepakt door het verspreiden van de lijm tussen de acryl en glas lagen meer gelijkmatig of door het verminderen van de dikte van het microfluidic apparaat ter preventie van stress op de houder. Tot slot, de reservoirs in alle drie panelen tonen duidelijke randen, met geen luchtspleet aan de randen. Dit is een andere potentiële probleemgebied voor apparaat-substraat hechting die is uitgeschakeld door het gebruik van een apparaat schimmel met perfusie poorten gebouwd in.

Op microscopische schaal, worden weinig of geen, artefacten ingevoerd als gevolg van fase uitpakken congruente de brekingsindices van de microchannel en de cel-cultuur-media. Dit toont aan dat de massa van de cellen juist kan worden gekwantificeerd zelfs in de nabijheid van de muren van het kanaal (Figuur 3). Collectief, deze resultaten show, op beide macroscopische schaal en op microscopische schaal, de voordelen van het gebruik van een polymeer gefluoreerde aan de indices van breking tussen het materiaal van de fabricage van de microchannel waterige cel cultuur media.

Figure 1
Figuur 1 : MY133-V2000 zachte lithografie werkstroom. (A) na het vullen van de schimmel met MY133-V2000, de meniscus is gecomprimeerd met behulp van een glasplaatje maken een vlakke oppervlakte en gerookte in een UV oven. Merk op dat de hoogte van de negatieve van de stuwmeren vergelijkbaar met de hoogte van de mal is maken diepe reservoirs 3 mm in diameter. (B) na het snijden van de acryl, de acryl onderlaag is vastgelijmd aan een glas dekglaasje aan voorafgaand aan spin-coating met PDMS. De bovenste twee acryl lagen zijn gelamineerd samen met acryl cement. (C) de uitgeharde MY133-V2000 apparaat (kanaal kant naar boven) en het dekglaasje aan zijn oppervlak-behandeld door middel van O2 plasma. (D) ten slotte het apparaat is gemonteerd door het oppervlak-behandeld zijden van het apparaat en het dekglaasje aan elkaar vast te houden. De PDMS pakking wordt dan geplaatst op de top van de MY133-V2000-apparaat en de acryl is verbonden met acryl cement, met de gaten van zowel de PDMS pakking en de mid laag van de acryl voering met de reservoirs. Het gemonteerde apparaat wordt vervolgens met de hand geklemd gedurende 2 minuten totdat de acryl cement droogt. (E) een geëxplodeerde weergave voor het apparaat laat zien hoe het apparaat is gemonteerd. (F) A tekening toont de doorsnede door de microchannel van het afgewerkt apparaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Beelden van voltooide MY133-V2000 apparaten. (A) de randen van het MY133-V2000 apparaat zijn duidelijk zichtbaar in de lucht. (B) wanneer ondergedompeld in water, de randen van hetzelfde MY133-V2000 apparaat verdwijnen vanwege de nauwe wedstrijd in brekingsindices. (C) deze foto toont een afgewerkt apparaat met een acryl houder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Cel massa precies kan worden gekwantificeerd in de buurt van microchannel structuren. Metingen van de massa van de cel van vers geplaatste MCF7 cellen in de MY133-V2000 microchannel blijkt geen artefacten als gevolg van fase inwikkeling in de buurt van (A en B) de muur of (C) het midden van het kanaal. Deze artefacten worden vermeden in het MY133-V2000 kanaal vanwege de nauw gecompenseerde brekingsindices van het kanaal-materiaal en de cel-cultuur-media. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MY133-V2000 kan worden gebruikt als alternatief voor traditionele zachte lithografie fabricage materialen zoals PDMS. Vorige werk heeft aangetoond dat materialen met een hoge brekingsindex, zoals PDMS, aanzienlijke artefacten in de buurt van het kanaal muren als gevolg van de verschillen indices van breking tussen het materiaal van de fabricage en de waterige oplossing binnen het kanaal invoeren 13. MY133-V2000 kan overeenkomen met de brekingsindex van het microfluidic apparaat aan de waterige oplossingen gebruikte in biomedische toepassingen. Dit vermindert imaging artefacten bij het combineren van microfluidics met geavanceerde microscopie technieken, het verstrekken van een verschillend voordeel over traditionele microfluidic fabricage materialen. Het artefact reductie in microfluidic kanalen mogelijk gemaakt door dit systeem maakt het mogelijk fluorescentie en kwantitatieve fase microscopie (Figuur 3) signalen nauwkeuriger worden gekwantificeerd, zelfs in de directe nabijheid van microchannel structuren13.

Als een gefluoreerde polymeer vertoont MY133-V2000 doorgaans lage wrijvingscoëfficiënt tussen de structuur van dit kanaal en andere materialen, dus de invoering van een grote beperking in vergelijking met traditionele fabricatie materialen. Om te overwinnen deze uitdaging, zowel chemische oppervlaktebehandeling (O2 plasma) naast mechanische compressie gemaakt door knijpen het apparaat en de PDMS pakking tussen de ondergrond en een stuk van acryl worden gebruikt. De lagere elasticiteitsmodulus voor PDMS (vergeleken met MY133-V2000) is essentieel voor het overbrengen van mechanische kracht van het acryl aan het MY133-V2000 apparaat, omdat het vervormbare genoeg worden gecomprimeerd, zodat het op zijn plaats terwijl de microchannel houden Tegelijkertijd houden verzegeld tegen de ondergrond.

Twee belangrijke punten van mislukking kunnen worden ondervonden bij het fabriceren van microchannels met behulp van deze methode en moet worden opgemerkt wanneer probleemoplossing. Dit zijn de lekkage uit het reservoir als gevolg van overtollige slakken en lekkage vanuit het midden van het kanaal waar de kracht van mechanische compressie minimaal is. Zelfs een kleine hoeveelheid slakken van ponsen gaten voor de reservoirs wordt verhinderd dat het reservoir goed vast te houden aan het substraat. Voorkom lekken uit het reservoir en bevat de microchannel-negatieve kleine pijlers, 3 mm in diameter, met dezelfde hoogte als de schimmel, zodat de reservoirs kunnen worden uitgebracht als onderdeel van de microchannel zonder gebruik van een hulpprogramma om punch gaten voor de reservoirs. Ponsen gaten voor reservoirs nadat genezen slakken die moet worden weggewassen zonder beschadiging van het kanaal (Figuur 1A) heeft gemaakt. Dit is moeilijk te bereiken in de praktijk. Om te voorkomen dat lekken vanuit het midden van het kanaal, was het kritisch niet ter dekking van de reservoirs tijdens vergadering zodat de lucht om te ontsnappen aan onder het apparaat. Als de reservoirs zijn belemmerd wanneer het apparaat samen te lijmen, lucht onder het apparaat niet in staat is om te ontsnappen, creëren van een ruimte voor vloeistof te sijpelen uit het kanaal.

Dit protocol, presenteert daarom een methode ter verbetering van de hechting door zowel de oppervlaktebehandeling en de montage van het apparaat in de houder van een acryl, afzwakking van de negatieve gevolgen van fluorering op de adhesieve eigenschappen van het polymeer. De apparaten werden gevuld met vloeistof en tot 24u, waaruit blijkt dat het apparaat werken voor de duur van een typische imaging experiment blijft ge¨ uncubeerd. MY133-V2000, kan als een fabricage materiaal voor een microfluidic apparaat, worden gecombineerd met QPM voor het meten van de biomassa van de cel. Eerder, QPM heeft aangetoond dat het meten van de groei van levende cellen met een grotere precisie dan conventionele benaderingen17. Met behulp van QPM, kan een live-cel drugs antwoord worden gemeten met eencellige resolutie11,18,19. Wanneer gecombineerd met MY133-V2000, kunnen de cellen worden gekweekt in het kanaal voor ten minste 1 d, waardoor de groei van de cellen die moeten nauwkeurig worden bepaald. Combineren de voordelen van zowel de microfluidics en de QPM zorgt voor de meting van de groei en drug reacties van cellen onder gecontroleerde omstandigheden leven.

Toekomstige toepassingen van deze techniek omvatten integreren in meer geavanceerde microfluidic en kwantitatieve microscopie experimenten. De elasticiteit van de MY133-V200013 is compatibel met geavanceerde microfluidic technieken zoals pneumatische kleppen, verder inschakelen van de fabricage van complexe geometrieën en experimentele designs. De hier gepresenteerde resultaten tonen het gebruik van dit materiaal voor het maken van kwantitatieve metingen met behulp van QPM. MY133-V2000 moet ook verenigbaar zijn met andere kwantitatieve microscopie technieken, zoals Frster resonantie energie overdracht of fluorescentie levensduur microscopie. Deze benadering staat ook voor het apparaat worden gemonteerd op en verzegeld tegen een PDMS substraat, waardoor geavanceerde experimentele designs zoals inkapselen van fluorophores in het substraat. Over het algemeen vermindert MY133-V2000 artefacten bij het maken van kwantitatieve metingen in waterige oplossingen in microchannels, waardoor het een ideaal materiaal voor de fabricage van microfluidic kanalen voor het maken van hoge-precisie biomedische metingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Utah, Bureau van de ondervoorzitter voor onderzoek, alsook door middelen in combinatie met verlenen P30 CA042014 toegekend aan de jager Cancer Institute en op de CTR programma de jager Cancer Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MY133-V2000 MY Polymers MY133-V2000
Sylgard 184 Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fisher Premium microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
.118"(3.0mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet United States Plastic Corp 44290
.060"(1.5mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet United States Plastic Corp 44200
SCIGRIP 3 Very Fast Set Acrylic Cement United States Plastic Corp 45735
Standard Aluminum Foil (.6 mm thick) VWR 89107-726
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666
Insta-Cure+ Super Glue Bob Smith Industries BSI-109
1/8" PVC tubing McMaster Carr 5231K55
McCormick Food Coloring Target 13353207
X-Acto #1 Precision Knife X-Acto X3201
X-Acto #18 Heavyweight wood chiseling blade X-Acto X218
VWR Razor Blades VWR 55411-055
Surface Treated Cell Culture Dishes Fisher Scientific FBO12922
Fibronectin Human Plasma Sigma-Aldritch F0895-1MG
Trypsin-EDTA 10x Fisher Scientific 15-400-054
Corning Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific MT21030CM
Gibco Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-148
HyClone Nonessential Amino Acids 100x Fisher Scientific SH3023801
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-12
Corning DMEM with L-glutamine and glucose Fisher Scientific MT10013CV
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldritch 448931 Reacts violently with water
Ethanol, 200 proof Decon Labs Fisher Scientific 04-355-223
Acetone Fisher Scientific A18P-4
Bel-Art 42025 Plastic Dessicator Cole-Parmer EW-06514-30
Epilog Fusion Laser Cutter, 120 W Epilog Laser Epilog Fusion M2 32 Laser
Isotemp Stirring Hotplate Fisher Scientific SP88850200
Ateco 14111 1.5 inch stainless steel cutter Ateco 14111
Pyrex Glass Cell Culture Dish Fisher Scientific 08-747B
Radio Frequency Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G Used with Oxygen gas
Black Hole Laboratories Digivac Black Hole Laboratories Model 215
Intelli-Ray Ultraviolet Oven Uvitron UVO338
Compact Spin Coater MTI Corporation VTC-100A
Fisher Brand Isotemp Oven Fisher Scientific 15-103-0510 Forced Air Convection
Gilson Positive Displacement Pipette P1000 Fisher Scientific FD10006G
HeraCell VIOS 160i Fisher Scientific 13 998 212PM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zare, R. N., Kim, S. Microfluidic platforms for single-cell analysis. Annual Review Biomedical Engineering. 12, 187-201 (2010).
  2. Neuzi, P., Giselbrecht, S., Lange, K., Huang, T. J., Manz, A. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 11, (8), 620-632 (2012).
  3. Xu, W., et al. Cell stiffness is a biomarker of the metastatic potential of ovarian cancer cells. PLoS ONE. 7, (10), 46609 (2012).
  4. Karakas, H. E., et al. A microfluidic chip for screening individual cancer cells via eavesdropping on autophagy-inducing crosstalk in the stroma niche. Scientific Reports. 7, (1), 2050 (2017).
  5. DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The biology of cancer: metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation. Cell Metabolism. 7, (1), 11-20 (2008).
  6. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23, (1), 110-119 (2012).
  7. Kemper, B., et al. Monitoring of laser micromanipulated optically trapped cells by digital holographic microscopy. Journal of Biophotonics. 3, (7), 425-431 (2010).
  8. Barer, R. Interference micorscopy and mass determination. Nature. 169, (4296), 366-367 (1952).
  9. Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nature Methods. 11, (12), 1221-1228 (2014).
  10. Chun, J., et al. Rapidly quantifying drug sensitivity of dispersed and clumped breast cancer cells by mass profiling. Analyst. 137, (23), 5495-5498 (2012).
  11. Reed, J., et al. Live cell interferometry reveals cellular dynamism during force propagation. Acs Nano. 2, (5), 841-846 (2011).
  12. Eldridge, W. J., Steelman, Z. A., Loomis, B., Wax, A. Optical Phase Measurements of Disorder Strength Link Microstructure to Cell Stiffness. Biophysical Journal. 112, (4), 692-702 (2017).
  13. Kim, D. N. H., Kim, K. T., Kim, C., Teitell, M. A., Zangle, T. A. Soft lithography fabrication of index-matched microfluidic devices for reducing artifacts in fluorescence and quantitative phase imaging. Microfluidics and Nanofluidics. 22, (1), 11 (2018).
  14. Byron, M. L., Variano, E. A. Refractive-index-matched hydrogel materials for measuring flow-structure interactions. Experiments in Fluids. 54, (2), 6 (2013).
  15. Ogawa, T., Hanada, Y. Microfabrication of the UV transparent polymer CYTOP using a conventional pulsed green laser. Applied Physics a-Materials Science & Processing. 122, (3), 6 (2016).
  16. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16, (13), 2481-2486 (2016).
  17. Zangle, T. A., Burnes, D., Mathis, C., Witte, O. N., Teitell, M. A. Quantifying biomass changes of single CD8+ T cells during antigen specific cytotoxicity. PLoS One. 8, (7), 68916 (2013).
  18. Huang, D., et al. High Speed Live Cell Interferometry: A New Method for Rapidly Quantifying Tumor Drug Resistance and Heterogeneity. Analytical Chemistry. 90, (5), 3299-3306 (2018).
  19. Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS ONE. 9, (2), 89000 (2014).
Fabricage van refractieve-index-matched apparaten voor biomedische Microfluidics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Polanco, E. R., Western, N., Zangle, T. A. Fabrication of Refractive-index-matched Devices for Biomedical Microfluidics. J. Vis. Exp. (139), e58296, doi:10.3791/58296 (2018).More

Polanco, E. R., Western, N., Zangle, T. A. Fabrication of Refractive-index-matched Devices for Biomedical Microfluidics. J. Vis. Exp. (139), e58296, doi:10.3791/58296 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter